双抗体夹心ELISA定量检测IL-2-HSA融合蛋白

以抗人IL-2多克隆抗体为包被抗体,以IL-2-HSA融合蛋白为夹心抗原,以辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗HSA单克隆抗体为检测抗体,建立了一种定量测定完整的IL-2-HSA融合蛋白的双抗体夹心ELISA方法。包被抗体和检测抗体的最佳工作浓度分别为为2 μg/mL和0.5 μg/mL,方法的线性检测范围39.06~1250 ng/mL,标准曲线回归方程为y=0.442 9 x-1.143 3,r=0.996 6,灵敏度可达10.25 ng/mL,批内、批间变异系数分别为6.40%和7.81%,发酵上清液中回收率为98.13%~102.94 %,与IL-2、HSA基本无交叉反应,健全性分析表明发酵液及小鼠血清组分及稀释倍数对该方法无影响。该方法可用于该融合蛋白的发酵过程优化、分离纯化工艺、后期药动学、临床研究等的定量检测。     

IV胶原检测试剂盒性能评价

目的建立IV胶原磁微粒化学发光免疫检测方法。方法采用夹心法,IV包被抗体包被于顺磁微粒上作为固相抗原,样本中的抗原和磁微粒上的抗体特异性结合,再加入酶标抗体形成夹心复合物。结果本试剂盒的线性范围为50-1000ng/mL;空白限(LOB)为0.671ng/mL,检出限(LOD)为2.49ng/mL,功能灵敏度(FS)为4.8ng/mL;分析内精密度4.6%,天间精密度5.8%;总不精密度7.1%;样品的回收率在94.10～103.40%之间。与25种临床治疗药物对检测结果无干扰。结论建立的IV胶原磁微粒化学发光定量免疫分析方法灵敏度高、测定速度快、准确度高及特异性强,利于临床研究的开展,应用和推广前景巨大。     

白色念珠菌烯醇化酶抗原双抗体夹心法的建立及应用

目的 建立定量检测白色念珠菌烯醇化酶抗原的双抗体夹心法,为后续定量检测念珠菌性阴道炎患者阴道分泌物中的烯醇化酶抗原提供方法学基础。方法 用方阵滴定法确定最佳包被抗体浓度和最佳酶标二抗浓度,建立检测白色念珠菌烯醇化酶抗原的ELISA法,用该法检测白色念珠菌标准菌株SC5314培养上清中烯醇化酶抗原的浓度,初步探索应用于诊断外阴阴道念珠菌病。结果 最佳包被抗Eno单抗浓度为4.15μg/mL;酶标二抗HRP标记的抗烯醇化酶多抗最佳稀释倍数为1∶1 000。在第12小时时白色念珠菌培养上清中的烯醇化酶抗原开始检出,随着培养时间的延长,其上清中Eno抗原的浓度也随着逐渐增高,第48小时时达到峰值后趋于稳定。阴道分泌物上清中烯醇化酶抗原浓度随着真菌培养菌落计数的增加其浓度也在增加,有很好的相关性。结论 成功建立了定量检测白色念珠菌烯醇化酶抗原的双抗体夹心ELISA方法,可应用于评价念珠菌性阴道炎患者阴道分泌物中的烯醇化酶抗原的水平。     

基于开放式三明治酶联免疫分析的雌二醇检测方法的建立

目的:通过建立开放式三明治酶联免疫分析方法（OE-ELISA）,对雌二醇进行检测。方法:通过基因拼接构建质粒后在原核表达系统中制备小分子泛素相关修饰物蛋白-大肠杆菌麦芽糖结合蛋白-抗体轻链可变区（sumo-MBP-VL）和碱性磷酸酶-抗体重链可变区（ALP-VH）融合蛋白,并从产量和可溶性角度对两种蛋白的表达条件进行优化。将得到的两种蛋白纯化后分别作为包被抗体和酶标抗体,建立检测雌二醇的OE-ELISA方法。应用竞争ELISA和OE-ELISA测定不同浓度的雌二醇标准品,绘制标准曲线并计算两种方法的敏感性。结果:在质粒中加入sumo标签后,实现了sumo-MBP-VL融合蛋白的可溶性表达。在Rosetta 宿主菌中37℃诱导后得到大量的ALP-VH和sumo-MBP-VL融合蛋白。OE-ELISA测定雌二醇标准品的标准曲线为y=0.029 6x+1.302 9,r2=0.9961,敏感性为532 pg/mL,优于竞争ELISA 803 pg/mL的敏感性。结论:成功建立了检测雌二醇的OE-ELISA方法。     

双抗夹心ELISA法检测骨唾液酸蛋白的初步建立

目的 建立快速检测骨唾液酸蛋白的酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法,为试剂盒的研制奠定基础。方法 用鼠抗人骨唾液酸蛋白（BSP）单克隆抗体包被酶标板,兔抗人BSP检测,辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠二抗与兔抗人BSP相结合,初步建立BSP的双抗夹心ELISA检测方法。结果 自建双抗夹心ELISA法检测骨唾液酸蛋白的灵敏度为1.5ng/ml,标准曲线的线性范围为2-100ng/ml,回归方程y=0.2548x+0.0775 (r=0.992);批内批间变异系数分别为4.6％-5.4％和5.2％-7.1％,对人血清做50、25和10ng/ml三个加标浓度的回收率实验,回收率在47.2％-101％之间;4℃有效期至少360天。结论：成功建立双抗夹心ELISA检测BSP的方法。     

小鼠肝炎病毒N蛋白间接ELISA方法的建立

目的运用重组蛋白作为包被抗原建立检测小鼠肝炎病毒抗体的间接ELISA方法。方法将大肠杆菌表达小鼠肝炎病毒核衣壳蛋白（Nucleocapsid N）的主要抗原域NP（S）纯化后作为诊断抗原,通过条件优化,建立检测小鼠肝炎病毒抗体的间接ELISA方法。结果确定其包被抗原的浓度为300 ng/mL,血清稀释度为1∶200,山羊抗小鼠酶标抗体的稀释浓度为1∶3000。S/P≥0.386则为阳性,S/P〈0.308为阴性,两者之间为可疑。经阻断试验、交叉试验和重复性实验,表明该方法特异性强,重复性好。与国家实验动物检测中心的MHV全病毒ELISA抗体诊断试剂盒比较,特异性、敏感性和符合率分别为94.1%、93.3%和93.9%。用该融合蛋白包被聚苯乙烯板后在-20℃下可保存5个月,应用该方法检测了98份送检的血清样品,有10份检测为阳性。结论本研究建立的间接ELISA特异性强,重复性好,为进一步开发MHV血清抗体诊断试剂盒奠定了基础。     

胱抑素C的IgG-和IgY-ELISA检测体系的建立与评价

目的建立适用于检测人胱抑素C（Cystatin C）的IgG与IgY双抗体夹心ELISA检测体系。方法以人Cystatin C作为抗原免疫产蛋的罗曼鸡和新西兰兔,纯化抗Cystatin C的鸡抗体IgY和兔抗体IgG,并分别建立三种ELISA夹心检测体系,I：捕捉抗体IgG＋检测抗体IgY＋抗鸡IgY酶标抗体;Ⅱ：捕捉抗体IgG＋检测抗体IgY＋兔F（ab＇）2抗鸡酶标抗体;Ⅲ：捕捉抗体IgY＋检测抗体IgG＋抗兔IgG酶标抗体。通过比较Cystatin C的最低检测浓度和阴性对照的OD值评价三种夹心法的灵敏度和特异性。结果体系I的Cystatin C最低检测浓度为7.5ng/mL（阴性对照OD值为0.737）,体系Ⅱ的Cystatin C最低检测浓度为13ng/mL（阴性对照OD值为0.313）,体系Ⅲ的Cystatin C最低检测浓度为10ng/mL（阴性对照OD值为0.31）。结论成功建立了Cystatin C的双抗体夹心ELISA检测体系,体系I的灵敏度最高但其特异性差,体系Ⅱ和Ⅲ的检测灵敏度和特异性均较好,可以用于Cystatin C的检测。     

酶联免疫吸附试验检测人叶酸受体抗体IgM方法的建立及评价

目的 建立酶联免疫吸附试验(ELISA)检测人血浆叶酸受体抗体IgM的方法。方法 将从正常分娩健康产妇的胎盘中提取、纯化人叶酸受体蛋白稀释至5 ng/μl,作为抗原包被96孔板,以羊抗人IgM作为二抗,以健康人混合血浆作为标准品,浓度设定为1。采用ELISA检测人血浆叶酸受体抗体IgM水平,并评价该方法的灵敏度、精密度和稳定性。分别以人叶酸受体蛋白和牛源叶酸结合蛋白作为包被蛋白,检测24例健康新生儿母亲和20例神经管畸形患儿母亲的血浆标本叶酸受体抗体IgM水平,比较两种包被蛋白的检测结果。结果 ELISA方法可以检测的人血浆叶酸受体抗体IgM浓度为6.25×10-4~8.00×10-2,最低检测限为3.12×10-4。该方法检测高、中和低浓度血浆叶酸受体自身抗体IgM的批内差异分别为6.61%、3.50%和5.12%,批间差异分别为4.54%、5.49%和5.44%,此方法检测不同稀释倍数样品中叶酸受体自身抗体IgM浓度的测定值均在均数±10%范围内。人叶酸受体包被检测板测得的健康新生儿母亲(t=-11.9,P<0.001)及神经管畸形患儿母亲(t=7.35,P<0.001)的叶酸受体抗体IgM浓度均显著高于牛源叶酸结合蛋白包被检测板的测定值。结论 本研究成功建立了检测人血浆叶酸受体抗体IgM的ELISA方法,该方法以人叶酸受体蛋白作为包被蛋白,检测灵敏度高,精密度好,结果稳定。     

间接ELISA测定人血IgM型抗-A抗体方法的建立及应用

目的 建立间接酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测方法,快速定量检测人血IgM抗-A抗体.方法 通过制备A型红细胞膜蛋白作为捕获抗原,采用棋盘滴定实验筛选出最佳抗原抗体工作浓度,建立人血IgM型抗-A抗体定量检测方法.结果 所构建的间接ELISA定量检测方法检测下限为0.02 μg/mL;批内变异系数及批间变异系数均小于10％;通过ROC曲线分析,当临界D(450)为0.259时,ROC曲线下面积最大,为0.947,检测灵敏度为87.7％,特异性为100％.采用本研究自建的ELISA检测57例B型血浆标本的IgM型抗-A抗体浓度为(1.71±1.95) μg/mL,定量结果与经典半定量效价评分呈正相关(r =0.71,P＜0.01).结论 成功建立了人血IgM型抗-A抗体定量检测方法.     

间接ELISA检测蛔虫抗体方法的建立

目的 寻找能更准确地对蛔虫感染进行检测的方法。方法 以蛔虫虫卵可溶性蛋白为抗原,建立检测蛔虫特异性抗体的间接ELISA方法。结果 ELISA的最佳工作条件是：抗原包被浓度为1 μg/mL,血清最佳稀释度为1: 80,酶标二抗的最佳工作浓度为1: 8 000。对100份人血清样本采用本方法进行检测,其阳性检出率为10.0 %;血清样本对应粪便样本进行现场粪检虫卵法确定阳性率为2.0 %。结论 本研究建立了稳定而特异的抗蛔虫体IgG 的间接ELISA检测方法,可用于蛔虫感染的临床监测。     

抗赭曲霉毒素A单克隆抗体的制备及其ELISA检测方法的建立

目的制备抗赭曲霉毒素A（OA）的单克隆抗体（McAb）并对其进行初步鉴定,在此基础上建立竞争抑制酶联免疫吸附试验（ELISA）用于OA的检测。方法采用小剂量长周期的免疫方案,以OA 牛血清白蛋白（BSA）偶联物免疫雌性BALB/c小鼠,采用细胞融合法获得分泌抗OA的McAb的杂交瘤细胞株,用竞争抑制ELISA法进一步检测McAb的特异性,腹水诱生法大量制备McAb,以OA为竞争抗原,建立检测OA的竞争抑制ELISA。结果OA BSA免疫的BALB/c小鼠血清效价为1:512?000,与BSA有强烈的交叉反应。细胞融合后,ELISA筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞株,抗OA BSA的McAb与BSA的交叉反应率仅为3.5%,对分泌抗OA BSA特异的McAb的细胞株经3轮克隆化,抗体分泌阳性率达到100%,建立了1株能稳定分泌抗OA BSA McAb的杂交瘤细胞株,竞争抑制法进一步证明了该抗体是特异针对OA的,腹水诱生法制备了大量的McAb。竞争抑制ELISA线性范围为0.24～125?ng/mL,线性方程y=-0.113?2logx+0.901?6,相关系数r=0.98,最低检出浓度为0.24?ng/mL。样品的加标回收率为97.07%～107.83%。结论获得了分泌抗OA的McAb的杂交瘤细胞株,建立了OA检测的简单、灵敏、高效的ELISA检测方法。     

HPLC法测定关苍术超临界萃取物中atractylenoideⅠ和atractylenoideⅢ的含量

[目的]建立关苍术超临界萃取物中atractylenoideⅠ和atractylenoideⅢ的含量测定方法.[方法]色谱柱为C18柱,以甲醇-乙腈-水(59.5∶0.5∶40.0)为流动相,流动速度为1.0mL/min,检测波长为220nm,柱温为28℃.[结果]atractylenoideⅠ和atractylenoideⅢ分别在进样量为70～560ng(r=0.999 7)和39～390ng(r=0.999 9)范围内呈良好的线性关系,平均回收率分别为100.80%和101.52%;RSD值分别为4.95和5.75.[结论]HPLC法灵敏、准确、重现性好,可作为关苍术超临界萃取物中atractylenoideⅠ和atractylenoideⅢ的含量测定方法.     

HPLC法测定不同部位南方红豆杉中紫杉烷类化合物的含量

目的采用高效液相色谱法测定不同部位南方红豆杉中紫杉烷类化合物的含量。方法采用Hypersil BDS C18色谱柱（200mm×4．6mm,5μm）,测定紫杉醇时的流动相为甲醇-水（60：40）,测定10-DAB和巴卡亭Ⅲ时的流动相为甲醇-水（40：60）,流速1．0mL/min,检测波长为227nm,柱温为25℃。结果紫杉醇的线性范围为168～840ng,r=0．9994,平均回收率为96．86％,RSD为2．01％;10-DAB的线性范围为200～1000ng,r=0．9999。平均回收率为97．27％,RSD为1．73％;巴卡亭Ⅲ的线性范围为232～1160ng,r=0．9999,平均回收率为96．07％。RSD为1．42％。结论该方法可用于南方红豆杉中紫杉烷类化合物的含量测定。     

HPLC法测定全蝎中胆甾醇含量

目的：建立高效液相色谱法测定全蝎中胆甾醇的含量。方法：采用高效液相色谱法,色谱柱YWG-C18（4.6mm×150mm,5μm）;流动相：甲醇;检测波长：208nm;柱温：35℃;流速：1.0mL/min。结果：胆甾醇在0.102～0.510mg/mL范围内与峰面积值的线性关系良好（r=0.9996）,平均回收率为98.39%,RSD为1.95%（n=6）。结论：本方法简便可行,快速准确,可用于全蝎中胆甾醇的含量测定。     

可溶性FL酶联检测试剂盒的研制及其运用

目的建立灵敏、特异和稳定的人可溶性FL（sFL）酶联检测试剂盒,探讨其临床检测意义。方法采用鼠抗人FL单克隆抗体2D2为包被抗体,识别人FL不同位点的商品化多克隆抗体为检测抗体,建立双抗体夹心的人sFL酶联免疫检测方法（sFL-ELISA）。在此基础上,分别对不同血清样本中sFL的含量进行定量分析。结果成功研制人sFL酶联检测试剂盒,灵敏度为7.8pg/ml。该试剂盒4℃放置3个月,离散度（CV%）〈7.6%,加入rh-FL/Fc重组蛋白后的回收率在97%～110%。应用该试剂盒测得的健康供血员、再生障碍性贫血患者和白血病患者血清中sFL含量分别为（328.6±42.89）、（2607±286.8）、（1091±255.2）pg/ml。结论研制成灵敏、特异和稳定的人sFL酶联检测试剂盒,能对血清中sFL进行准确定量分析,具有良好的应用前景。     

RP-HPLC检测注射用脂溶性维生素（Ⅱ）中间品含量

目的：建立注射用脂溶性维生素（Ⅱ）中间品含量快速高效液相检测方法。方法：采用SemmetryRP-C18色谱柱（4.6mm×150mm,5μm）,流动相：甲醇-水（梯度洗脱）,流速：1.5ml/min,检测波长：265nm。结果：维生素A棕榈酸酯、维生素K1、维生素D2及维生素E浓度分别在0.144～0.216μg、0.240～0.360μg、8.000～12.000ng、14.560～21.840μg内呈良好的线性关系;平均回收率分别为99.74%（RSD=0.08%）,98.49%（RSD=0.23%）,99.83%（RSD=0.22%）,99.30%（RSD=0.23%）。结论：该方法简便、快捷、灵敏,能有效控制产品质量。     

酒龙胆中獐牙菜苦苷含量测定方法研究

目的：建立酒龙胆中獐牙菜苦苷的含量测定方法。方法：采用HPLC法进行测定,色谱柱为Agilent C18柱;流动相为甲醇-乙腈-0.025mol/L磷酸水（30：10：300）;检测波长为240nm;流速为1.0mL.min-1。结果：獐芽菜苦苷进样量在0.8224~4.112μg时呈良好的线性关系（r=0.9997）;加样回收率为96.8%,RSD为1.35%。结论：本法操作简便,分离效果良好。     

高效液相色谱法测定清热安神合剂中橙皮苷含量

目的:以橙皮苷为指标对清热安神合剂进行定量分析,建立清热安神合剂中橙皮苷含量的测定方法。方法:应用反相高效液相色谱法,C18色谱柱,以甲醇-水(35∶65)为流动相,在283 nm波长下测定清热安神合剂中橙皮苷含量。结果:在上述测定条件下,橙皮苷在64 ng～1 280 ng范围内线性关系良好。测定方法重复性良好,RSD=1.41%(n=6),清热安神合剂中橙皮苷的平均回收率为100.72%(n=5),RSD=1.28%。结论:该方法简便,准确,易操作,可作为清热安神合剂质量的控制方法。     

大观霉素酶联免疫吸附检测方法的建立

目的建立大观霉素直接竞争酶联免疫吸附（ELISA）分析方法。方法通过大观霉素与载体蛋白偶联,制备免疫原和检测抗原,用杂交瘤技术制备单克隆抗体（mAb）,鉴定mAb的特异性,并用于竞争ELISA检测。结果获得3株能稳定分泌抗大观霉素的单克隆抗体杂交瘤细胞株,大观霉素竞争ELISA检测的下限为1ng／mL。结论抗大观霉素的mAb具有抗原结合特异性,可用于大观霉素竞争ELISA免疫学检测。