柯萨奇病毒A组16型病毒株VP1基因序列测定及进化分析研究

目的　通过检测分析2015年杭州市柯萨奇病毒A组16型（CA16）病毒株VP1区核苷酸序列,掌握杭州市CA16的流行情况及种系进化关系,为手足口病的预防和治疗提供支持,同时为CA16疫苗株的选择提供依据。方法　收集2015年杭州市儿童医院256例临床资料齐全且临床诊断为手足口病患儿的粪便或咽拭子,利用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增CA16病毒株VP1区核苷酸序列（约1 020 bp）,测序后利用DNASTAR和Primer Premier 5.0进行序列比对分析,并用Mega 3.1软件建立检测样本VP1区序列与GenBank上CA16参考毒株VP1核苷酸序列的系统发育树。结果　共分离到80株CA16阳性病毒。序列比对分析结果显示,CA16分离株的核苷酸同源性为90.8%～100.0%,氨基酸同源性为99.5%～100.0%。系统发育树分析结果显示,17株CA16全部属于B1基因亚型,并且同时存在B1a和B1b两个进化分支,其中4株属于B1a亚型,13株属于B1b亚型。结论　2015年杭州市CA16病毒株属于B1基因亚型,与国内外某些地区手足口病病原学及分子进化研究结果一致,有望成为疫苗候选株作进一步研究。     

河南省柯萨奇病毒A组16型VP4基因特征分析

目的分析河南省手足口病标本分离柯萨奇病毒A组16型(coxsachievirus A 16,CVA16)VP4的基因特征,并比较VP4与VP1遗传进化分析的差异。方法对分离自河南省手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)患儿的8株CVA16,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行VP4区域扩增并对扩增产物进行测序,用分子生物学软件ATGC进行序列拼接,Bioedit比对剪齐,用MEGA 4.0软件进行同源性分析,并与已报道的CVA16标准株序列构建基因进化树。结果河南省8株毒株VP4核苷酸同源性为91.3%~98.1%、氨基酸同源性为100.0%,与国际原型株CA16/G10/RSA/1951(A型)比对,VP4核苷酸同源性为79.7%~82.6%,氨基酸同源性为100.0%;与B1a、B1b和B2型代表株核苷酸同源性分别为92.3%~95.7%、92.8%~98.6%、88.9%~91.8%,氨基酸同源性均为100.0%。河南省分离的CVA16毒株均属于B1亚型,有B1a和B1b两个进化支共同存在和循环,但VP4与VP1的进化树分型不完全一致。结论 VP4基因不能作为CVA16病毒基因亚型分型的依据。     

肠道病毒71型检测与VP1基因特征分析

目的 分析肠道病毒71型2011年本地流行株VP1基因特征学特征.方法 收集2011年本地手足口病患者临床标本332份,进行EV71荧光定量RT-PCR鉴定,采用RT-PCR对15株分离到的EV71进行VP1编码区基因扩增,并对扩增产物进行核苷酸序列测序和分析.根据VP1测序结果与国内外报道的各基因型和基因亚型EV71 VP1序列进行同源性和亲缘进化分析.结果 165份标本鉴定为EV71,分离株的VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别是97.5%～99.9%和99.4%～100%.与C4a亚型的核苷酸和氨基酸最高.亲缘进化树显示,本地株全部属于C4基因亚型的C4a进化分支.结论 本地区分离的EV71与近几年国内其他地区EV71分离株亲缘关系很近,有共同进化的趋势,属于C4基因亚型的C4a进化分支,并存在多个传播链.     

两株盖塔病毒全基因组序列测定与分子遗传进化

目的 对2011年和2017年分别在我国甘肃省和海南省分离的两株盖塔病毒（GS11-155和HNDZ1712-1）进行全基因组核苷酸序列测定,分析其与我国1964年首次分离的盖塔病毒（M1）的分子差异及分子遗传进化特征。方法 使用病毒基因扩增技术测定新分离的两株盖塔病毒全基因组核苷酸序列,建立盖塔病毒基因组数据集并使用生物信息学软件进行病毒分子特征及分子遗传进化分析等。结果 两株新分离盖塔病毒（GS11-155和HNDZ1712-1）基因组全长分别为11 690 nt和11 621 nt。两株病毒均具有甲病毒基因组结构特征。虽然两株病毒的结构基因、非结构基因以及非编码的连接区核苷酸序列长度均完全相同,但是病毒基因组5'和3'非编码区的核苷酸序列长度存在差异。两病毒株基因组3'UTR重复序列单元的结构未发生变化。病毒基因组同源性分析结果显示,海南省2017年分离的盖塔病毒（HNDZ1712-1）与我国于1964年首次在海南省蚊虫分离的盖塔病毒（M1）之间的核苷酸与氨基酸同源性分别为97.7%和98.1%。盖塔病毒全基因组核苷酸序列的分子遗传进化分析结果显示,本研究的两株病毒及其所属病毒株分别形成两个单独的进化簇,甘肃2011年进化簇和海南2017年进化簇,并与1964年海南首次分离的病毒形成完全独立的进化种群。结论 虽然HNDZ1712-1病毒同样分离自海南岛蚊虫标本,但是与1964年海南岛分离的病毒（M1）处在完全不同的进化分支,而与数千公里之外的甘肃省分离株（GS11-155）具有较近的进化关系,提示新分离的两株盖塔病毒与1964年分离的盖塔病毒存在较大分子遗传差异。     

银川市2016—2022年手足口病柯萨奇病毒A6型分离株VP1基因特征分析

目的 分析银川市2016—2022年引起手足口病的柯萨奇病毒A6型(CV-A6)VP1的基因特征,为手足口病的防治工作提供有效的参考依据。方法 收集2016—2022年银川市手足口病所有CV-A6核酸呈阳性的标本进行病毒分离培养,应用一步法聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增其VP1区完整基因核酸片段进行核苷酸序列测定,利用测序结果进行系统发育树构建、同源性分析及氨基酸突变位点分析。结果 2016—2022年银川市共分离到手足口病CV-A6型毒株90株,测序后成功获得CV-A6 VP1区全长序列的毒株83株。完整VP1区基因均由915个核苷酸组成,编码305个氨基酸。系统发育分析显示,2016—2022年银川市83株CV-A6分离株均属于D3基因亚型的D3a分支;同源性分析表明,银川市83株CV-A6分离株与原型株Gdula株(AY421764-USA-1949)之间核苷酸相似性为82.1%～84.1%,氨基酸相似性为76.2%～80.5%,遗传距离较远;银川市83株CV-A6分离株与原型株Gdula株的VP1区氨基酸序列比较发现32个氨基酸位点出现变异。结论 2016—2022年银川市...     

实验小鼠感染鼠诺如病毒的检测

目的了解实验小鼠鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)的携带情况及其基因特征。方法在广州某实验动物中心抽取两个种系的实验小鼠,采集其粪便标本,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测粪便标本的MNVORF2特异性基因(547bp,MNVnt5104～5650)。对阳性PCR产物进行测序并以测序结果构建基因进化树分析。结果共采集实验小鼠粪便标本20份,粪便来源的小鼠外表健康、活泼、进食正常,没有腹泻现象。MNV的阳性率为30.0%(6/20),阳性实验小鼠种类包括昆明小鼠(3/13)和NIH小鼠(3/7)。本研究检测的6个MNVs在进化树上独立一小分支,与参考株MNV2、3、4最为相近;核酸序列比较发现6个MNVs核酸序列的同源性最高,为98.3%～99.8%。结论该实验动物中心的小鼠存在较高的MNV携带状况,并可能在饲养设施内传播,有必要进一步探讨实验小鼠携带MNV的生物学意义。     

河南省2010年柯萨奇病毒A组16型VP1区基因特征分析

目的了解河南省2010年柯萨奇病毒A组16型(CA16)流行株VP1区基因特征。方法对河南省2010年手足口病(HFMD)粪便和咽拭子样品中分离到的10株CA16病毒,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行VP1编码区基因扩增,对扩增产物进行测序,利用生物信息学软件对序列分析,与已报道的CA16标准株序列构建基因亲缘关系树。结果 10株CA16毒株,其VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为90.9%~100.0%,99.3%~100.0%,与国际CA16标准株G10在VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为67.0%~69.0%,72.0%~74.0%。亲缘进化树显示全部CA16株可分为A和B两个基因型,B基因型又可分为B1和B2两个基因亚型。河南省分离的CA16毒株全部属于B1基因亚型,同时包含B1a和B1b两条进化分支在河南省共同流行。结论河南省手足口病感染CA16病毒的流行株属B1基因亚型,有B1a和B1b两个进化分支共同进化和循环。     

鼠诺如病毒的体外分离与鉴定

目的体外分离出小鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)毒株,并对其进行鉴定。方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法对小鼠进行MNV筛查,将检测出的MNV阳性小鼠的盲肠内容物经过处理接种至鼠源巨噬细胞系RAW264.7细胞,培养一段时间后用RT-PCR法扩增测序。结果成功通过传代RAW264.7细胞分离出MNV,并经过鉴定确认,对RT-PCR扩增序列进行初步分析,与韩国MNV4 S18株同源性最高,达99%。结论 MNV在体外的复制成功,为MNV的生物学特性、致病机制和诊断试剂等方面的研究提供了基础,同时作为人诺如病毒研究的理想模型,对人诺如病毒的研究也有重大意义。     

禽脑脊髓炎病毒VP3基因的克隆与序列测定

目的 对VP3进行克隆和测序，为禽脑脊髓炎病毒（AEV）的分子诊断以及更深一层次的分子和基因工程研究打下基础。方法利用RT-PCR技术，从AEVVR株感染的SPF鸡胚脑及内脏器官组织中提取病毒RNA并扩增出VP3目的基因，而后克隆到pMD18-T载体中，鉴定后进行序列测定。结果AEV VR株VP3基因全长735bp，共编码245个氨基酸，与AEV-1143标准毒株相应片段的核苷酸和氨基酸同源性分别为93％和97％；并将其与其他小RNA病毒进行了比较。结论本研究通过RT-PCR技术从体外成功扩增AEVVan-Roekel株VP3蛋白基因，并对其进行克隆、测序。     

一株柯萨奇病毒B组5 型(Cox.B5) 病毒的分离及VP1基因分析

目的研究2009年昆明市无菌性脑膜炎的病原柯萨奇B5(coxsackie virus B5,CVB5)分离株(KMA193-09)的VP1基因特征。方法采用RD细胞、Hep-2细胞对患者粪便标本进行病毒分离,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒VP1基因并进行序列测定,用Mega 4.0等软件分析处理。结果从无菌性脑膜炎患者粪便标本中,分离到CVB5,其VP1区的核苷酸长度均为831bp,未发现核苷酸插入与丢失。与浙江COXB5/ZHEJIANG/12/02(CFS)株、山东02336/SD/CHN/2002/CB5株及浙江COXB5/ZHEJIANG/13/02株氨基酸同源性最高为98.19%,与国外毒株的同源性为95.67%～97.83%。在进化树上与YZ081/SD/CHN/2005/CB5株显示在同一个分支上。结论分离的肠道病毒为柯萨奇病毒B组5型(CVB5),分离株(KMA193-09)VP1区变异较小。     

中国大陆EV71病毒分离株的分子流行病学研究

目的 了解1987-2010年中国大陆肠道病毒71型(EV71)分离株的分子流行病学特点及其种系进化、基因分型和遗传变异性.方法 从GenBank/NCBI上获得中国大陆来源的具有完整VP1或近似完整VP1基因的核苷酸序列信息的413株EV71毒株进行分析,采用MEGA 5.0软件,构建系统进化树,计算相同或不同基因型及基因亚型毒株的核苷酸与氨基酸的相似性.结果 1987-2010年,中国大陆20个省、市或地区均分离到具有完整VP1序列的毒株,且2008年以来数量陡增;中国大陆流行的主要是C型,只有2008年安徽和2009年湖北发现了A型;各基因型在43、58、142、164、167、184、240、249、292等氨基酸位点发生了特异性变异;从健康人体内分离的HQ129932毒株与其他序列比较,氨基酸无特异性变异.结论 C型株可能具有更强的传染力;氨基酸位点变异对于EV71病毒进化有重要意义;VP1基因与疾病的严重程度无明显关联;应加强C4a亚型疫苗候选疫苗株对其他基因型毒株的交叉保护作用研究.     

肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型分离株的VP1基因特征分析

目的:探讨苏皖地区手足口病(HFMD)患者肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CA16)分离株的VP1基因特征。方法:采集南京市、马鞍山市2009至2010年HFMD患者临床标本进行病毒分离和RT-PCR鉴定;扩增并测定VP1基因序列;从GenBank中选取EV71和CA16不同基因型参考毒株,利用生物信息学软件进行同源性比对和系统进化树分析。结果:共分离到9株EV71和4株CA16,EV71分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为96.5%～99.8%和99%～100%;CA16分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性为96.2%～98.5%和99.3%～100%;系统进化树分析显示,9株EV71全部属于C4a基因亚型,而4株CA16则全部属于B1b基因亚型。结论:2009至2010年苏皖地区分离到的EV71和CA16毒株分别属于C4a和B1b基因亚型,与国内其他地区HFMD病原学及分子进化研究结果一致,有望成为疫苗候选株作进一步研究。     

江苏省2012年柯萨奇病毒A组16型基因特征分析

目的:了解江苏省2012年柯萨奇病毒A组16型(CA16)分离株VP1区基因特征?方法:选取江苏省2012年14株CA16病毒分离株,用1对特异性引物进行VP1区核苷酸序列扩增,对扩增产物进行测序,利用生物信息学软件对序列进行分析,结果与CA16参考株序列进行同源性比较并构建基因进化树?结果:14株CA16分离株VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为90.5%~100.0%和98.7%~100.0%,与CA16国际标准株G10的核苷酸和氨基酸同源性分别为75.5%~76.7%和91.6%~92.3%?江苏省2012年的CA16分离株全部属于B1基因亚型,同时包含B1a 和B1b 两条进化分支?结论:江苏省2012年有CA16病毒的B1a与B1b两种进化分支共同存在与循环,且呈现以B1b基因亚型为优势型别?B1a基因亚型为辅助型别的传播模式;无论是优势型别还是辅助型别,均各自呈现密切的亲缘关系?     

上海地区小鼠诺瓦克病毒的检测分析及病毒分离

[摘要] 目的 了解上海地区实验小鼠自然感染小鼠诺瓦克病毒（Murine Norovirus,MNV）的状况,并分离毒株。方法 抽取委托检测单位送检的SPF小鼠319只,分别采集盲肠内容物及血液样本,应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法扩增小鼠盲肠内容物样本中MNV的特异性基因片段来检测MNV的感染情况,同时采用酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）与核酸检测方法进行对比。将RT-PCR扩增结果为阳性的盲肠内容物样本稀释并经0.22μm滤膜过滤,接种到RAW264.7细胞,盲传后采用RT-PCR方法鉴定。结果 RT-PCR检测的319份小鼠盲肠内容物样本中,阳性样本95份,阳性率为29.78%。对180份经RT-PCR检测的小鼠血清进行ELISA检测,阳性样本70份,阳性率为38.89%。RAW264.7细胞盲传5代后在72h内出现细胞病变,经RT-PCR鉴定,显示187bp的目的条带。结论 通过核酸检测方法和血清学方法证实上海地区实验小鼠存在MNV自然感染,且感染率较高,应加强实验小鼠的饲养管理。     

重庆地区2009年手足口病病原分离鉴定及病毒基因组特征

目的 对2009年重庆市手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD)患儿粪便标本的病原进行分离鉴定及全基因组序列测定,并同相关毒株序列进行同源性比对和进化分析,以了解新分离病毒基因组序列特征及可能的传播来源.方法 将47例手足口病患儿临床标本接种人横纹肌肉瘤细胞(human rhabdomyosarcoma,RD)进行分离培养,采用EV、EV71、Cox A16特异性引物对出现细胞病变的细胞上清进行PCR鉴定,同时电镜观察病毒颗粒形态,将鉴定的病毒基因组分为4个片段进行RT-PCR扩增,扩增产物纯化后进行PCR测序.通过末端重叠序列拼接成全长病毒基因组序列,利用生物信息学软件对序列进行比对分析,绘制进化树.结果 在47例HFMD患儿临床标本接种RD细胞培养中,有7份观察到明显的细胞病变,通过RT-PCR检测有3份呈EV特异性引物及EV71特异性引物阳性,而所有标本Cox A16特异性引物检测为阴性,EV71特异性引物的PCR产物测序结果证实为EV71病毒,同时用电镜观察形态病毒感染的RD细胞,为圆形无包膜病毒颗粒,证实所分离病毒为EV71.测序获得的3株EV71病毒基因组全长分别为7 409、7 406 nt和7 404 nt,其VP1氨基酸序列同源性达99%以上.Blast分析表明重庆毒株Chongqing-2-09-China(GQ994990.1)、Chongqing-3-09-China (GQ994991.1)均与安徽阜阳2008年分离的3株EV71毒株同源性较高,重庆毒株Chongqing1-09-China (GQ994989.1)与2005年台湾分离984 polyprotein、1235 polyprotein序列毒株同源性最高,进化分析表明属于C4基因亚型.结论 新分离的重庆EV71毒株基因组序列符合肠道病毒特征,与国内2008年安徽阜阳及台湾2005年分离的EV71病毒可能具有相同来源.     

禽脑脊髓炎病毒VP3基因的克隆与表达

目的对VP3进行克隆和测序后，在杆状病毒系统中表达获得重组蛋白，为AEV的分子诊断以及更深一层次的分子和基因工程研究打下基础。方法利用RT-PCR技术，从AEVVR株感染的SPF鸡胚脑及内脏器官组织中提取病毒RNA并扩增出VP3目的基因，而后克隆到pMD18-T载体中，鉴定后进行序列测定；应用Bae—to-Bac杆状病毒表达系统，将VP3基因定向克隆到pFastBacHTa donor质粒中，经转座反应，筛选到VP3-Bacmid重组子，转染Sf9昆虫细胞并盲传三代，提取DNA应用PCR方法鉴定证实获得含VP3的重组病毒，Western blot鉴定VP3在杆状病毒系统中得以表达。结果AEVVR株VP3基因全长735bp，共编码245个氨基酸，与AEV-1143标准毒株相应片段的核苷酸和氨基酸同源性分别为93％和97％；并将其与其它小RNA病毒进行了比较；Western blot鉴定结果，重组蛋白大小约27ku。结论本研究通过RT-PCR技术首次从体外成功扩增AEVVan—Roekel株VP3蛋白基因，并对其进行克隆、测序；应用Bac—to—Bac杆状病毒表达系统成功地表达了VP3基因并获得了具有良好免疫活性的重组蛋白。     

唐山市流行性腮腺炎病毒小疏水蛋白基因序列分析

目的 探讨唐山市流行性腮腺炎病毒的分子特征。方法 收集唐山市不同行政区的流行性腮腺炎患儿唾液标本5份，其中，爆发病例2例，散发病例3例。经RT-PCR扩增小疏水蛋白（SH）基因并测序，利用Clustal X软件进行系统发育分析。结果 唐山市分离的5株流行性腮腺炎病毒均为F亚型。各株病毒SH基因的核苷酸序列一致率为94．8％～100．0％，氨基酸序列一致率为91．4％～100.0％，但与国内主要野毒株SH基因的氨基酸序列一致率只有80．7％。系统发育分析显示，唐山市的各样本之间同源性较高．其次是国内的野毒株。而与国外野毒株及疫苗株同源性低。结论 唐山市存在多种流行性腮腺炎病毒株流行，主要基因型为F亚刑。     

我国人细小病毒B19VP1和VP2部分基因序列测定及变异分析

目的 探讨B19病毒中国株的基因变异。方法 采用长片段聚合酶链反应技术，从中国再障患儿血清中扩增HPVB19-XA2株的VP1独特区基因和VP1/VP2基因片段，进行核苷酸序列分析。结果 B19-XA2株的VP1独特区和VP1/VP2连接区基因大部分区域核苷酸序列被测定，其与国外Au株基因核苷酸序列比较，有4个核苷酸突变，并引起编码的2个氨基酸改变。结论 我国B19病毒VP1基因独特区和VP1/VP2连接区基因序列与Au株相比有变异。     

2007-2008年北京地区CAl6VPl区系统进化分析

目的 了解2007-2008年北京地区柯萨奇病毒A组16型(Coxsaekievirus A16,CA16)流行情况及其种系进化规律和基因分型.方法 收集北京地区2007-2008年133例手足13病病例临床标本,从中筛选CAl6毒株,扩增部分毒株VP1区并进行序列测定和分析.结果 共筛选得到39例45份CA16阳性标本,测定其中16株病毒的VP1区核苷酸序列.其同源性为91.43%～98.65%,氨基酸ILd源性为97.98%～100%.该16株病毒与GenBank中选取的24株CA16参考株的核苷酸同源性为78.13%～98.65%,氨基酸同源性为89.9%～100%.16株北京分离株中的9株与近年多数中国大陆分离株形成进化树上亲缘关系较近的一群,其余7株与我国台湾及周边国家的一系列分离株亲缘关系较近.结论 CA16为北京地区手足口病的主要致病原之一,本地区毒株同源性较高,同GenBank中24株CA16参比毒株序列进行系统进化分析显示其属于B基因群,16株北京分离株在系统进化树七有分别归属于两支的趋势.     

1株2019年云南省西双版纳流行登革热1型病毒全基因组序列分析

目的 了解2019年西双版纳暴发登革热主要流行血清型登革热1型病毒（Dengue virus-1, DENV-1）分子特征，为当地登革热流行的预防控制提供依据。方法 在C6/36细胞上对1株从2019年西双版纳发热患者血液中分离到的DENV-1病毒（JHS45）进行复壮，采用二代测序的方法对该株病毒进行测序，采用CLC Genomics workbench 8.0生物信息学软件对测序数据组装，使用Lasergene软件、MEGA6.1等进行序列比对、系统进化树构建及氨基酸位点分析。结果 JHS45株病毒在C6/36细胞上6 d出现细胞病变。测序组装后获得JHS45株病毒1条10 687个核苷酸（nt）长序列（GeneBank登录号：OR593353）。遗传进化分析结果 JHS45株病毒与我国2019年西双版纳、广州、河南、浙江流行的以及2013年泰国流行的DENV-1基因型Ⅰ病毒形成一个进化分枝，核苷酸同源性为97.6%～99.9%，氨基酸同源性为99.1%～100%；分析发现与2019年云南西双版纳（MW386863）和广州（MW261839）流行的DENV-1基因型Ⅰ病毒位于同一个...