TSG101-siRNA对肝癌耐药细胞株QGY/CDDP的逆转作用

目的 构建TSG101(tumor susceptibility gene101)小干扰RNA(TSG101-siRNA)的真核表达载体,观察RNA干扰沉默TSG101基因后化疗药物顺铂(CDDP)对肝癌耐药细胞株QGY/CDDP增殖的影响.方法 根据小干扰RNA的设计原则由计算机软件辅助设计TSG101的靶序列,应用DNA重组技术将目的序列克隆入小干扰RNA的表达载体;RT-PCR检测TSG101-siRNA对QGY/CDDP细胞tsg101mRNA表达的影响;Western blot检测TSG101-siRNA对TSG101基因表达蛋白的抑制效率;采用MTT法测定TSG101-siRNA联合化疗药物CDDP对QGY/CDDP的增殖抑制作用.结果 测序显示干扰载体构建成功,TSG101-siRNA能抑制tsg101 mRNA表达,使QGY/CDDP细胞TSG101蛋白的表达下降,抑制QGY/CDDP细胞的增殖,明显增强CDDP对QGY/CDDP的增殖抑制.结论 TSG101-siRNA的真核表达载体能有效地抑制QGY/CDDP细胞的增殖,提高化疗药物CDDP对QGY/CDDP的抑制率,能逆转肝癌耐药细胞株QGY/CDDP对CDDP的耐药性.     

奥沙利铂抗人结肠癌细胞株HT29增殖及其机制的研究

目的 观察抗肿瘤药物奥沙利铂对人结肠癌细胞株HT29体外增殖的影响,初步探讨其作用机制.方法 采用人结肠癌细胞株HT29作为研究对象,MTT法检测不同浓度和作用时间的奥沙利铂对细胞增殖的抑制作用;透射电镜观察细胞形态和超微结构的改变;流式细胞仪分析细胞周期的分布及凋亡的情况;免疫细胞化学法检测细胞周期蛋白及凋亡相关基因蛋白的表达.结果 奥沙利铂对HT29细胞的增殖有抑制作用而且呈剂量和时间依赖性.奥沙利铂作用72 h后,电镜可见凋亡细胞及凋亡小体;流式细胞仪检测发现细胞阻滞于G2/M期,G0/G1、S期细胞减少及出现凋亡峰;免疫细胞化学显示Bax和Fas表达增强,CyclinB1、Bcl-2、PCNA表达减弱.结论 奥沙利铂对HT29结肠癌细胞的增殖有抑制作用,其作用机制与细胞周期阻滞及诱导细胞凋亡有关.     

苯丁酸钠联合奥沙利铂对结肠癌细胞HT29的凋亡作用

目的:探讨苯丁酸钠(SPB)联合奥沙利铂(L-OHP)诱导HT29细胞的凋亡作用及其机制。方法:结肠癌HT29细胞分为空白对照组、奥沙利铂组、苯丁酸钠(1 mmoL/L)+奥沙利铂组、苯丁酸钠(2 mmoL/L)+奥沙利铂组,MTT法测定各组细胞存活率,流式细胞仪检测凋亡率;Western blot检测细胞中凋亡相关蛋白Caspase-3和核转录因子NK-κB的表达。结果:苯丁酸钠能降低奥沙利铂诱导的HT29细胞存活率,随着其浓度增高,细胞凋亡率逐渐升高(P<0.01),细胞中Caspase-3蛋白和NK-κB蛋白表达则逐渐降低(P<0.05),均呈浓度依赖性。结论:苯丁酸钠(SPB)联合奥沙利铂(L-OHP)可诱导HT29细胞凋亡,其机制可能与抑制Caspase-3和NK-κB信号传导通路有关。     

乌梅黄连复方对人结肠癌细胞HT29增殖和迁移的影响

目的观察乌梅黄连复方对人结肠癌细胞株HT29细胞增殖和迁移的影响。方法采用乌梅黄连复方对体外培养结肠癌细胞株HT29进行干预,MTT法检测复方对结肠癌细胞株增殖的影响,采用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期,划痕试验观察复方对结肠癌细胞迁移能力的影响,采用Real-time PCR测定药物干预后细胞cox-2mRNA表达。结果乌梅黄连复方对HT29细胞具有明显的抗增殖作用,IC50为(4.55±0.25)mg/mL;抑制TPA诱导的HT29细胞的迁移(P0.01);该复方能显著诱导HT29细胞凋亡,引起HT29细胞G2/M期阻滞,显著下调HT29细胞中cox-2mRNA的表达(P0.05)。结论乌梅黄连方可能通过诱导肿瘤细胞凋亡,引起肿瘤细胞G2/M期阻滞,抑制肿瘤细胞cox-2通路对人结肠癌HT29细胞增殖和迁移产生抑制作用。     

肿瘤干细胞在人结肠癌细胞株HT29耐奥沙利铂中的作用探讨

目的探讨肿瘤干细胞（cancer stem cell,CSC）在人结肠癌细胞株HT29对奥沙利铂（L-OHP）产生获得性耐药中的作用。方法采用浓度递增法诱导产生人结肠癌耐奥沙利铂细胞株HT29/L-OHP。采用As2O3逆转HT29/L-OHP的耐药性。采用MTT法检测As2O3逆转前后HT29/L-OHP的增殖能力和对L-OHP的敏感性。采用实时荧光定量PCR检测As2O3逆转前后HT29/L-OHP中Sox-2、miR-200c和let-7的表达。结果①在L-OHP（12μmol/L）的作用下,HT29/L-OHP的增殖能力显著高于HT29（P〈0.01）,但是同未经L-OHP作用的HT29相比差异无统计学意义（P〉0.05）。HT29和HT29/L-OHP对L-OHP的IC50分别为12.1μmol/L和138.4μmol/L,耐药指数为11.44。②0.20 mg/L的As2O3预处理后,降低了HT29/L-OHP对L-OHP的耐药性,逆转倍数为3.76,相对逆转效率为80.4%。③相对于HT29,HT29/L-OHP中Sox-2的表达显著增加[（0.072±0.038）比（0.019±0.010）]（P〈0.01）,而miR-200c和let-7的表达显著下降[（0.262±0.136）比（0.726±0.289）,（0.213±0.145）比（0.642±0.268）]（P〈0.05）。④As2O3处理后,相对于未处理前,HT29/L-OHP中Sox-2的表达显著降低[（0.032±0.012）比（0.072±0.038）]（P〈0.05）,而miR-200c和let-7的表达显著升高[分别为（0.367±0.256）比（0.262±0.136）,（0.3869±0.253）比（0.213±0.145）]（P〈0.05）。结论 CSC有可能是人结肠癌细胞株HT29产生L-OHP耐药的机制之一。     

细胞型朊蛋白对人结肠癌细胞株HT29细胞增殖及化疗敏感性的影响

目的探讨细胞型朊蛋白(cellular prion protein,PrPC)对人结肠癌细胞株HT29细胞增殖及化疗敏感性的影响,为结肠癌的临床诊治提供策略。方法构建滴度合格的PrPC干扰慢病毒LV582-1、LV582-2和LV582-3侵染结肠癌细胞株HT29,分别设置为干扰组1、干扰组2及干扰组3,阴性慢病毒侵染HT29作为对照组,采用qPCR和Western blot技术检测结肠癌细胞株中PrPC的表达,CCK8检测[顺铂处理组(干扰+顺铂处理组、对照+顺铂处理组),无顺铂处理组(干扰组、对照组)]细胞的增殖效率。结果 qPCR检测结果显示,干扰组3(PrPC mRNA为22.22±0.32)的干扰效率最高(为74.297%),提示LV582-3可有效抑制结肠癌细胞株PrPC mRNA的表达;Western blot结果显示干扰组3细胞中PrPC蛋白表达水平低于对照组(P<0.05);CCK8结果显示,干扰组与对照组细胞增殖效率差异无统计学意义(P>0.05),但顺铂处理组与无顺铂处理组相比较,前者明显不利于细胞增殖(P<0.01),且干扰+顺铂处理组与对照+顺铂处理组相比较,前者更加不利于细胞增殖(P<0.05)。结论下调PrPC表达对HT29细胞增殖无显著影响,但可以增加细胞对化疗药物顺铂的敏感性。     

下调TSG101基因对人结肠癌细胞LOVO生长的调节作用

目的:探讨TSG101基因对人结肠癌细胞生长的调节作用。方法:构建TSG101基因的小干扰RNA载体并将其转导入LOVO细胞,获得稳定转染的阳性克隆后,应用RT-PCR和western blot进行鉴定;MTT法和流式细胞仪检测细胞转染前后生长速度和细胞周期的变化;Western blot检测细胞转染前后细胞周期相关蛋白Cyclin D1、CDK4、CDK6、p21和p27的表达变化。结果:成功构建了TSG101的小干扰RNA载体;筛选到稳定的TSG101低表达的结肠癌细胞模型;转染TSG101小干扰RNA后的细胞生长速度显著减慢,出现G1期阻滞,且Cyclin D1的表达明显降低,p21的表达明显增高。结论:下调TSG101基因能抑制结肠癌细胞生长,提示该基因可能具有临床应用前景。     

苦参碱逆转人结肠癌细胞株（HT-29）奥沙利铂耐药性的作用及机制研究

目的：研究苦参碱对结肠癌耐药细胞HT-29/奥沙利铂(Oxaliplatin, OXA)耐药性的逆转作用并探讨其可能的作用机制。方法采用逐步增加药物浓度的方法建立奥沙利铂耐药结肠癌细胞株HT-29/OXA;CCK-8法测定苦参碱对HT-29/OXA细胞的耐药性逆转作用,流式细胞术检测细胞凋亡、周期变化;实时定量PCR 检测各组细胞肺耐药蛋白（lung resis-tance protein LRP)和 P-glycoprotein (P-gp) mRNA表达水平; Western blot 检测各组细胞LRP和P-gp蛋白的表达水平。结果苦参碱使HT-29/OXA细胞对奥沙利铂的敏感性增加,耐药性得到部分逆转。奥沙利铂(0.5μg/mL)和苦参碱(3.0μg/mL)单独用药对结肠癌耐药细胞株HT-29/OXA细胞周期以及细胞凋亡没有影响;联合用药对HT-29/OXA生长增殖具有明显抑制作用并且能够通过改变细胞周期引起凋亡（P<0.05）。奥沙利铂(0.5μg/mL)和苦参碱(3.0μg/mL)单独用药对HT-29/OX-ALRP和P-gp mRNA以及蛋白的表达没有影响;联合用药作用后LRP mRNA和P-gp mRNA表达水平降低（P<0.01）,同时下调了LRP和P-gp蛋白表达（P<0.01）。结论苦参碱部分逆转HT-29/OXA细胞对奥沙利铂的耐药性,其机制可能与细胞内LRP和P-gp表达降低有关。     

TSG101 siRNA表达载体的构建及其作用研究

目的构建TSG101（tumor susceptibility gene 101，TSG101）小于扰RNA（TSG101 siRNA）的真核表达载体并鉴定，初步研究其与胃癌多药耐药的相关性。方法根据小于扰RNA的设计原则由计算机软件辅助设计TSG101的靶序列，应用DNA重组技术将目的序列克隆入小干扰RNA的表达载体；将TSG101 siRNA的真核表达载体转染胃癌长春新碱（VCR）耐药细胞SGC7901／VCR，通过Western blot鉴定TSG101 siRNA的抑制效率；以MTT实验检测细胞生长曲线和对VCR、阿霉素（ADM）的药物敏感性。结果所构建的载体经酶切后释放出预期大小的片断并经测序证实；TSG101 siRNA真核表达载体瞬时转染胃癌耐药细胞SGC7901／VCR后，发现TSG101的表达被显著抑制；细胞生长减慢，且对VCR、ADR的敏感性增加。结论成功构建了TSG101 siRNA的真核表达载体，并初步提示其参与了胃癌的多药耐药，为下一步工作奠定了基础。     

RNA干扰MRP2表达逆转结肠癌细胞对长春新碱的耐药性

目的 构建MRP2基因的真核表达载体pGenSil-1-MRP2-siRNA,并观察其转染人结肠癌耐长春新碱细胞株HCT-8/V前后MRP2基因和ABCC2蛋白表达变化以及对化疗药物敏感性变化.方法 设计MRP2特异性siRNA的序列,克隆至pGenSil-1质粒中,测序鉴定后,用脂质体将重组质粒转染至HCT-8/V细胞中,用定量RT-PCR和Western blot检测MRP2的表达,MTT实验测定pGenSil-1-MRP2-siRNA和长春新碱对HCT-8/V细胞增殖抑制作用.结果 在结肠癌耐药细胞HCT-8/V中,RNAi明显抑制了MRP2 mRNA及蛋白的表达,在相同浓度化疗药物的作用下,RNA干扰组细胞凋亡比例显著高于对照组(P<0 01),表明细胞耐药性显著下降,对药物敏感性显著增高.结论 成功构建了MRP2的siRNA真核表达载体,并且对结肠癌耐药细胞MRP2的表达有明显抑制作用,取得良好的逆转耐药效果.     

人结肠癌耐药细胞系HT29/L-OHP的建立及其生物学特性

目的建立人结肠癌奥沙利铂耐药细胞系HT29／L-OHP，探讨结肠癌对奥沙利铂（Oxaliplatin，L-OHP）产生耐药的特征规律和耐药的机制。方法采用逐步递增L-OHP浓度，间歇作用体外诱导法培养建立了人结肠癌L-OHP耐药细胞模型HT29／L-OHP。MTT法测定生长曲线、交叉耐药性和耐药指数；并用光镜、电镜、流式细胞仪（FCM）等方法观察其一般生物学特性的改变。结果历时3个月建成了L-OHP耐药细胞模型HT29／L-OHP，其耐药性能稳定，耐药指数为10．64；并且与5-氟尿嘧啶、长春新碱、阿霉素等多种抗癌药有不同程度的交叉耐药性。HT29／L-OHP的细胞形态及染色体数目发生了改变；体外细胞群体倍增时间较亲代细胞延长29．71h；细胞周期分析结果显示其S期与G0／G1期细胞减少、G2／M期细胞增多。结论HT29／L-OHP细胞是模拟临床用药特点建立的耐药性较稳定的多药耐药细胞，具有耐药细胞的基本生物学特性，是研究L-OHP耐药机制及筛选逆转剂的理想细胞模型。     

小干扰RNA对人淀粉样前体蛋白基因的沉默作用

目的 观察小干扰RNA(siRNA)对人淀粉样前体蛋白(APP）基因的沉默作用，方法 该研究将设计好的一对寡核甘酸在细胞内源性地转录成小发夹RNA（shRNA)，同时构建了携带两个APP亚型的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的GFP-APP重组质粒。利用EGFP作为报告基因。在COS-7细胞内通过共转染siRNA表达质粒和GFP-APP的重组质粒来观察沉默效应。结果 针对APP的siRNA可有效地下调APP基因。结论 针对APP的siRNA将不仅在研究APP基因功能和深入研究阿尔茨海默病（AD）的病理分子机制上，而且在运用siRNA这种新型的反应核酸药物治疗AD方面扮演重要角色。     

鼻咽癌畸胎瘤细胞源性生长因子表达及siRNA对HNE-1细胞株增殖的抑制

目的探讨畸胎瘤细胞源性生长因子(PC cell-derived growth factor,PCDGF)在人鼻咽癌中的表达,研究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对鼻咽癌HNE-1细胞增殖的影响。方法采用免疫组织化学的方法检测34例鼻咽癌、20例鼻咽慢性炎症组织中PCDGF蛋白的表达情况。根据PCDGF基因设计合成2条siRNA,利用LipofectamineTM2000转染鼻咽癌HNE-1细胞。通过PT-PCR、Western blot、荧光免疫细胞化学法检测转染后细胞PCDGF mRNA和蛋白表达,采用MTT检测转染后细胞的生长增殖情况,FCM法检测细胞周期分布。结果 34例鼻咽癌组织中PCDGF阳性表达率为85.3%(29/34),20例鼻咽部慢性炎症组织中阳性率为15.0%(3/20),2组间差异有统计学意义(P<0.01)。2条重组质粒均能特异性的抑制PCDGF mRNA和蛋白的表达,其中siRNA-1的沉默效率最高。转染48 h后,HNE-1细胞中PCDGF mRNA和蛋白表达水平分别下调64.7%和69.8%,细胞增殖抑制率为(37.07±12.4)%,siRNA-1组G0/G1期细胞增多,S期细胞数量明显减少(P<0.05),细胞周期被阻滞于G1期。结论特异性siRNA能够有效沉默PCDGF基因表达,并显著抑制鼻咽癌HNE-1细胞增殖。     

siCASK重组载体构建及效应检测

目的　构建针对人CASK基因的siRNA质粒 ,建立CASK下调表达的细胞模型 ,为CASK相关的细胞信号研究奠定基础。方法　选择人CASK基因不同靶点 ,体外合成DNA模板 ,经退火后插入到pSilencer3 .1hygro载体的多克隆位点。阳性重组质粒转染ECV3 0 4细胞 ,蛋白印迹。观察siCASK对目的蛋白表达的抑制效率。结果　酶切、测序表明以pSi lencer3 .1hygro为载体的重组质粒siCASK构建成功。siCASK转染细胞后 ,能够明显抑制目的蛋白的表达。结论　成功构建了siRNA重组质粒 ,为下一步CASK功能研究奠定基础。     

核干细胞因子基因siRNA表达载体的构建及鉴定

目的 构建针对核干细胞因子(NS)基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体.方法 根据GenBartk提供的NS基因AY825265 mRNA序列及siRNA设计原则设计siRNA,筛选得到126-144 nt,199-217 nt和487-505 nt 3个19 bp片段为靶序列;合成带有BamHI、XhoI酶切位点的发夹结构寡核苷酸序列,经过退火,将此序列克隆至载体pRNAT-U6.1中构建重组表达载体;转化DH5α,提取质粒,应用PCR技术和测序方法鉴定重组克隆.转染入食管癌EC9706细胞,检测NS基因沉默情况.结果 PCR筛选得到3个目的片段的阳性重组克隆,测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致.RT-PCR和Western blot检测显示构建的siRNA表达载体可显著降低EC9706细胞中NS mRNA和蛋白水平的表达.结论 成功构建出一组针对NS基因的siRNA表达载体,为下一步NS基因的RNA干扰研究鉴定了基础.     

靶向Nrf2基因RNA干扰真核表达载体的构建

目的：利用pSUPER载体构建针对人核因子E2 p45相关因子2（Nrf2）基因的RNA干扰真核表达载体，为研究Nrf2基因在结肠癌化学预防中的作用奠定实验基础。方法：设计特异性针对Nrf2基因的寡核苷酸序列及相应的对照序列，构建重组载体pSUPER Nrf2转染人结肠癌HT 29细胞。同时转染pEGFP N1质粒，通过荧光显微镜观察及流式细胞仪检测绿色荧光监测转染效率，共转染pEGFP N1 48h后G418筛选稳定表达的细胞。RT PCR和Western blot检测瞬时及稳定转染细胞Nrf2基因的表达，观察稳定筛选出的细胞中UGT1A基因mRNA水平的表达变化。结果：成功构建RNA干扰真核表达载体pSUPER Nrf2。转染后24～96?h，荧光显微镜及FCM检测显示转染效率为30％～75％。瞬时转染pSUPER Nrf2 A2，pSUPER Nrf2 B2重组质粒Nrf2 mRNA的表达差异无显著性（P>0.05）；瞬时转染72?h及稳定转染后，pSUPER Nrf2 A1，pSUPER Nrf2 B1可显著抑制Nrf2基因的表达。RT PCR检测显示，稳定筛选出的细胞中UGT1A表达水平降低（P<0.05）。结论：成功构建了Nrf2的RNA干扰表达载体，筛选并获得低表达Nrf2基因的稳定克隆，筛选出的细胞UGT1A表达水平明显降低，表明Nrf2可能对UGT1A酶的表达具有调节作用。