甲型H1N1流感病毒致宿主细胞脱氧核糖核酸氧化损伤的研究

目的:通过检测DNA损伤标志物8-氧鸟嘌呤脱氧核苷(8-oxo-dG)在甲型H1N1型流感病毒感染MDCK细胞中的表达,初步探讨甲型H1N1型流感病毒诱导细胞凋亡的脱氧核糖核酸(DNA)损伤机制.方法:MDCK细胞培养后.甲型H1N1流感病毒感染继续培养0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h,细胞爬片免疫组织化学方法检测各时间点DNA损伤标志物8-oxo-dG的表达.结果:甲型H1N1流感病毒感染后各时间点实验组MDCK细胞8-oxo-dC的表达均显著高于相应的正常对照组(P<0.05),病毒感染各组间两两比较发现各组间差异显著.结论:甲型H1N1流感病毒感染能造成宿主细胞DNA氧化损伤.     

甲型H1N1流感病毒致宿主细胞氧化与凋亡之间的关系研究

目的:观察甲型H1N1流感病毒诱导的犬肺(MDCK)细胞氧化与凋亡之间的关系.方法:MDCK细胞培养后,甲型H1N1流感病毒感染Oh、1h、3h、6h、12h、24h、48h,在各时间点进行检测:采用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染料法检测细胞的凋亡率;丙二醛(MDA)法观察膜的氧化损伤程度.结果:(1)甲型H1N1流感病毒感染后0、1、3、6h组细胞凋亡率与正常对照组无显著性差异(P>0.05),感染后12、24、48h组的凋亡率显著高于正常对照组(P<0.01);(2)实验各组MDA含量随着感染时间的延长呈下降趋势,0、1、3、6、 12h时MDA含量显著高于正常对照组(P<0.01),而24、48h时与正常对照组无显著性差异(P>0.05):(3)MDA含量与凋亡率呈高度的负相关,回归分析进一步证明二者间的相关关系.结论:甲型H1N1流感病毒感染对细胞造成的氧化损伤是极早期事件,可能是细胞凋亡的重要凶素.     

MTH1基因表达的半定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立一个检测培养MDCK细胞内MutT同源蛋白1(MTH1)基因表达的半定量RT-PCR体系。方法细胞培养后提取总RNA,经优化RT-PCR反应检测细胞内MTH1基因的表达量。条带经ScionImmage软件分析并与内参基因GAPDH相比,对体系的准确性、重复性和灵敏度进行分析,然后运用本体系检测流感病毒感染后MDCK细胞内MTH1的表达。结果扩增产物经测序分析证实与GenBank中该细胞的MTH1基因序列一致;灵敏度检测发现最低可从50ng总RNA中检出目的基因的表达;重复性测定发现,MDCK细胞MTH1与GAPDH灰度值比值的均值为(2.02±0.09,n=10),CV值为4.31%。结论本方法的准确性、重复性和灵敏度均较好,可用于半定量检测培养细胞尤其是MDCK细胞内MTH1 mRNA表达量。     

中药药物性口罩的制备及其对流感病毒H1N1的抑制作用

目的:制备不同组方的中药药物性口罩,并评价其对流感病毒H1N1的抑制作用。方法:组方1(射干、甘草)与组方2(金银花、甘草)分别乙醇提取,以提取液浸泡纯棉脱脂纱布口罩2 h,分别制备1号、2号口罩,烘干备用。用制备药物性口罩的原液作用于流感病毒感染的犬肾细胞(MDCK),取细胞上清液进行血凝试验,比较各组细胞上清液的血凝效价,Real-time PCR法测定细胞内流感病毒血凝素(HA)基因的mRNA表达;将流感病毒H1N1液分别过滤药物性口罩,收集口罩滤液,检测滤液中流感病毒HA的效价。结果:组方1作用于流感病毒感染的MDCK细胞后,上清液的血凝效价由210降为26,组方2的血凝效价由210下降为25;与模型组比较,药物组细胞内流感病毒HA基因的mRNA表达量均明显减少(P0.05)。1号口罩过滤流感病毒H1N1液后,HA的效价由2-12下降为2-5,2号口罩过滤后的效价由2-12下降为2-6。结论:中药组方醇提液可有效抑制流感病毒在MDCK内RNA的复制;中药药物性口罩能够有效破坏流感病毒包膜上的血凝素,可有效阻断流感病毒的传染。     

2009年成都市流感活动情况及H3N2亚型流感病毒HA1基因特性分析

目的 分析2009年成都市流感流行情况,探讨甲3流感病毒(H3N2)亚型分离毒株的流行及HA1基因变异和进化.方法 MDCK细胞对咽拭子样品进行病毒分离鉴定,提取病毒核酸,用RT-PCR法扩增HA1基因,对H3N2分离株核酸及氨基酸序列进行亲缘关系分析.结果 甲型流感H1N1、H3N2、甲1、B型流感病毒分离率分别为2...     

Real-Time PCR与流感病毒分离关系研究

目的研究提高流感病毒分离率的方法。方法 Real-Time PCR检测500份流感监测病例,选择甲型流感H1N1、H3N2和乙型流感阳性及阴性样品各10份共计40份,分别接种MDCK细胞和鸡胚,用红血球凝集试验测定病毒滴度,以血凝抑制试验鉴定毒株型别。结果阳性样品中,MDCK细胞分离出季节性甲型流感H1N1型8份、H3N2型7份、乙型流感8份;鸡胚分离出季节性甲型流感H1N1型3份、H3N2型0份、乙型流感5份。阴性样品中,MDCK细胞分离出季节性甲型流感H1N1型3份、H3N2型3份;鸡胚分离出季节性甲型流感H1N1型2份、H3N2型0份。结论 MDCK细胞分离流感病毒时,Ct值已经在阴性范围之内的样品也应进行病毒分离,以提高病毒分离率;鸡胚分离流感病毒时,应选择MDCK细胞接毒一代且滴度达到1∶128的强毒株进行分离。     

22例甲型H1N1流感患者的护理

<正>甲型H1N1流感病毒基因中包含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片段,世界卫生组织(WHO)初始将此型流感称为"人感染猪流感",后将其重新命名为"甲型H1N1流感"。     

流感病毒在不同细胞中适宜培养条件的研究

目的 探索流感病毒在细胞中培养的适宜条件.方法 采用MEK细胞、FRhK-4细胞、MDCK细胞分别接种甲型流感病毒H1N1型、H3N2型和乙型流感病毒疫苗毒株,观察3种毒株在不同培养条件下的细胞病变、血凝滴度.结果 3株流感病毒接种细胞在33℃培养72 h后出现拉网、圆缩、脱落等现象;FRhK-4细胞和MDCK细胞对流感病毒较敏感.胞龄为48 h的细胞,在NaHCO3的终浓度为1.4%o,TPCK-胰酶浓度为1.0μg/ml的病毒维持液培养流感病毒为最适条件.结论 寻找到了细胞流感病毒的适宜条件.     

加味神术散雾化剂抗流感病毒的实验研究

目的探讨加味神术散雾化剂在体外对甲型H1N1流感病毒增殖的影响。方法以甲型H1N1流感病毒感染狗肾传代细胞（MDCK cell）为载体,观察加味神术散雾化剂不同药物浓度对流感病毒引起的细胞病变（CPE）的影响。采用Reed-Muench法计算流感病毒对MDCK细胞的半数细胞感染量(TCID50)。采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT）测定光密度（OD）值,计算不同药物对MDCK细胞的破坏率,通过Probit回归计算不同药物对MDCK细胞的最大无毒浓度（TC0）及半数中毒浓度(TC50)。计算不同药物对流感病毒增殖的抑制率,通过Probit回归计算半数抑制浓度(IC50)和治疗指数（TI）。结果甲型H1N1流感病毒对MDCK细胞的TCID50为10-8/0.1mL。加味神术散雾化剂对MDCK细胞的TC50为366.63μg/mL,TC0为31.25μg/mL;利巴韦林对MDCK细胞的TC50为109.85μg/mL,TC0为8.02μg/mL。加味神术散雾化剂对流感病毒直接抑制作用的IC50=9.79μg/mL,TI=37.45;对预防流感病毒感染的IC50=8.72μg/mL,TI=41.04;对治疗流感病毒感染的IC50=17.40μg/mL,TI=21.07。利巴韦林对预防流感病毒感染的IC50=84.30μg/mL,TI=1.30。结论加味神术散雾化剂可明显抑制甲型H1N1流感病毒在MDCK细胞中的增殖,具有抗甲型H1N1流感病毒作用。     

流感病毒对MDCK细胞核转录因子表达的影响

目的研究流感病毒刺激对体外培养的MDCK细胞核转录因子表达的影响，探讨流感病毒损伤细胞的分子学机制。方法体外培养获得MDCK细胞，分别用NF-κB免疫组化方法和TransAM P65试剂盒测定血凝滴度1：64的A型流感病毒H1N1和H3N2两种亚型、B型流感病毒、紫外线照射灭活的B型流感病毒NF-κB蛋白表达和活性的动态变化。以细胞激活剂佛波酯刺激后的MDCK细胞为阳性对照，以等量生理盐水为阴性对照。结果各组细胞加入不同的流感病毒后，与对照组相比，细胞免疫组化显示NF-κB随流感病毒作用相同时间后结果出现明显差异；各组相比，B型流感病毒作用72h对NF-κB的激活作用最明显，而A型两种亚型之间无显著差异。TransAM P65试剂盒测定也得出相同的结果。结论流感病毒可激活体外培养MDCK细胞的核转录因子，且这种作用随时间而增强。     

2009H1N1流感病毒神经氨酸酶基因克隆与表达

目的制备2009H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)重组蛋白,为建立H1N1快速检测方法和神经氨酸酶抑制剂筛选模型奠定基础。方法采用MDCK细胞方法分离2009H1N1流感病毒,提取病毒RNA,RT-PCR生成NA基因,构建原核表达载体PET-102/D-TOPO-NA,IPTG诱导表达重组蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳、WersternBlotting鉴定重组蛋白。结果成功分离2009H1N1流感病毒,NA蛋白119、152、275、292位氨基酸分别为Glu、Arg、His和Cys。SDS-PAGE凝胶电泳蛋白分子相对分子质量约为64000,与预期一致。WesternBlotting证实该蛋白具有神经氨酸酶抗原活性。结论 IPTG诱导原核表达神经氨酸蛋白的最适浓度为0.1mmol/L。实验得到的蛋白尚需进一步纯化。     

A(H1N1)甲型流感病毒基因多态性对病毒复制及毒力的影响研究

目的研究A(H1N1)甲型流感病毒基因多态性对病毒复制及毒力的影响。方法选择A/Californ ia/04/2009,A/S ichuan/1/2009和A/Be ijing/3/2009 3株病毒,分别感染MDCK细胞,测定病毒RNA载量和病毒效价;同时滴鼻接种BALB/c小鼠,检测小鼠感染后的多项指标,观察期为14天。另一方面,对3株病毒的全基因组进行测序及序列比对,对其基因突变情况及多态性进行分析。结果 A/S ichuan/1/2009株相较而言具有较高的复制能力及毒力,序列分析结果显示全基因中有5个氨基酸发生了突变,其中PA蛋白中343位点的A突变为T,PB1蛋白中353位点的K突变为R,566位点的T突变为A,PB2蛋白中471位点的T突变为M,对病毒毒力的增强起重要作用。结论 A(H1N1)甲型流感病毒基因组多态性与其复制及毒力密切相关。     

人流感病毒H1N1与禽流感病毒H5N1感染人神经胶质细胞的实验研究

目的：研究人流感病毒（H1N1）及禽流感病毒（H5N1）感染人神经胶质细胞后,促炎症因子的分泌特点。方法：分离培养人胶质细胞,用H1N1及H5N1分别感染刺激人胶质细胞;用RT-PCR技术探求白细胞介素（IL）-1β、-6和肿瘤坏死因子（TNF）-α变化。结果：与阴性对照比,H1N1和H5N1感染人神经胶质细胞IL-1β、-6和TNF-α的表达量均增高,且H5N1的表达量多于H1N1。结论：H1N1与H5N1可体外感染人神经胶质细胞,并诱导其分泌大量促炎症因子,提示此与流感病毒感染中枢神经系统所致的功能紊乱及免疫病理损伤有关。     

福州市甲型H1N1流感病毒血凝素基因遗传特性研究

目的探究福州市甲型H1N1流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因的遗传变异特点及种系进化分布,为研究甲型H1N1流感病毒进化、致病性和流行规律提供科学依据。方法采用MDCK细胞培养法和real-time PCR法进行流感病毒分离、鉴定。采用逆转录-聚合酶链反应扩增流感病毒血凝素基因,扩增产物经纯化后,进行血凝素基因HA区核苷酸序列测定并推导出其氨基酸序列,然后用DNASTAR MegAlign序列分析软件进行基因种系进化特性分析。结果福州市甲型H1N1流感病毒与参考株A/California/04/2009相比具有高度同源性,HA蛋白有4个位点氨基酸发生了替换,与猪流感代表株A/swine/Iowa/15/1930(H1N1)存在6个HA抗原决定簇位点变异。福州市甲型H1N1流感病毒株都有8个糖基化位点,其中6个位于HA1区,分离株HA蛋白不具有多碱基裂解位点,具有低致病性流感病毒特点。与美国流感病毒A/California/04/2009(H1N1)株共聚类为一个独立的小分支,进化关系最近,甲型H1N1流感病毒的HA源于古典型猪H1N1流感病毒,与A/swine/Iowa/1/1976(H1...     

Gene expression profiles comparison between 2009 pandemic and seasonal H1N1 influenza viruses in A549 cells

Objective To perform gene expression profiles comparison so that to identify and understand the potential differences in pathogenesis between the pandemic and seasonal A （H1N1） influenza viruses. Methods A549 cells were infected with A/California/07/09 （H1N1） and A/GuangdongBaoan/51/08 （H1N1） respectively at the same MOI of 2 and collected at 2, 4, 8, and 24 h post infection （p.i.）. Gene expression profiles of A549 cells were obtained using the 22 K Human Genome Oligo Array, and differentially expressed genes were analyzed at selected time points. Results Microarrays results indicated that both of the viruses suppressed host immune response related pathways including cytokine production while pandemic H1N1 virus displayed weaker suppression of host immune response than seasonal H1N1 virus. Observation on similar anti-apoptotic events such as activation of apoptosis inhibitor and down-regulation of key genes of apoptosis pathways in both infections showed that activities of promoting apoptosis were different in later stage of infection. Conclusion The immuno-suppression and anti-apoptosis events of pandemic H1N1 virus were similar to those seen by seasonal H1N1 virus. The pandemic H1N1 virus had an ability to inhibit biological pathways associated with cytokine responses, NK activation and macrophage recognition .     

MDCK、Vero和Hep-2细胞共培养分离甲型H1N1型流感病毒

目的用MDCK、Vero和Hep-2细胞共培养体系,分离甲型H1N1流感病毒,提高流感监测效率及缩短临床诊断周期。方法选取4株经国家流感中心复核鉴定、本实验室保存的甲型H1N1流感病毒,用病毒培养液1:2稀释后分别接种MDCK、Vero和Hep-2共培养细胞瓶和MDCK细胞瓶,每组设空白对照,用生理盐水代替接种。经35℃、5%CO2培养后记录甲型H1N1型流感病毒毒株在共培养细胞瓶和MDCK细胞瓶中的细胞病变效应(CPE)、血凝滴度和荧光定量PCR反应的CT值。结果培养后,2组接种流感病毒的细胞瓶均出现典型细胞病变,MDCK细胞瓶CPE略强于共培养细胞瓶,分离物-70℃冻融2次后检测血凝滴度,2组接种流感病毒的细胞瓶内分离物,血凝滴度均(1∶32;提取分离物核酸,荧光定量PCR检测,CT值均(20。结论用MD-CK、Vero和Hep-2细胞共培养体系可以分离流感病毒,同时还可分离鉴定其它呼吸道病毒。     

缺氧诱导因子1α（HIF1α）下调HepG2细胞中甘氨酸-N-甲基转移酶（GNMT）基因的表达

 【摘要】目的 探讨乏氧对甘氨酸-N-甲基转移酶(Glycine-N- methyltransferase,GNMT)表达的影响,以及GNMT与缺氧诱导因子1α (hypoxia inducible factor 1 alpha,HIF1α)表达之间的关系。方法 HepG2,293T,H460 3株细胞常规培养并设立常氧组和乏氧组,待细胞生长至50%~60%融合后,将乏氧组细胞放入1%氧气乏氧箱继续培养24 h,常氧组继续常规培养24 h后,运用半定量PCR,实时荧光定量PCR方法分析HepG2,293T,H460 3株细胞乏氧后相对于常氧GNMT基因的表达变化;通过小RNA干扰方法敲低HepG2细胞中HIF1α基因和HIF2A基因,运用实时荧光定量技术检测干扰效率,并检测GNMT基因的表达变化。结果 乏氧能够下调HepG2,293T,H460 3株细胞中GNMT基因的表达,HepG2细胞中抑制最明显;3株细胞的GNMT基因表达抑制率分别为68%,17%,21%;在HepG2细胞中敲低HIF1α基因能够引起GNMT表达明显上调,而敲低HIF2A后GNMT表达无明显变化。结论 在HepG2细胞中乏氧可能通过HIF1α下调GNMT的表达。     

MTH1基因的低表达对HeLa细胞内RNA氧化程度的影响

目的建立敲减MTH1基因的HeLa细胞稳定细胞株,研究MTH1基因的低表达对HeLa细胞内RNA氧化程度的影响。方法设计并合成针对MTH1基因的3条siRNA,分别转染HeLa细胞,选择干扰效果最为理想的靶序列连接入反转录病毒载体Retro-Q,在293T细胞内包装病毒颗粒,将病毒转染HeLa细胞后使用嘌呤霉素筛选抗性克隆株,用western b lot技术检测克隆株的MTH1的表达量以确定干扰效果最理想的稳定细胞株,用API5000型质谱仪检测稳定细胞株RNA中的8-oxoG与G的含量以评价RNA的氧化程度。结果本研究设计的3条siRNA中有2条干扰效率可达90%以上,所建立的敲减MTH1基因HeLa细胞稳定细胞株的干扰效果达80%以上,质谱检测结果表明MTH1基因低表达的稳定细胞株每106个G中含有14.9个8-oxoG,而对照细胞中则仅含9.7个8-oxoG。结论 MTH1基因的低表达可引起HeLa细胞中RNA氧化程度明显升高。     

甲型H1N1病毒感染BEAS-2B细胞差异蛋白的初步研究

目的通过建立2009H1N1流感病毒感染BEAS-2B（人支气管上皮细胞）细胞模型,探讨病毒感染细胞后细胞蛋白质差异变化,为2009H1N1流感病毒的致病机理研究奠定基础。方法 100 TCID50 2009H1N1（D、S、O）流感病毒感染BEAS-2B细胞12、24、48、72h后提取细胞总蛋白进行双向电泳,Image MasterTM 2D Platinum Software 7.0软件分析图像,对有差异的蛋白酶解,质谱分析鉴定差异蛋白。结果质谱共鉴定出包括蛋白酶体α5、巨噬细胞移动抑制因子（MIF）、前纤维蛋白1（profilin-1）、α-2干扰素等13个差异蛋白。结论 13个差异蛋白可能参与了2009H1N1流感病毒的致细胞病变过程。