MicroRNA-486 和TGF-β1 对人主动脉瓣膜 钙化的影响及其机制研究

目的 研究microRNA-486（miRNA-486）对人主动脉瓣膜间质细胞（VICs）钙化的影响及作 用机制。方法 体外培养VICs,经成骨诱导后用双荧光素报告基因检测miRNA-486 靶基因。转染miR-486 mimic、miR-486 Inhibitors 后,将细胞分为miR-486 mimic 组、miR-486 mimic NC 组、miR-486 Inhibitors 组、miR-486 Inhibitors NC 组。采用茜红素染色、ALP 试验分析各组钙化程度,实时荧光定量聚合酶链反应 （qRT-PCR）、免疫荧光试验检测miR-486 靶基因及成骨相关因子mRNA 和蛋白的表达水平。结果 双荧 光素报告基因检测和Western blot 检测结果显示,转录生长因子-β1（TGF -β 1）为潜在靶基因。茜红素染 色、ALP 试验结果显示,miR-486 mimic 组钙化程度高于miR-486 Inhibitors 组。qRT-PCR、免疫荧光试验 结果表明,miR-486 mimic 组TGF-β1、SMAD3 mRNA 和蛋白表达水平较低（P <0.05）;miR-486 mimic 组RUNX2、骨钙素mRNA 表达水平较miR-486 Inhibitors 组高（P <0.05）。结论 miR-486 可通过下调 TGF-β1 的表达,促进RUNX2、骨钙素的表达和活性,诱导间质细胞向成骨细胞分化。     

氧化型低密度脂蛋白对心脏瓣膜成肌纤维细胞的增殖及骨相关蛋白表达的影响

目的 通过观察猪主动脉瓣成肌纤维细胞在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)作用下时,细胞的增殖变化以及是否表达骨相关蛋白,探讨心脏瓣膜钙化的病理机制.方法 以原代培养的猪主动脉瓣成肌纤维细胞作为研究对象,用与心脏瓣膜钙化有关的病理因素ox-LDL处理细胞,将细胞随机分为4组:对照组(Ctrl)、氧化型低密度脂蛋白组(25μ g/ml ox-LDL)、氧化型低密度脂蛋白+阿托伐他汀组(25μg/ml ox-LDL+50 μg/ml Ator)、阿托伐他汀组(50μ g/ml Ator).采用流式细胞学技术测定各组细胞在24、48和72h的增殖变化,利用Westernblot和Real-time PCR检测72h各组细胞的α-平滑肌蛋白(α-SMA)活性以及骨形成蛋白2(BMP2)、碱性磷酸酶(ALP)的基因表达;了解细胞是否异常激活以及是否向成骨细胞样表型转化.结果 ox-LDL分别处理成肌纤维细胞24、48和72h后,细胞显示出时间依赖性的增殖加速(P＜0.05);ox-LDL能使成肌纤维细胞α-SMA的表达明显增加(P＜0.05)而成为活性细胞;骨相关蛋白BMP2、ALP的蛋白和mRNA在对照组和Ator组仅有低水平表达,而在ox-LDL组表达显著升高(P＜0.01);Ator对ox-LDL的这种病理性影响可以起到一定的抑制作用(P＜0.05).结论 ox-LDL促使心脏瓣膜成肌纤维细胞激活、分化、增殖以及向成骨细胞样表型转化,进而导致心脏瓣膜的钙化.阿托伐他汀可能通过阻遏成肌纤维细胞的增殖起到对心脏瓣膜钙化的防治作用.     

钙化性主动脉瓣疾病瓣膜间质细胞的生物学特征分析

目的初步分析钙化性主动脉瓣疾病(calcific aortic valve disease,CAVD)瓣膜间质细胞的生物学特征,为后续研究奠定基础。方法采用组织块接种和免疫磁珠法分选正常主动脉瓣和CAVD瓣膜间质细胞,观察其形态学和行为学特征。通过免疫细胞化学染色和流式细胞术分析CAVD瓣膜间质细胞免疫表型的改变。结果与正常主动脉瓣瓣膜间质细胞相比,CAVD瓣膜间质细胞呈肌纤维母细胞和成骨细胞形态,当细胞达到一定密度后细胞自发性收缩、聚集样生长并形成钙化结节。体外培养的CAVD瓣膜间质细胞表达肌纤维母细胞标志物α-SMA和成骨细胞标志物碱性磷酸酶(ALP)。结论 CAVD瓣膜间质细胞生物学特征的改变可能是导致主动脉瓣增厚、钙化和交界融合的重要因素。     

丹蛭降糖胶囊调控β-catenin蛋白在高磷诱导的糖尿病大鼠下肢血管内皮细胞钙化中的作用

[目的] 探讨丹蛭降糖胶囊调控β-链蛋白（β-catenin蛋白）在高磷诱导的糖尿病大鼠下肢血管内皮细胞钙化中的作用。[方法] 分离糖尿病大鼠和健康大鼠下肢股动脉内皮细胞进行体外培养,分为空白组、高磷组、丹蛭组、氯化锂（LiCL）组;调整稳转内皮细胞（EC细胞）状态,除空白组外,其余各组加入高磷培养基（含有10 mmol/L β-甘油磷酸盐、50 mg/mL维生素C和1×10^-7 mol/L胰岛素）诱导细胞钙化,同时丹蛭组和LiCL组给予10%含药血清（丹蛭降糖胶囊）干预,48 h后LiCL组给予20 mmol/L LiCl继续干预48 h。采用DNA断裂的原位末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡,噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、β-catenin、碱性磷酸酶（ALP）、骨桥蛋白（OPN）、骨形态发生蛋白2（BMP2）、卷曲同源物1（FZD1）mRNA表达水平;激光共聚焦显微镜观察细胞β-catenin蛋白定位。[结果] 与空白组比较,高磷组细胞凋亡数、钙离子含量、α-SMA、β-catenin、ALP、OPN、BMP2及FZD1表达量增多,细胞增殖数量减少（P＜0.01）;激光共聚焦显微镜观察结果表明β-catenin多表达于细胞核内。与高磷组比较,丹蛭组细胞凋亡数、钙离子含量、α-SMA、β-catenin、ALP、OPN、BMP2及FZD1表达量减少,细胞增殖数量增多（P＜0.01）,激光共聚焦显微镜下观察显示细胞核内β-catenin表达量减少。与丹蛭组比较,LiCL组细胞凋亡数、钙离子含量、α-SMA、β-catenin、ALP、OPN、BMP2及FZD1表达增加,细胞增殖数量减少（P＜0.01）,激光共聚焦显微镜下观察显示细胞核内β-catenin表达量增加。[结论] 丹蛭降糖胶囊可以减轻糖尿病大鼠下肢内皮细胞钙化,机制是通过下调β-catenin在细胞核内的表达,减少β-catenin蛋白合成,抑制下游细胞表型基因的转录,达到防治内皮细胞血管钙化的目的。     

Rho／Rock 信号通路在 TGF －β1刺激大鼠颈内动脉平滑肌细胞表型转化中的作用及可能机制

目的：探讨Rho／Rock信号通路在TGF－β1刺激大鼠颈内动脉平滑肌细胞（ ISMC）表型转化中的作用及可能机制。方法 ISMC随机分为两组：空白对照组和TGF－β1刺激组,以不同浓度（1、5、10、20、50 ng／mL） TGF－β1刺激细胞24 h,用荧光实时定量PCR法检测转凝蛋白（ SM22α）和骨桥蛋白（ OPN） mRNA的表达;再以上述得出的最佳TGF－β1浓度刺激细胞,在不同时间（6、12、24、48 h）收集细胞,采用同样方法检测SM22α、OPN mRNA的表达水平;经无血清DMEM高糖培养基静止培养24 h后,随机分为以下各组：空白对照组、TGF－β1（10 ng／mL）刺激组及TGF－β1（10 ng／mL）＋法舒地尔（Fasudil）（10、30、50μmol／L）组,分别采用FQ－RT－PCR法检测SM22α、OPN、RhoA、Rock－1 mRNA的表达;Western blot法检测SM22α、OPN蛋白表达水平;根据实验结果用透射电镜观察各组细胞超微结构的相应变化。结果10 ng／mL TGF－β1刺激大鼠ISMCs 24 h达顶峰。 TGF－β1＋Fasudil组SM22αmRNA和蛋白表达水平较TGF－β1刺激组高（P＜0．01）,且在Fasudil浓度为30μmol／L时达到高峰,随后下降;TGF－β1＋Fasudil组OPN mRNA表达水平较TGF－β1刺激组低,呈浓度依赖性,至30μmol／L达最低（ P＜0．05）,后又呈上升趋势。 Western blot结果显示TGF－β1＋Fasudil组的OPN蛋白表达水平较TGF－β1刺激组低,至Fasudil浓度为30μmol／L达最低（ P＜0．05）。同时FQ－RT－PCR结果显示TGF－β1刺激组的RhoA和Rock－1 mRNA表达水平较空白对照组高（P＜0．01）,在Fasudil浓度为30μmol／L时TGF－β1＋Fasudil组的RhoA和Rock－1mRNA表达水平较TGF－β1刺激组低（ P＜0．05）。电镜下观察各组细胞显示,空白对照组（×20000） ISMC高尔基体肥大,线粒体及粗面内质网正常,10 ng／mL TGF－β1刺激后细胞内线粒体增多,在上述基础上加入30μmol／L Fasudil后电镜下观察细胞又回到正常成熟结构状态。结论10 ng／mL TGF－β1刺激大鼠ISMC 24 h可成功刺激其表型转化,且该过程可能通过Rho／Rock信号通路实现;Rho／Rock信号通路抑制剂Fasudil可增加TGF－β1刺激的SM22α的表达,下调OPN的表达水平,抑制大鼠ISMCs表型转化。     

缺氧对SD大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化的影响

[目的]研究缺氧对阴茎海绵体平滑肌细胞(cavernosum smooth muscle cel s ,CCSM）表型转化的影响。[方法]用酶消化法获取SD大鼠的原代CCSM,并用细胞免疫荧光法进行鉴定。将原代CCSM置于缺氧小室中（37℃,5%CO2,1%O2,94%N2）培养,按缺氧时间分为0h组、24h组、48h组、72h组,用western-blot法检测四组的α-SMA、OPN蛋白表达量。[结果]低氧可以诱导CCSMα-SMA蛋白表达下降,且在72h内随着缺氧时间延长差异显著性增加。低氧24h组细胞OPN蛋白表达增加（P<0.05）;低氧48h组细胞OPN蛋白表达显著增加（P<0.01）;48h后随着时间延长差异可能会减小（P>0.05）。[结论]缺氧可以诱导CCSM由收缩型向合成型转化。     

机械牵张引起高张应变刺激小鼠血管平滑肌细胞钙化形成

目的探索机械牵张(mechanical stretch, MS)引起的高张应变对血管平滑肌细胞钙化的影响。方法选用小鼠主动脉平滑肌细胞MOVAS,应用定制的硅胶板牵张器,牵张20%幅度的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs）作为实验组,模拟高血压下的高张应变环境;将不进行牵张的VSMCs作为对照组。使用荧光定量PCR和Western印迹法检测细胞α-SMA、Runx2基因和蛋白的表达,荧光定量PCR检测骨钙素(osteocalcin）、骨桥蛋白（osteopontin）的表达,使用邻甲酚酞络合酮比色法定量检测两组细胞钙化沉积,使用对硝基苯磷酸盐法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性。结果在细胞维持贴壁生长的72h以内,随着牵张时间的增加,血管平滑肌细胞的α-SMA表达下降,Runx2、osteocalcin、osteopontin表达水平增加,钙化沉积和ALP活性增加。结论牵张后的高张应变可以诱导血管平滑肌细胞钙化形成。     

高糖刺激血管平滑肌细胞表达cbfα-1和OC的实验研究

目的 研究高糖在刺激大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)转分化过程中对相关骨基质蛋白如核心结合因子α-1(cbfα-1)和骨钙索(OC)表达的影响,并探讨高糖在诱导血管钙化发生过程中可能的作用机制.方法 原代培养VSMC,分为正常糖浓度组(5 mmol/L D-葡萄塘)、高糖组(25 mmol/L D-葡萄糖)和甘露醇组(5mmol/L D-葡萄糖+25 mmol/L甘露醇),在不同时间点检测各组VSMC的钙沉积指标;茜素红染色了解各组VSMC钙化程度;实时荧光定量PCR法和免疫印迹法检测各组cbfα-1和OC的mRMA水平和蛋白表达变化;碱性磷酸酶活性检测试剂盒检测碱性磷酸酶(ALP)的活性.免疫组化检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)水平.结果 与正常糖浓度和甘露醇对照组相比较,高糖组VSMC钙沉积和钙化染色均明显增强,cbfα-1和OC的mRNA和蛋白表达均升高(P<0.05),α-SMA蛋白表达下降(P<0.05),均呈时间依赖性.高糖刺激后VSMC的ALP的活性比对照组增加了近2倍.结论 高糖介导的平滑肌细胞钙化可能与高糖促进VSMC分泌骨基质蛋白cbfα-1和OC水平增加有关;高糖在促进VSMC钙化同时,使VSMC的α-SMA表达水平降低,促进其向成骨样细胞转分化.     

尿毒症患者动脉中膜钙化的病理研究

目的研究尿毒症患者动脉中膜钙化的特点,并探讨血管钙化与骨基质蛋白的关系。方法43例尿毒症患者在行动静脉内瘘手术时取桡动脉0.5-1.0cm,应用茜素红染色观察血管钙化情况,应用免疫组化方法观察血管中膜骨桥蛋白（OPN）、Ⅰ型胶原（ColⅠ）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达情况。结果43例桡动脉标本中有10例发生程度不同的中膜钙化,钙化率为23.3%;钙化的10例桡动脉中膜平滑肌细胞胞浆均有OPN、ColⅠ阳性表达,没有明显钙化的动脉中仍有51.5%至少存在一种骨基质蛋白的阳性表达,钙化组OPN、ColⅠ阳性表达均明显高于无钙化组,差异有显著性意义（P〈0.01）;而α-SMA在钙化组表达明显减弱,与无钙化组间差异有显著性意义（P〈0.01）。结论尿毒症患者血管中膜可出现明显钙化,OPN、ColⅠ的表达可能是血管钙化的早期标志,血管中膜钙化类似骨的矿化,细胞介导的主动过程可能参与了血管的钙化。