体外培养新生大鼠海马神经元突起的形态学

目的研究体外培养过程中，神经元的形态学。方法用扫描电镜观察体外培养的新生大鼠海马神经元在体外发育过程中，神经突起的形态学。结果培养海马神经元呈现梭形、三角形、锥体形等多种形态；神经突起随着培养时间延长，逐渐出现长度增加，突起分支增多；扫描电镜下，突起上显示串珠样膨大的膨体样结构，垂直分出呈鼓槌状的树突棘，突起来梢有矛头样和泪滴状生长锥，并见突起之间有连接存在。结论体外培养的海马神经元，在形态学上经历了与在体相似的变化，并且具有执行神经元功能的基本形态学基础。     

SD大鼠海马神经元原代培养及形态学观察

目的：掌握SD大鼠海马神经元体外培养方法,观察神经元形态学特点,测定细胞生长曲线。方法：新生SD乳鼠,剥离海马,胰酶消化,接种,1 d换为Neurobasal培养基;小鼠抗大鼠微管相关蛋白-2、兔抗鼠神经元特异性烯醇化酶为一抗,免疫细胞化学法计数阳性细胞百分率并显微摄影;1%甲苯胺蓝、苏木精伊红染色。结果：原代培养神经元6~8 h内开始贴壁,培养5~7 d突起增粗增长,连接成网,以多极神经元为主,胞体呈三角形、梭形、椭圆形;MAP-2、NSE染色为棕褐色,经鉴定神经元纯度达90%左右;细胞经历生长潜伏期,对数生长期,平台期;细胞核大而圆,HE染色胞核深蓝色,胞浆红色,胞体中可见尼氏颗粒。结论：相差显微镜下神经元形态多样,MAP-2、NSE染色阳性细胞,HE染色细胞核呈深蓝色,胞浆为红色,尼氏体位于细胞质内,神经突起内少见。     

新生大鼠海马神经元的原代培养与鉴定

目的:探讨建立简便高效的大鼠海马神经元原代培养的纯化方法。方法:(1)离体培养新生24 h内SD乳鼠海马神经元,每天在倒置相差显微镜下进行神经元的形态学观察;(2)MTT法检测培养不同时间段神经元的活力变化,并绘制生长曲线;(3)纯化培养9 d神经元利用免疫荧光染色法检测β-微管蛋白Ⅲ(β-tublinⅢ)的表达率。结果:(1)倒置相差显微镜下观察原代培养的海马神经元,刚分离种植时可见神经细胞为圆形,24 h大多数细胞贴壁,3 d细胞突起增大、增粗,培养5~7 d神经元胞体丰满,突起交织成的网络更密集,培养14~16 d后,神经元开始退化;(2)生长曲线结果发现海马神经元体外培养经历了4个时期,即生长潜伏期、对数生长期、平台期、生长停滞期;(3)经β-tublinⅢ鉴定海马神经元纯度为(93.0%±2.5%)。结论:本实验方法步骤简便,可获得纯度较高的海马神经元,为研究与海马神经元相关的疾病提供了实验基础。     

体外下丘脑神经细胞培养技术探讨

目的探讨体外下丘脑神经细胞培养的技术。方法选用生后1～3d的SD大鼠,取下丘脑组织进行单细胞原代培养。结果培养1d,神经元胞体小,圆形或梭形,无突起或突起极短;培养3d时,胞体明显增大,突起长度增加;到培养7d,神经元的胞体截面积和突起长度均达到最高峰,分别为161.63±21.17μm2和103.51±21.33μm;到14d时,神经元的胞体截面积和突起长度基本维持在7d时的水平。结论培养前7d是下丘脑神经元体外生长成熟的关键时期,这种良好的发育状态可维持到14d。体外下丘脑神经细胞培养技术的关键在于准确的取材部位,良好的单细胞悬液的制备,尤其是贴壁物的选择。     

体外培养新生大鼠海马神经元的图象分析

目的：研究体外培养海马神经元不同时期的形态学变化。方法：用图象分析方法，研究体外培养的新生Wistar大鼠海马神经元在不同时间的形态、细胞数密度、面数密度、长度密度以及分支数密度的发育性变化情况。结果：体外培养的海马神经元呈梭形、锥体形、多角形多形性生长。随着培养时间的延长，细胞数密度和面数密度保持不变，突起长度密度和分支密度逐渐增加，突起上膨体样结构数密度增加。结论：体外培养的新生大鼠海马神经元在离体1-14d，随着培养时间的延长，细胞突起、分支数目以及膨体样结构逐渐增多，细胞间连接增加，呈现形态和功能成熟过程。     

经颅磁刺激对海马原代神经元突起生长的影响

目的 观察经颅磁刺激(transcranial magnetic stimulation,TMS)对体外培养的海马原代神经元突起生长及形态的影响,并初步探讨磁刺激对细胞生长发育的影响机制.方法 体外培养的海马原代神经元分为正常培养组(C组),假刺激组(S组),40%最大刺激强度组(M1组),60%最大刺激强度组(M2组),培养细胞24 h后开始磁刺激,每天固定时间刺激,刺激的频率为1 Hz,磁刺激最大输出强度为1.9 T,每天刺激3次,每次20序列,每个序列间隔1 s,每次间隔1 min,连续刺激5 d,刺激源距离细胞1.0 cm.刺激结束后进行免疫荧光染色,观察原代神经元突起形态学改变,比较突起生长数目的 改变及SYN-I表达的改变.结果 TMS 5 d后观察细胞生长状态良好,细胞与细胞间联系较多,部分细胞表现为多突起生长.M1、M2组2个突起的神经元占总神经元的比例分别为(45.6±14.9)%和(45.2±15.6)%,较C组和S组明显增多,差异有统计学意义(P＜0.05);3个及3个以上突起的神经元占总神经元的比例分别为(30.3±10.8)%和(29.3±11.5)%,较C组和S组亦明显增多,差异有统计学意义(P＜0.05).M2组的SYN-I mRNA的表达较C、S两组增高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 TMS可以促进体外培养的海马原代神经元突起的生长.     

吡咯喹啉醌对培养的鼠海马神经元的促生长作用

目的:探讨吡咯喹啉醌(PQQ)对培养海马神经元的促生长作用。方法:原代培养新生大鼠海马神经元,观察PQQ对海马神经元胞体、突起生长和存活率的影响,测定MTT代谢率和脂褐素。结果:PQQ处理后,海马神经元突起的长度和胞体的长径显著大于对照组,细胞的存活率增加、存活的时间延长,尼氏小体的光密度值和MTT代谢率显著高于对照组,脂褐素的含量降低。结论:PQQ能促进海马神经元的生长,增加其存活率、延长存活时间。     

电惊厥大鼠海马生长抑素神经元的超微结构变化

观察电惊厥大鼠海马生长抑素神经元的超微结构变化，为探讨生长抑素在癫痫发病中的作用机制提供形态学依据。采用电惊厥癫痫动物模型和免疫电镜方法观察。结果：电惊厥时海马内生长抑素神经元胞体和突起出现不同程度的结构损伤，表现为线粒体肿胀、细胞器崩解和神经末梢变性等；在海马区多形细胞层和分子层生长抑素神经元胞体、突起与非生长抑素神经元胞体、突起之间有复杂的突触联系。结论：电惊厥时海马CA4生长抑素神经元结构发生损伤。     

神经肽Y标记神经元在大鼠脑桥的分布

目的:观察了神经肽Y（NPY）样神经元在大鼠脑桥的分布,为探讨脑桥NPY样神经元的功能提供实验形态学依据。方法:免疫组织化学方法（PAP法）。结果:在脑桥可见到前庭神经上核、耳蜗神经腹侧核及脑桥尾侧网状核NPY样免疫反应胞体。前庭神经上核的NPY样胞体较多且密集,细胞大小均匀,呈梭形或椭圆形,有明显突起;耳蜗神经腹侧核内的NPY样胞体呈大小均匀分布,圆形且较小,突起不明显;脑桥尾侧网状核内的NPY样胞体分布较稀疏,且大小不一,呈菱形或梭形,有明显较长的突起。结论:NPY样神经元不仅广泛存在于端脑和下丘脑,在脑桥也同样有着广泛的分布。     

大鼠胚胎下丘脑神经细胞的体外原代培养

本文采用体外原代培养技术,详细观察和描述了大鼠胚胎下丘脑神经元在体外的形态发育过程,在国内首次建立了稳定的胚胎下丘脑神经元培养模型。结果表明:细胞培养4h,大部分细胞已贴壁;12h,部分细胞开始向外伸出小的突起;24h,部分细胞成为具有两个突起的神经元;3天时,神经元胞体增大,部分细胞为具有3个突起的神经元;1周后,神经细胞突起互相连接成网,细胞突起随培养时间延长而增多;第4周时,细胞开始减少,但仍可见较大的、具有多个突起的神经元。本文还对细胞培养过程中胚胎胎龄的选择、细胞分离的方法等问题进行了讨论。     

施万细胞与背根节神经元体外共培养成髓鞘模型的建立

目的：探讨施万细胞与背根节神经元髓鞘化共培养的标准化方法,为研究周围神经髓鞘化的形成机制提供稳定的周围神经髓鞘化体外模型。方法：取出生1~3 d新生SD大鼠,培养施万细胞,经纯化鉴定后用于共培养。取孕14~15 d的SD大鼠胚鼠背根神经节,经纯化后用于共培养;将2种分别纯化的细胞进行共培养,加抗坏血酸诱导髓鞘的形成。利用免疫组化染色、扫描电镜和透射电镜,检测髓鞘的形成。结果：纯化后施万细胞纯度可达到98%以上,可用于共培养。背根节神经元贴壁良好,经纯化后几乎无杂细胞可见,可用于共培养。对共培养细胞进行MAG与NF的免疫组化染色,发现有数量可观的髓鞘形成,并且髓鞘是紧密包绕在神经元轴突上。扫描电镜下可观察到施万细胞包绕轴突形成髓鞘,而透射电镜下则可观察到有致密的髓鞘板层结构形成。结论：本实验成功建立稳定可靠的体外成髓鞘模型,可用于轴突的新髓鞘化实验研究。     

大鼠纹状体神经元型一氧化氮合酶神经元的分布和超微结构特征

目的 观察大鼠纹状体神经元型一氧化氮合酶(nNOS)免疫阳性神经元的分布以及阳性神经元的超微结构特征.方法 取健康成年SD大鼠,ABC法显示nNOS免疫阳性神经元,包埋前染色方法对阳性细胞进行免疫电镜观察.结果 光镜下,nNOS免疫阳性细胞呈棕褐色,胞体及突起清晰,纹状体外侧区阳性细胞较多,内侧区较少.各区内阳性细胞以中、小型细胞为主,且大多数为中型细胞,小型细胞次之,大型细胞最少.透射电镜观察nNOS阳性神经元核大,胞浆少,呈中间神经元的特征;阳性颗粒呈黑色斑块样,在胞体内,可见小的阳性物质分布于胞核周围或者细胞膜内侧均无膜样结构包裹,大的团块样阳性物质主要存在于胞浆,有清晰的单层膜样结构包裹,亦可见部分无膜样结构包裹的大的阳性物质;在树突和轴突集中的部位亦可见免疫阳性物质,但并不在突起终末的囊泡内;脑组织内微血管壁旁的免疫阳性终末较多见,其突起毗邻血管外膜.结论 大鼠纹状体nNOS免疫阳性神经元以中、小型细胞为主,符合中间神经元的特征,nNOS阳性物质分布于胞质和突起,大块物质多有膜性结构包裹,小块和部分大块阳性物质以及位于轴树突内的无膜性结构包裹,这可能与其功能状态有关.     

癌细胞浸润时的扫描及透射电镜观察

进一步了解癌细胞在体内浸润时形态，为癌细胞的浸润机理及诊断提供理论基础。方法用扫描电镜、透射电镜观察鳞癌、腺癌、基底细胞癌等细胞浸润时的形态。结果１、各种浸润时的癌细胞均可见阿米巴样活动、“癌溶现象”、及“癌性纤维化”。２、癌细胞伪足内可见内质网及骨架系统。３、癌细胞浸润时的形态与组织来源、分化高低及宿主免疫力有关。４、基底细胞癌巢周边的部分细胞分泌物形成基底膜的内层。５、淋巴细胞伸出指状突起的伪足至癌细胞表面使其形成溃疡状的损伤。６、癌细胞表面可见皱缩的红细胞。结论上述未见报道的或罕见报道的发现为癌细胞的浸润机理及病理诊断的进一步研究提供有价值的基础关键词     

微载体黏附培养SD大鼠肝细胞的生物学特性

目的:探讨微载体黏附培养SD大鼠肝细胞的生物学特性. 方法:对胶原酶消化法分离获取的SD大鼠肝细胞行微载体黏附培养,在倒置显微镜及扫描电镜下观察肝细胞形态变化,采用CL-800全自动生化分析仪检测不同时间培养上清中白蛋白、乳酸脱氢酶(LDH)和尿素的含量. 结果:微载体黏附培养肝细胞的正常形态及白蛋白、尿素合成功能可维持1 wk以上,LDH漏出量、白蛋白及尿素水平1 wk内呈波动性变化,在培养第3日白蛋白及尿素水平最高、LDH漏出量最低. 结论:微载体培养可提供高活性、高密度生长的肝细胞,可望为肝细胞移植、生物型人工肝提供较理想的细胞材料;微载体培养肝细胞在培养第3日功能最佳,可能为应用于肝细胞移植、生物型人工肝的最佳时间.     

二脱氧肌苷对背根神经节神经元突起生长的影响

目的探讨二脱氧肌苷（didanosine, ddI）对分散培养的胎鼠背根神经节（dorsal root ganglion, DRG）神经元胞体和突起生长的影响。方法分散培养的胎鼠DRG神经元用不同浓度的ddI (1μg/mL, 5μg/mL, 10μg/mL, 20μg/mL) 孵育,对分散培养的DRG神经元用微管相关蛋白2（microtubule associated protein 2, MAP2）免疫荧光标记后,用共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscope, CLSM）观察神经元胞体和突起的改变。结果分散培养的胎鼠DRG神经元用ddI孵育3d后,神经元突起的数目减少和长度变短,而神经元的胞体的大小则没有明显变化。结论ddI可直接影响分散培养的胎鼠DRG神经元突起的生长。     

四种显微技术观测大鼠颌下腺细胞与丝素-壳聚糖体外共培养的形态学特点

目的 采用倒置显微镜、扫描电镜(scanning electron microscopy,SEM)、荧光显微镜和激光共聚焦显微镜(( laser scanning confocal microscopy,LSCM))技术对大鼠颌下腺细胞(rat submandibular gland cells,RSMGs)与丝素-壳聚糖( silk fibroin-chitosan,SFCs)的体外复合培养进行形态学观察.为观测、评估种子细胞在三维支架的内部生长情况提供技术支持.方法 取0～8d龄SD大鼠的颌下腺,对大鼠颌下腺细胞进行原代培养、分离纯化并传代;用抗细胞角蛋白单克隆抗体( CK8)及淀粉酶抗体的免疫细胞化学染色鉴定细胞来源.选取传至第二代的对数生长期的RSMGs作为种子细胞,选取SFCs共混膜(5×5×2)mm作为支架材料构建组织工程化涎腺样结构.将种子细胞与支架材料复合培养并分别于倒置显微镜、SEM、荧光显微镜和LSCM下观察二者复合生长情况.结果 倒置显微镜可以直接观察活细胞与支架复合生长情况,方法简单易行.SEM可以较精确的展示细胞支架复合生长的表面超微结构.经过荧光染料的着色,荧光显微镜和LSCM都可以观察到支架上锚定的种子细胞.荧光显微镜可见细胞核的荧光信号均匀的分布在支架孔隙内.LSCM通过层扫描及三维重建技术对较厚的标本获取图像;并可以通过旋转图像,从不同角度观察细胞支架复合物的三维剖面或整体结构,得到更为准确的定位信息.结论 四种显微技术均可应用于RSMGs与SFCs体外共培养的形态学观测.LSCM的三维重建技术结合荧光染料标记可以较好地获得RSMGs与SFCs复合生长的情况,有着较广泛的应用价值.     

脱细胞异种角膜基质的制备及细胞相容性

目的用牛角膜制备脱细胞基质,作为组织工程角膜的载体,为细胞提供贴附生长的支持物.方法选取新鲜牛角膜9个,每个分层剥离为2片组织.用0.25%胰蛋白酶,37℃下分为20、40、60min消化,漂洗.每组取样本分别做扫描电镜观察和HE染色观察.其余冻干处理后消毒备用.将消毒后冻干牛角膜基质常规培养基浸泡24 h,取浸提液原液,稀释101、102、103倍培养人成纤维细胞,观察细胞生长情况.将冻干牛角膜基质复水,常规培养基浸泡24 h,以2×l05个/cm2接种兔角膜缘细胞,培养7 d后,标本扫描电镜检查、HE染色观察.结果电镜观察各组牛角膜片表层细胞均被脱去,60min组基质胶原间细胞碎片残留较少,20 min组较多,胶原纤维有序排列以60 min组破坏最大.浸提液的各稀释倍数及原液所培养人成纤维细胞生长良好,各组间差异无显著性.电镜及HE染色观察复合材料培养的兔角膜缘干细胞,均见细胞在材料表面贴附生长,材料部分表面呈多层生长.结论以酶消化法和冻干处理的脱细胞牛角膜基质可以作为细胞的载体在体外与细胞复合培养.     

Myelin-basic protein-reactive specific CD4+ and CD8+ NK lymphocytes induce morphological changes in neuronal cell bodies and myelin sheaths: implications for multiple sclerosis

BACKGROUND: Multiple sclerosis (MS) is a chronic disease characterized by loss of myelin. However, data indicate that autoimmune cells could directly impair neuronal cell bodies and myelin sheath is lacking. The aim of the present study was to determine morphological evidence of the direct impairment of neurons by autoreactive lymphocytes and to further identify the subtypes of these lymphocytes. METHODS: Lymphocytes activated by myelin basic protein (MBP) 83-99 and neurons of human brain were co-cultured for 24 h. RESULTS: Observations through scanning electron microscope showed that MBP-specific lymphocytes (CD4+, CD8+ cells, and NK cells) aggregated in the vicinity of the neuronal cell bodies and the myelin sheaths and attacked them directly, resulting in the degeneration of both neurons. CONCLUSIONS: Our studies provide morphological evidences of the direct impairment of neuronal cell bodies and myelin sheaths by MBP-specific lymphocytes. Our studies also suggest that MBP-specific CD4+, CD8+, and NK cells might be involved in this process. These processes may play a role in the direct impairment of neurons and myelin sheaths in early stages of MS and provide evidences for the application of immunosuppressant therapy of MS.