应用rDNA ITS测序检测海南岛条件致病性真菌

目的:应用内转录间隔区(ITS)引物建立一种较为敏感、特异检测和鉴定条件致病性真菌的方法,为进一步鉴定不同真菌的种、型的亲缘关系提供分子生物学依据。方法:用常规的真菌检验方法对76份口腔标本做初步鉴定,采用通用引物ITS1、ITS4对可疑真菌菌悬液进行PCR扩增,PCR扩增产物纯化、DNA测序,做序列比对分析。结果:ITS-PCR扩增出种特异的DNA条带,检测菌株76株,DNA测序鉴定出白假丝酵母菌53株(69.7%),其他真菌23株(30.3%)。结论:采用ITS引物测序法,可准确地检测出不同种的条件致病性真菌,并为进一步鉴定菌株的变异性,发现亚种提供基础。     

我国西南地区主要谷物表面污染真菌的分离与分子鉴定?

目的：了解我国西南地区2014-2015年产主要谷物污染状况,探索谷物表面污染真菌的快速鉴定方法。方法利用孟加拉红培养基进行谷物表面真菌的分离与纯化。选用扩增真菌18S 序列的通用引物 ITS1和ITS4,通过 PCR 扩增和序列分析进行菌种鉴定。结果从157份谷物样品中分离得到277株真菌,利用分子生物学鉴定方法成功鉴定,污染率为42.0%,其中小麦主要侵染真菌为枝孢菌属、链孢霉属和小光腔菌属,玉米、大米主要侵染真菌为链孢霉属、曲霉菌属和青霉菌属。结论我国西南地区谷物样品的污染现象比较普遍,产毒菌株污染较为严重,存在潜在风险。选用的引物通用性较好,可用于谷物表面污染真菌的鉴定。     

吉林省常见的几种委陵菜ITS序列比对

目的:用PCR扩增吉林省常见委陵菜ITS序列,对其PCR产物进行序列分析,找出其序列的差异,为委陵菜种间鉴别及鉴定提供科学依据。方法:分别从几种吉林省常见委陵菜的叶片中提取总DNA,以被子植物ITS通用引物进行扩增,扩增产物经纯化后直接测序。结果:几种委陵菜中除所采集委陵菜属杂交植物而种属内ITS序列有一定差异外,其他...     

吉林省常见的几种委陵菜ITS序列比对

目的 用聚合酶链式反应( PCR)扩增吉林省常见委陵菜ITS序列,对其PCR产物进行序列分析,找出其序列的差异,为委陵菜种间鉴别及鉴定提供科学依据.方法 分别从几种吉林省常见委陵菜的叶片中提取总DNA,以被子植物ITS通用引物进行扩增,扩增产物经纯化后直接测序.结果 几种委陵菜中除所采集委陵菜因属杂交植物而种内ITS序...     

应用等位基因特异聚核酶链式反应鉴别半夏类药材

目的 建立能区分半夏正、伪品的分子鉴定方法.方法 下载GenBank中半夏属、犁头尖属及天南星属相关序列,利用DNAMAN进行比对分析,根据ITS序列中半夏的SNP位点设计引物PtITS178F和PtITS555R,采用等位基因特异PCR进行扩增.结果 对半夏5个产地的新鲜样品、10个产地的药材以及5批虎掌、水半夏样品进行PCR检测.引物PtITS178F和PtITS555R只对半夏类药材扩增395 bp片段,虎掌和水半夏均无扩增条带.结论 等位基因特异PCR能准确检测半夏的SNP位点,达到准确鉴别半夏正伪品的目的,是一种有前途的中药材分子鉴定方法.     

绵枣儿核核糖体DNA ITS序列扩增的研究

采用通用引物扩增绵枣儿核核糖体DNA ITS序列,未得到目的条带.根据引物设计原则自行设计12个引物,其中只有使用引物对PA3、D(ITS3),PA4、D(ITS3),PA4、DO2扩增得到绵枣儿核核糖体DNA ITS序列.     

焦磷酸测序法鉴定临床常见病原菌

目的 建立高效的焦磷酸测序鉴定临床常见病原菌的方法.方法 在细菌16S rRNA的V1及V3可变区两端保守序列设计PCR扩增通用引物及焦磷酸测序引物,PCR扩增后焦磷酸测序测定V1及V3可变区序列,测序结果与数据库比对判断细菌种属.结果 在4 h内完成96株细菌的鉴定,所有菌株鉴定结果与常规鉴定结果一致.结论 焦磷酸测序技术可以用于临床分离菌株的鉴定,且具有费用相对低廉、高通量、鉴定能力强等优点.     

鼓槌石斛特异性PCR分子鉴定

目的 研究能够特异性鉴别鼓槌石斛的PCR引物,并优化PCR检测体系,确立一种快速、准确鉴别鼓槌石斛的方法。方法 从GenBank数据库中下载石斛属rDNA ITS序列170余条,运用MEGA 5.0对所有序列进行同源性比较,找出各变异位点,在非保守区设计1对特异性引物。对35份石斛属植物DNA模板进行特异性引物PCR扩增,显示阳性者为鼓槌石斛。结果 将退火温度升至58 ℃时,鼓槌石斛能被该引物特异性地扩增出来,而其他石斛属植物均为阴性,且该引物的灵敏度可达到0.69 ng/μL。结论 建立一种特异性鉴别鼓槌石斛的方法,运用该特异性引物可实现从同源物种中快速、准确地鉴定出鼓槌石斛,具有特异性好,操作简便、高效、准确等优点。     

一株具有免疫增强活性的海南红树林真菌WC1016的分类鉴定

目的:对从海南文昌清澜港红树林土壤样本中分离到的一株具有免疫增强活性的真菌菌株WC1016进行分类鉴定.方法:通过菌落特征、显微形态、ITS序列测定及其系统发育分析对菌株WC1016进行鉴定.结果:菌株WC1016在CA上形成典型紫色绒絮状菌落.显微观察其分生孢子梗具有拟青霉属的典型特征.ITS序列测定及系统发育分析表...     

1株具有抗肝癌活性的狭叶柴胡内生真菌的鉴定

目的 对1株具有抗肝癌活性的狭叶柴胡内生真菌CHS4进行菌种鉴定,并对其抗肝癌活性进行初步检测.方法 采用传统分类学方法及电子显微镜观察对CHS4进行形态鉴定,并采用真菌鉴定通用引物V9D与LS266对其基因组DNA进行扩增得到ITS序列,将已经测得的序列结果与GenBank中已知序列进行Blast分析,从而进行分子鉴定.利用MTT法对菌CHS4的乙醇粗提物进行抗肝癌活性检测.结果 内生真菌CHS4经鉴定为链格孢属真菌互隔交链孢霉(Alternaria alternata);该菌株发酵液的乙醇粗提物对肝癌细胞HepG-2的抑制作用与其浓度成正相关,且IC50值为75.11 μg/mL.结论 从狭叶柴胡中分离到一株具有抗肝癌作用的内生真菌CHS4,可作为生产抗肝癌药物的候选资源.     

靶向鉴别、检测动物双歧杆菌的引物探针及应用

为解决目前应用于鉴别动物双歧杆菌的方法的用时长、操作复杂、实验环境低适配性等缺点,开发了一种基于ERIC-PCR技术设计特异性引物探针以靶向鉴别、检测动物双歧杆菌的方法。以动物双歧杆菌HP-B1124基因组DNA为基础,优化动物双歧杆菌HP-B1124的ERIC-PCR反应条件,对ERIC-PCR片段逐一回收并进行测序,针对测序结果设计两对特异性引物探针,对两对引物探针设计结果的准确性、特异性、可检测基因组DNA的含量限度、普适性进行检验,并运用所设计的两对特异性引物探针检验市售公示配方中含有动物双歧杆菌的产品。本研究设计的两对特异性引物探针可简单、快速、靶向的用于动物双歧杆菌的鉴定。此方法优化了目前相对传统的动物双歧杆菌纯培养及平板计数鉴定方法,一定程度上解决了SNP基因分型技术及实时荧光定量PCR法等方法在鉴定动物双歧杆菌方面对实验设备及试剂的高要求,具有成本低、特异性强的特点,有较为广阔的市场开发前景。     

利用微卫星多重PCR技术鉴定剑尾鱼RR-B系

目的建立多重PCR技术鉴定选育剑尾鱼RR-B系的方法。方法根据可明显鉴定剑尾鱼RR-B系的6对特异性微卫星引物Msa012、Msa014、Msa033、Msb025、Msd003、Msd051,采用不同的组合方式对RR-B系剑尾鱼和红眼红体的非选育剑尾鱼进行多重PCR扩增。结果引物组合1(Msa014、Msb025、Msd003)和组合2(Msa012、Msa033、Msd051)两个三重PCR反应体系能清楚的扩增各个微卫星座位,且各目的片段之间无干扰,易于识别,引物组合1的排除概率为99.98%,引物组合2的排除概率为99.96%,能准确鉴定剑尾鱼RR-B系。结论本检测方法具有较高的稳定性,可快速准确鉴定剑尾鱼RR-B系。     

利用软件Primer Premier 5.0进行PCR引物设计的研究

目的运用Primer Premier 5．0软件设计PCR引物，并且检验所设计引物的PCR扩增效率和特异性。方法运用Primer Premier 5．0软件设计16对猪和犬的PCR扩增引物，通过PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测实验结果。结果在所设计的16对引物中有8对PCR扩增特异性好且效率高，成功率50％。但是，其中早期设计引物12对只有4对成功，后期设计引物4对全部成功。结论从引物设计的过程中可以看到一种趋势-后期引物设计的成功率远远高于早期。这表明我们在引物设计方面正在逐步成熟，特别是运用比较基因组学定位的原理在分离新基因的引物设计方面积累了较多的经验。     

应用M13引物PCR指纹法分析假丝酵母菌氟康唑耐药性

目的 探讨M13微卫星引物PCR指纹法用于假丝酵母菌氟康唑耐药性基因分型的可行性。方法 采用纸片扩散法分析假丝酵母菌氟康唑耐药性，并进一步对41株假丝酵母菌进行M13引物PCR指纹分析，采用RAPD200软件邻接法(neighbour joining，NJ)聚类分析电泳带型模式。结果 41例主要从痰液和阴道分泌物中分离的假丝酵母菌标本中中，氟康唑药物敏感11株(26.8％)，依赖8例(19.5％)，耐药22例(53．7％)，PCR指纹分析至少可检测到12种不同的条带，条带数目从2条到12条不等，电泳带型模式与感染部位和氟康唑药物反应性有关。结论 假丝酵母菌氟康唑耐药性菌珠所占比例较大，M13微卫星引物PCR指纹法可用于假丝酵母菌的分子流行病学调查和氟康唑耐药性基因分型。     

多对引物PCR方法鉴别尖锐湿疣和假性湿疣

应用多对引物ＰＣＲ方法对尖锐湿疣９５例和假性湿疣３３例进行了鉴别。结果９５例尖锐湿疣中８６例（９０．５％）ＨＰＶ６／１１ＤＮＡ阳性，３３例假性湿疣ＨＰＶＤＮＡ阴性，两组有非常显著差别（Ｐ＜０．００１）。本研究结果显示假性湿疣与ＨＰＶ无关。ＰＣＲ方法准确、省时、方便，是鉴别尖锐湿疣与假性湿疣的理想方法。     

应用M13引物PCR指纹法分析假丝酵母菌氟康唑耐药性

目的探讨M13微卫星引物PCR指纹法用于假丝酵母菌氟康唑耐药性基因分型的可行性。方法采用纸片扩散法分析假丝酵母菌氟康唑耐药性,并进一步对41株假丝酵母菌进行M13引物PCR指纹分析,采用RAPD200软件邻接法(neighbour joining,NJ)聚类分析电泳带型模式。结果41例主要从痰液和阴道分泌物中分离的假丝酵母菌标本中中,氟康唑药物敏感11株(26.8%),依赖8例(19.5%),耐药22例(53.7%),PCR指纹分析至少可检测到12种不同的条带,条带数目从2条到12条不等,电泳带型模式与感染部位和氟康唑药物反应性有关。结论假丝酵母菌氟康唑耐药性菌珠所占比例较大,M13微卫星引物PCR指纹法可用于假丝酵母菌的分子流行病学调查和氟康唑耐药性基因分型。     

多重PCR检测HBV和HCV方法的建立

目的:建立可同时检测血清HBVDNA和HCVRNA的多重PCR。方法:利用已知的基因序列设计了对于不同亚型HBV保守的C基因区的一对引物HBV-P623及对于不同亚型HCV高度保守的位于5’端非编码区(5’-NCR)的两对引物HCV-P289和HCV-P174,扩增经基因释放剂(Genereleaser)处理的HBV和HCV阳性血清。结果:多重引物、逆转录套式PCR反应体系可同时扩增HBV DNA和HCV RNA,分别在623bp和174bp处出现特异DNA扩增带。该反应体系具有较高的特异和敏感性,受检血清中仅含有10fgHBV DNA和5CID HCV RNA即可检出。血清标本不需要提取核酸,可直接进行PCR。用此体系检测30例输血后病人血清,其中15例为HBV感染,8例为HCV感染,7例为阴性。结论:多重PCR检测HBV及HCV的方法具有简便性和实用性。     

Bcl-2shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的:应用分子克隆技术,针对人bcl-2目的基因设计3个siRNA靶点和一个阴性对照序列,构建4对shRNA重组慢病毒表达载体,并进行测序验证鉴定。方法:以设计的有效靶序列进行引物合成,将单链引物退火成双链oligo序列,连接入经Age I和EcoR I双酶切线性化的慢病毒RNA干扰载体中,经转化DH5α感受态细胞并筛选出阳性转化子,采用PCR扩增和DNA测序分别鉴定阳性克隆。结果:PCR扩增产物经凝胶电泳后阳性克隆得到335bp条带,阴性克隆得到298 bp条带,DNA测序结果证实其含有设计合成序列。结论:成功构建4对bcl-2shRNA重组慢病毒表达载体,为研究靶向bcl-2 siRNA对肿瘤细胞增殖抑制与诱导凋亡作用及基因治疗研究奠定了实验基础。     

多重聚合酶链反应检测结核菌耐异烟肼相关基因

目的：建立耐异烟肼(isoniazid,INH)结核分枝杆菌(M.tuberclasis,MTB)多重聚合酶链反应(multiple PCR,multi-PCR)检测系统，在一次扩增中快速，特异地同时检出aphC启动子，inhA和kagG基因，用于快速初步诊断结核分枝杆菌对INH的耐药性．方法：根据结核分枝杆菌的aphC启动子，inhA和kagG序列，分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物，采用multi—PCR技术，同时检出对结核分枝杆菌耐INH起作用的3个基因．结果：应用multi—PCR反应体系，对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果；multi—PCR扩增的预期结果为：单基因引物出现一条特异性扩增区带，多重基因引物出现2或3条特异性扩增区带，经实验达到预期的扩增结果；对H37Rv标准株、INH敏感株及INH耐药株分别采用常规PCR和multi—PCR进行同时扩增，结果两种扩增方法均能扩增出预期的目的片段，符合率达100％．结论：multi—PCR能有效地为多基因耐药的临床病原体的诊断提供快速、准确的诊断手段，更能提高检验效率。     

江苏省徐州市分离的大肠杆菌O157:H7菌株携带志贺毒素2型别的变化

目的 研究我国分离的大肠杆菌O157：H7菌株的志贺毒素型别的变化。方法使用针对志贺毒素2及其变种的引物对进行PCR检测、细菌染色体DNA的PstⅠ酶切后的Southern印迹实验和PCR产物的HaeⅢ、RasⅠ酶切分析,以及：PCR产物克隆后的序列分析方法以及致病性大质粒的PstⅠ酶切分析。结果1999年分离自徐州市的人的5株菌均携带slt1、slt2,而2000年从江苏省徐州市患者分离的10株和蜣螂标本分离的4株共计14株大肠杆菌O157：H7菌株仅携带slt2vha毒素基因,其致病性质粒的限制性酶切图谱与1999年的菌株相比也发生了改变。结论鉴于江苏省徐州市1999年的分离的5菌株全部携带slt1和slt2基因,结果提示该地的优势菌型发生了改变,可能当地大肠杆菌O157：H7感染的流行病学特点有关。针对slt2变异基因而设计的引物及其以此为基础进行的限制性片段长度多态性分析的方法对于研究O157：H7菌株的志贺毒素型别的变化能够满足特异性及灵敏性的要求。