BimS慢病毒RNA干扰载体的构建及其感染效率和干扰效果的实验研究

目的:应用RNA干扰技术构建BimS慢病毒RNA干扰载体,探讨其感染效率和干扰效果.方法:针对人BimS设计3个干扰靶点,将单链引物退火成双链oligo序列,连接入Age Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切线性化载体中.将重组质粒进行病毒包装、并且通过感染ACC-2细胞观察其感染效率,定量PCR检测其对BimS mRNA干扰效果.结果:PCR产物经扩增电泳后阳性克隆得到337bp条带,插入序列片段与DNA测序结果完全相符.重组慢病毒载体在293T细胞中包装获得滴度为2×10s TU/ml的病毒颗粒,MOI=20,转染效率为85％.转染pFU-GV-BmS-1组、pFU-GV-BmS-2组及对照组BmS mRNA相对表达水平分别为:0.743±0.025、0.466±0.023、1.266±0.042(组间两两比较,P＜0.05).结论:BimS慢病毒RNA干扰载体构建成功,并能高效感染ACC-2细胞及下调BmS mRNA表达.     

小剂量普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤的临床观察

目的：探讨小剂量普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤的疗效及安全性。方法：收集增生期婴幼儿血管瘤23例（男6例,女17例）,口服普萘洛尔0.5～0.75 mg/（kg.d）,疗程1～9个月,并进行疗效评定和安全性评价。结果：疗效评定：优6例（26.1%）,良9例（39.1%）,中等8例（34.8%）;不良反应包括：心率轻度减慢8例（34.78%）,睡眠障碍2例（8.7%）,腹泻1例（4.3%）。不良反应轻,均1周内自行消失;安全性评定：15例为安全,8例为比较安全。结论：小剂量普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤,疗效良好,不良反应轻,安全性较好。     

黄芩苷和牛血清白蛋白双缓释制剂的制备及释药性能检测

目的:将黄芩苷和牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)载入壳聚糖温敏凝胶,构建双缓释体系,检测凝胶对药物的体外释放情况。方法:采用乳化缩聚法制备黄芩苷-明胶微球(gelatin microspheres,GMS);用不同配比的壳聚糖溶液和β-甘油磷酸钠(β-glycerophosphate,β-GP)溶液制备壳聚糖温敏凝胶,观察在37℃的成胶情况,选择最佳配比;在此基础上,将不同浓度的黄芩苷-GMS与BSA共混于壳聚糖凝胶溶液,测定载药后的成胶情况及黄芩苷和BSA的体外释放情况。结果:成功制备了黄芩苷-GMS,载药率5.62%,包封率72.05%;1.8%壳聚糖溶液与9%的β-GP混合10min后可获得状态良好的凝胶;加载两种药物后的凝胶溶液相转变时间未发生改变;30d时低浓度组累积释放了63.79%,两个较高浓度组分别释放了74.86%、77.63%。结论:壳聚糖温敏凝胶可以同时负载黄芩苷-GMS和BSA两种药物,在室温下呈溶液状态,37℃下经过10min可转变成半固体凝胶,在体外释药可达30d。黄芩苷和牛血清白蛋白双缓释制剂的制备和释药性能检测为牙周组织修复再生药物的研制提供了基础。     

黄芩苷对人牙周膜细胞功能活性调节的实验研究

目的：通过观察中药黄芩的有效成份黄芩苷对人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells,hPDLCs）增殖、矿化成骨等功能活性的影响,研究黄芩对人牙周膜细胞的调节作用。方法：采用组织贴块联合胶原酶消化的方法,体外分离、培养、纯化和鉴定hPDLCs后,通过四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法、酶联免疫吸附、半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）等方法,检测不同浓度的黄芩苷（10、1.0、0.1、0.01mg/L）对hPDLCs增殖、矿化成骨、骨保护素（osteoprotegerin,OPG）、细胞核因子-κB受体活化因子配基（receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL）mRNA表达等方面的影响。结果：0.1mg/L的黄芩苷对于增加人牙周膜细胞的增殖活性、碱性磷酸酶活性和Ⅰ型胶原蛋白的表达作用最强;适宜浓度的黄芩苷可以降低RANKL/OPGmRNA比值。结论：黄芩苷能促进hPDLCs的增殖和成骨作用,该作用可能与RANKL/OPG信号通路相关。     

利塞膦酸盐对BMSCs诱导的成骨细胞在脱钙骨支架上生物学行为的影响

目的:观察不同浓度利塞膦酸盐对脱钙骨支架中成骨细胞活性的影响.方法:选用含不同浓度利塞膦酸钠的培养液(10～-7、10-810-9,10-10 mol/L)对BMSCs诱导的成骨细胞与脱钙骨支架复合物进行培养,通过MTT,上清液碱性磷酸酶活性及Ⅰ型前胶原羧端肽、骨钙素检测对比观察不同浓度利塞膦酸钠对成骨细胞的作用效果.结果:MTT显示不同浓度利塞膦酸钠组细胞均随培养时间的增加而明显增殖,相同培养时间各不同浓度的利塞膦酸钠组的细胞增殖能力均高于对照纽(P＜0.05),且在10-10～10-7mol/L浓度范围内呈逐渐增加趋势.各不同浓度的利塞膦酸钠组的上清液ALP活性表达、Ⅰ型前胶原羧端肽表达、骨钙素表达均随培养时间的增加而明显增加,相同培养时间各组数值均高于对照组(P＜0.05),且在10-10～10-7 mol/L浓度范围内呈逐渐增加趋势.结论:利塞膦酸钠对成骨细胞在支架材料中的粘附、生长、增殖及骨化作用均有良好的促进作用.     

皮肤血管瘤内皮细胞原代分离培养与鉴定

目的 建立一种体外分离纯化血管瘤内皮细胞原代培养方法,探讨血管瘤内皮细胞的生物学特性及其分子机制.方法 采用组织块法结合差速贴壁进行原代培养.通过相差显微镜观察细胞形态,免疫组织化学和免疫荧光染色鉴定细胞CD34和Ⅷ因子相关抗原.结果 培养48h后可见组织块周围游离出细胞,呈多边形,胞核清晰,72h去除组织块,2w后细胞长满培养板底形成单层细胞呈铺路石样生长.免疫组化显示CD34表达阳性;免疫荧光染色证实Ⅷ因子相关抗原阳性.结论 组织块法结合差速贴壁可获得高纯度的血管瘤内皮细胞,是一种简单实用的原代培养方法.     

人野生型P53与反义mdm2基因融合体真核表达载体的构建及其在Mc3细胞中的表达

目的构建P^53与反义mdm2 cDNA序列真核表达载体，并探讨其在人黏液表皮样癌高转移细胞株Mc3细胞中的表达。方法应用分子克隆技术，将mdm2 cDNA序列反向插入到含有P^53基因序列pDOR—Neo中的P^53。基因序列下游，构成含有P^53基因与反义mdm2基因融合基因的逆转录病毒表达载体。经酶切分析鉴定后命名为pDOR—Neo—P^53-F mdm2并将重组载体通过脂质体转染Mc3细胞，通过G418筛选转染阳性细胞，并采用Westernblot方法检测P^53蛋白表达。结果酶切鉴定证实重组载体含有P^53与反义mdm2 cDNA片段，实验结果表明：转染后P^53蛋白（1．35±0．14）较对照组P^53蛋白（6．26±0．11）含量显著减低（P〈0．01），转染空载体P^53蛋白（6．24土0．12）与对照组比较无统计学差异（P〉0．05）。结论P^53与反义mdm2基因融合体真核表达载体构建成功，并表达野生型P^53蛋白和封闭mdm2基因，为今后进一步研究打下了基础。     

Bcl-2硫代反义寡核苷酸对人恶性黑色素瘤A375细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究bcl-2硫代反义寡核苷酸(bcl-2ASODN)对人恶性黑色素瘤细胞A375增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法:采用MTT法、激光共聚焦显微镜、TUNEL法和AnnevinV/PI双染法检测bcl-2ASODN对A375细胞增殖和凋亡的影响。应用RT-PCR方法,观察bcl-2ASODN处理前后bcl-2mRNA在A375细胞表达水平的变化。结果:MTT法检测显示bcl-2ASODN抑制A375细胞增殖,并呈时间和剂量依赖性;经30μmol/LASODN作用48h,激光共聚焦显微镜观察细胞呈现典型凋亡特征;TUNEL染色可见ASODN组多数A375细胞核被标记呈棕褐色,而SODN组和对照组细胞核未被明显标记;AnnexinV/PI检测ASODN组凋亡细胞比例升高,与SODN组和对照组均有显著性差异(P<0.001);RT-PCR结果显示bcl-2mRNA表达水平下降。结论:bcl-2ASODN可抑制A375细胞增殖和诱导A375细胞凋亡,其诱导凋亡的机制是下调bcl-2mRNA的表达。     

半定量RT-PCR检测腺样囊性癌细胞survivin mRNA的表达

目的探讨靶向surv iv in基因阻断后mRNA表达量的变化,以及在体外对肿瘤细胞的抑制作用。方法应用分子克隆技术构建siRNA真核表达载体Pgenesil/sur;通过脂质体转染腺样囊性癌(salivary adeno id cystic carcinom a,SACC)细胞。采用RT-PCR技术检测转染前后surv iv in mRNA表达量以及表达抑制率。结果转染后surv iv in mRNA表达水平x-±s(0.42±0.10)较转染前surv iv in mRNA表达水平(1.56±0.12)明显减低,P<0.05;在mRNA水平其表达抑制率为73.1%。转染空质粒载体Pgenesil-1 surv iv in mRNA表达水平(1.35±0.13)与空白对照组比较无统计学差异(P>0.05)。结论靶向surv iv in siRNA能阻断肿瘤细胞surv iv in基因mRNA表达,并有效抑制体外培养的肿瘤细胞SACC-83的增殖作用。     

一种对组织工程支架材料上细胞的非特异性荧光染色方法的建立

目的 采用以吖啶橙作为荧光染料,对生长在不透光性材料上的细胞进行染色,并建立染色方法,探讨其在组织工程学研究中的应用价值.方法 将骨髓间充质、牙髓、牙周膜3种组织来源的干细胞作为种子细胞,调整细胞浓度为1×104/ml,分别接种到钛片、β-磷酸三钙生物陶瓷、牙骨质片三种组织工程支架材料上.待细胞长满支架材料后,应用不同浓度及pH值的吖啶橙染液对细胞进行染色,采用荧光倒置显微镜进行观察.结果 0.1 g/dl浓度、pH7.2的吖啶橙染液细胞染色荧光信号强、背景染色信号弱,染色后能清晰地观察到支架材料上的绿色荧光细胞.结论 吖啶橙可作为组织工程支架材料上种子细胞的一种染色方法,该方法操作简单易行、费用低廉,在组织工程学研究中有着重要意义.