殊异韦荣菌sahH基因的克隆、表达和纯化

目的:对殊异韦荣菌S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（sahH）基因进行克隆、鉴定、表达和纯化,为研究龋病的微生物致病机制提供理论依据。方法:提取殊异韦荣菌基因组DNA,采用PCR方法扩增sahH基因序列,构建pET28a-sahH重组质粒，转化到大肠杆菌（E.coli）BL21（DE3）感受态细胞中,酶切、PCR鉴定和测序后，IPTG诱导蛋白表达,并进行分离纯化。结果: PCR扩增产物全长为1 410 bp。测序结果经BLAST软件分析,与GenBank中所报道的绿脓假单胞菌sahH基因序列进行对比分析,其同源性为99%。该基因序列已登陆GenBank,序列号为KC477409。SDS-PAGE分析,重组质粒在E.coli JM109中表达并纯化,得到的融合蛋白相对分子质量约为50 000,诱导5 h蛋白表达量最高,浓缩后蛋白浓度为5.4 g/L。Western blotting法得到的蛋白条带与目的蛋白大小相符。结论:成功克隆了殊异韦荣菌sahH基因,并通过基因序列和氨基酸分析证明其具有完整的阅读框架，且重组载体表达出融合蛋白,分离纯化得到目的蛋白。     

天然高产脂肪酶细菌的分离鉴定及脂肪酶基因的分析

目的：从环境中分离高产脂肪酶的细菌,并克隆其脂肪酶基因。方法：从天然高油脂含量土壤筛选高产脂肪酶的细菌,鉴定菌种后,设计相应引物PCR扩增脂肪酶基因并进行TA克隆,重组载体转入E.coli DH5α构建工程菌,双酶切及测序鉴定脂肪酶基因。结果：经过微生物菌种鉴定获得4株高活力菌,其中一株金葡菌产酶最高,利用PCR技术成功扩增脂肪酶基因,该基因经过克隆测序及其双酶切鉴定证实为新发现的突变脂肪酶基因,其二级结构与标准基因（EU310372）有较大不同。结论：成功分离一株高产脂肪酶的菌株——金黄色葡萄球菌,克隆的脂肪酶基因为新发现的突变型。     

菌落PCR快速鉴定Bcl-2基因及测序

目的克隆大鼠Bcl-2基因(B cell lymphoma)全长cDNA,快速筛选重组pMD18-T-Bcl-2阳性克隆。方法采用RT-PCR的方法从大鼠脾脏组织中扩增全长Bcl-2cDNA,将扩增产物克隆至pMD18-T载体中,用单菌活PCR扩增快速鉴定DNA片段后酶切进一步鉴定及序列分析。结果在筛选的阳性克隆中扩增到大鼠Bcl-2基因,经菌落PCR、酶切鉴定及DNA序列分析证实该序列正确。结论用单菌落PCR扩增快速鉴定克隆在pMD18-T载体上的Bcl-2基因是一种简便、经济的方法。成功克隆了Bcl-2基因,为进一步研究Bcl-2cDNA的基因功能及进行基因治疗奠定了基础。     

间日疟原虫部分乳酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的克隆并测定我国间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)的部分基因序列并进行生物信息学分析。方法根据PvLDH基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从间日疟原虫基因组DNA中扩增LDH基因,定向克隆入pMD18质粒。阳性质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用生物信息学网站www.ncbi.nlm.nih.gov、www.expasy.ch对获得的基因及其推导的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果PCR扩增得到特异的间日疟原虫LDH基因序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的重组质粒。测序结果表明,获得的间日疟原虫LDH基因全长897bp,编码299个氨基酸。DNAMAN预测PvLDH存在10个潜在抗原表位,均与PfLDH的相应预测表位间有同源序列。同源性分析显示,我国间日疟原虫与SalvadorⅠ株和Belem株间日疟原虫的氨基酸序列同源性为99%,与其它疟原虫LDH的同源性为88%～90%。结论成功克隆了我国间日疟原虫LDH基因,其基因序列与其它疟原虫LDH基因序列有高度同源性。     

牙龈卟啉菌蛋白酶rgpA的基因克隆和序列分析

目的:扩增牙龈卟啉菌蛋白酶rgpA催化结构域(rgpAcd)的基因片断并作鉴定。方法:利用PCR方法,克隆牙龈卟啉菌rgpAcd基因,并将基因片断插入pMD18-TVector,通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定。结果:克隆基因测序结果与GeneBank数据库中的序列一致。结论:成功克隆了牙龈卟啉菌rgpAcd的基因,为体外表达其活性蛋白奠定了基础。     

青蒿鲨烯合酶基因及其cDNA的克隆与测序

【目的】克隆青蒿鲨烯合酶基因,为基因工程改造青蒿打下基础。【方法】采用聚合酶链反应(PCR)扩增、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增、扩增片段与T-载体连接和克隆片段的序列分析等方法。【结果】通过PCR扩增和RT-PCR扩增,分别获得3590bp及1257bp片段,克隆后经PCR和酶切反应进行了鉴定。初步测序结果与GenBank上已登录的青蒿鲨烯合酶基因序列同源性为99％,氨基酸序列同源性为100％。【结论】成功克隆了青蒿鲨烯合酶基因及其cDNA。     

铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因的扩增与克隆

目的PCR扩增及克隆铜绿假单胞菌的弹性蛋白酶基因.方法从铜绿假单胞菌培养物中提取染色体DNA,PCR扩增弹性蛋白酶基因成熟蛋白编码区,A-T克隆于pMD 18-T载体中,对重组质粒进行酶切与测序鉴定.结果从高GC含量的铜绿假单胞菌染色体DNA中扩增到弹性蛋白酶基因并进行了克隆与鉴定.结论本研究成功克隆到铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因,为实现活性弹性蛋白酶的高效表达奠定了基础.     

Panton-Valentine杀白细胞毒素(PVL)lukS-PV基因的克隆、原核表达及初步鉴定

目的构建Panton-Valentine杀白细胞毒素(PVL)lukS-PV基因表达载体,并在大肠杆菌中表达相应蛋白。方法提取PVL阳性金黄色葡萄球菌的基因,PCR方法扩增lukS-PV,A-T克隆至pGEM-T载体上,经PCR、双酶切和测序鉴定后,亚克隆到pET28a( )表达载体上,鉴定并转化至Rosetta(DE3)plys表达宿主菌中,用IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE电泳分析和Western blot鉴定。结果构建了lukS-PV-pGEM-T和lukS-PV-pET28a( )重组质粒,经PCR扩增和限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切均得到939bp的目的片段,基因测序与GENEBANK中的PVL的序列一致,宿主菌表达带HIS标签的重组LukS-PV蛋白。结论成功克隆lukS-PV基因和构建重组表达质粒,并在宿主菌中成功表达重组LukS-PV蛋白,为PVL免疫学检测方法的建立奠定基础。     

大鼠心肌组织中细胞间粘附分子-1基因部分CDS克隆

目的：克隆大鼠心肌组织中细胞间粘附分子-1(ICAM-1)基因。方法：采用RT—PCR法,从大鼠缺血性损伤的心肌组织mRNA中扩增出ICAM—1基因部分CDS区片段,克隆人T载体,筛选阳性克隆,酶切鉴定,最后测序鉴定。结果：经RT—PCR法扩增出的特异性产物与预期扩增的片段长度110bp相符,DNA测序结果与GenBank提供的已知序列比较,所克隆的ICAM-1基因片段与目的扩增的序列完全相同,与ICAM-1基因100％同源。结论：采用RT—PCR和T载体技术获得了大鼠心肌组织中ICAM-1基因克隆。     

菌落PCR快速鉴定Bcl-2基因及测序分析

目的 克隆大鼠Bcl-2基因（B cell lymphoma）全长cDNA,快速筛选重组pMD18-T-Bcl-2阳性克隆。方法 采用RT-PCR的方法从大鼠脾脏组织中扩增全长Bcl-2cDNA,将扩增产物克隆至pMD18-T载体中,用单菌活PCR扩增快速鉴定DNA片段后酶切进一步鉴定及序列分析。结果在筛选的阳性克隆中扩增到大鼠Bcl-2基因,经菌落PCR、酶切鉴定及DNA序列分析证实该序列正确。结论 用单菌落PCR扩增快速鉴定克隆在pMD18-T载体上的Bcl-2基因是一种简便、经济的方法。成功克隆了Bcl-2基因,为进一步研究Bcl-2 cDNA的基因功能及进行基因治疗奠定了基础。     

结核分支杆菌扩增体系的建立、优化及评价

目的 建立并优化结核分支杆菌PCR反应扩增体系,并对所建立的体系进行评价。方法根据GenBank找到结核分支杆菌基因序列,在Primer Premier V5．0软件上设计结核分支杆菌特异性引物。并对反应体系中MgCl2、引物、dNTP浓度以及引物退火温度优化后建立结核分支杆菌PCR反应扩增体系。通过对,IB标准株、TB临床分离株和临床阳性标本扩增产物的直接测序、灵敏性试验以及特异性试验对PCR反应体系进行综合评估。结果TBPCR反应体系阳性扩增结果为在琼脂糖凝胶电泳上出现245bp的条带。Mga2、引物以及dNTP在TBPCR体系中优化后最佳终浓度分别为：4mmnol／L、0．04μmol／L以及0．3mmol／L。TBPCR体系的退火温度优化后为55℃。,IB标准株及11B临床分离株和临床阳性标本扩增产物的直接测序结果与GenBank中公布的序列完全一致。TBPCR反应体系对其它细菌无交叉反应。检测限度为10拷贝／止的DNA。结论TB PCR反应体系能够快速对TB标准株、TB临床分离株及临床标本进行结核分支杆菌的鉴别。     

肝细胞癌候选相关基因IDD01的克隆与鉴定

目的鉴定表达序列标签(EST)在肝细胞癌(HCC)和癌旁非癌组织表达,扩增其全长.方法采用半定量RT-PCR方法,对21例HCC患者的癌组织和癌旁非癌组织EST mRNA的表达情况进行检测,通过cDNA末端快速扩增(RACE)技术扩增、测序获得全长,Blast检索GenBank.结果此EST在HCC癌组织中高表达,癌旁非癌组织中低表达(P＜0.05);序列全长为1 333 bp,含有完整开放阅读框(ORF)和Poly(A)尾;Blast检索为一功能未知基因.结论获得一个和HCC相关候选新基因,为进一步研究其功能打下基础.     

人抵抗素基因全长的体外拼接及真核表达载体的构建

目的:利用合成的寡核苷酸片段,在体外拼接人抵抗素(Resistin,Retn)基因的全长,并构建其真核表达载体。方法:根据已知抵抗素基因(GenBank:AF323081),设计并合成10条寡核苷酸片段,采用降落PCR方法进行拼接,获得预期大小的PCR产物后将其克隆入pSecTag2B载体进行测序确认。结果:降落PCR法扩增的特异条带与目的基因的大小一致。克隆载体测序结果与GenBank中已知序列完全符合。结论:降落PCR成功地拼接和扩增了人抵抗素全长基因,并构建了含有该基因的真核表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定了实验基础。     

人碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体的构建及表达

目的: 构建研究人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达载体,并在体外进行表达和检测.方法: 从骨髓基质干细胞中分离总RNA,进行RT-PCR 获得人bFGF cDNA.测序证实其结果正确后,构建真核表达载体.并经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定.利用Blast程序,搜索NCBI GenBank中与重组质粒(pVAX1-bFGF)中编码bFGF基因同源的序列.通过脂质体将重组质粒转染入骨髓基质干细胞,使用间接免疫荧光法进行表达产物检测.结果: 经EcoRⅠ/Pst BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定证实,人bFGF基因成功地克隆到真核表达载体pVAX1中;pVAX1- bFGF中编码bFGF的序列与GenBank中所报道的bFGF编码序列完全一致;间接免疫荧光结果显示转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光.结论: 成功地构建了人bFGF真核表达载体,其可以在体外进行表达.     

幽门螺杆菌napA基因真核表达系统的构建及其在小鼠体内的表达

目的构建幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）napA基因真核表达系统,了解其在小鼠肌细胞中的表达情况。方法根据GenBank中HpnapA基因序列（AF227075）和真核表达质粒多克隆位点序列设计引物,以Hp-RNA逆转录产物为模板,扩增HpnapA编码基因,用基因重组技术将目的基因定向克隆到pcDNA3多克隆位点上,转化大肠杆菌,经质粒扩增和DNA测序后,进行小鼠肌肉免疫、目的基因表达水平和抗体水平检测。结果经双酶切、PCR和测序验证,真核表达质粒HpnapA/pcDNA3构建成功。动物实验结果表明：真核重组质粒在小鼠肌细胞内获良好表达,表达产物能刺激机体产生一定效价的抗体。结论成功构建了HpnapA/pcDNA3真核重组表达质粒;用以免疫小鼠,在小鼠肌细胞内获较好表达并具有免疫原性,有用于疫苗研究的潜在价值。     

锅柄聚合酶链反应法扩增贵阳腐霉Pr1基因上游未知序列

目的：在灭蚊真菌贵阳腐霉Pr1基因已知序列的基础上,利用锅柄聚合酶链反应法扩增Pr1基因上游未知序列。方法首先采用限制性内切酶BamHⅠ对基因组DNA进行完全酶切,用小牛肠碱性磷酸酶去磷酸化后,与5′磷酸化的寡核苷酸链连接,经过变性、链内退火和聚合酶延伸形成锅柄状,最后进行嵌套式PCR。结果获得了Pr1基因已知序列上游864bp核苷酸序列,GenBank登录号为：JQ975036。结论锅柄聚合酶链反应法可以高度有效地扩增与已知位点相邻的基因组片段,是一种可靠的染色体步移法,有利于Pr1基因全长的克隆。     

推定编码嗜麦芽黄单胞菌整合酶类蛋白基因片段的克隆

目的扩增编码嗜麦芽黄单胞菌CG类受体的核酸序列。方法根据Grover报道的嗜麦芽黄单胞菌CG类受体的342 bp部分核酸序列设计的一特异引物P1和随机引物进行PCR扩增，将PCR产物克隆到pUCm-T载体上，对经酶切鉴定筛选的重组质粒上的插入片段进行测序和分析。结果将约500 bp PCR产物克隆到pUCm-T载体上，经酶切鉴定筛选得到重组质粒pUCm-Int。pUCm-Int上插入片段经M13通用引物测序，510 bp克隆片段(GenBank注册号为：AY363962)的410～486 bp与柑橘黄单胞菌质粒pXAC64上的XACb0009基因的9034～8958 bp部分有84％同源序列，由510 bp核酸序列编码的169氨基酸(aa)序列的4～166aa部分与柑橘黄单胞菌XACb0009基因编码的424aa整合酶类蛋白的38～200aa序列有62％同源序列。结论克隆到的510 bp核酸序列可能是编码嗜麦芽黄单胞菌整合酶类蛋白的部分基因序列。     

小鼠前列腺干细胞抗原的原核表达、纯化及抗原活性检测

目的 RT-PCR扩增小鼠前列腺干细胞抗原(mPSCA)基因,构建原核表达质粒pET-42a-mPSCA,诱导mPSCA蛋白表达并纯化,并检测mPSCA蛋白的抗原活性。方法利用RT-PCR的方法从小鼠前列腺癌细胞系RM-1细胞中扩增mPSCA基因,测序正确后PCR的方法去掉mPSCA的信号肽序列将其克隆至原核表达载体pET-42a中构建重组载体pET-42a-mPSCA。将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,随后将表达的融合蛋白进行纯化。经SDS-PAGE分析后,Western blot检测纯化的蛋白,将纯化蛋白进一步包板后用ELISA法对其抗原活性进行评价。结果测序结果证实成功扩增出全长mPSCA基因;酶切和测序结果证实pET-42a-mPSCA原核表达载体构建成功;转化后可以成功诱导并纯化出大小与预期一致的蛋白;Western blot检测证实纯化的蛋白能与特异性的抗体发生反应;ELISA检测显示纯化后的mPSCA抗原具有免疫原性。结论成功扩增出小鼠全长PSCA基因,成功构建了mPSCA基因的原核表达载体,获得了纯化的mPSCA蛋白,该蛋白具有良好的抗原活性,为进一步研究以PSCA为靶点的前列腺癌的免疫治疗奠定了基础。     

副溶血性弧菌耐热直接相关溶血素基因的克隆与序列分析

目的：探讨克隆副溶血弧菌（Vp）耐热直接相关溶血素基因的方法。方法：用PCR技术扩增目的基因，双酶切载体pGEX-3和目的基因DNA，连接并转化大肠杆菌DH5α。对重组质粒进行PCR鉴定、酶切鉴定和序列分析。结果：凝胶电泳显示，标准株Vp14-91基因组DNA的PCR产物长约600bp.阳性克隆的PCR产物也为一长约600bp的条带，经双酶切可切出一约600bp的条带。DNA测序结果表明与GenBank中的序列有99．1％的同源性。结论：利用该方法成功克隆了目的基因，为制备用于现场检测的基因探针和Vp的保护性疫苗以及Vp 的致病机制研究奠定了基础。