骨缺损修复材料煅烧牛骨粉的理化特性

目的:获得具有良好生物相容性和骨引导作用的骨修复材料——煅烧骨粉并探讨其理化特性,为骨缺损修复寻找理想支架。方法：以牛骨为材料,通过煅烧彻底去除其有机成分（相应的抗原性和可能存在的病原微生物）,保留其与人体骨基本一致的无机成分和天然的三维交通结构,经前期处理后煅烧至850℃的牛骨制成颗粒状,通过X-射线衍射、电子探针、电感耦合等离子体原子光谱法、电镜及光电子能谱检测煅烧骨理化特征及化学成分。结果:X-射线（粉末）衍射显示煅烧后牛骨粉的成分为羟基磷灰石(HAP),通过电感耦合等离子体原子光谱法检测煅烧骨未检出氮元素,表明无蛋白、无有机成分;扫描电镜观察显示清晰的天然骨的骨小梁、小梁间隙及骨内管腔系统;孔隙大小为200～850 μm,平均孔隙率为（84.9±0.6）%。 结论:高温煅烧后的牛骨粉主要成分是羟基磷灰石,与骨组织有亲合力,具有三维交通孔隙结构,基本符合骨缺损修复理想支架的要求。     

煅烧骨颗粒大小对兔颅骨缺损引导成骨作用的影响

目的：观察煅烧骨颗粒大小对兔颅骨缺损引导成骨作用，阐明煅烧骨颗粒大小对成骨作用的影响。方法：将煅烧骨颗粒按直径大小分为4组,小颗粒组（0.1~0.3 mm）、中颗粒组(0.3~0.6 mm)、大颗粒组(0.6~0.9 mm)和混合颗粒组(0.1~0.9 mm)，分别植于兔颅骨缺损中，于术后3、6、8和12周取材，采用改良的Gomori特殊染色,观察大体和组织学改变，并测定新骨形成积分光密度（A）值。结果：改良的Gomori染色病理切片，各组均见大量的毛细血管长入以及不同程度的新骨单位生长，小颗粒组和混合颗粒组在第12周均见骨小梁排列的成熟骨痂，各组A值均呈增加趋势。其中小颗粒组、混合颗粒组各时间点的A值均大于中颗粒组和大颗粒组（P< 0.05）；同时第3、6周小颗粒组A值高于
混合颗粒组(P< 0.05)，第9、12周则低于混合颗粒组 (P< 0.05)。结论：不同大小颗粒煅烧骨均有成骨作用；小颗粒组和混合颗粒组成骨效果优于中等颗粒组，但混合颗粒组在修复后期表现为更强的成骨作用，提示煅烧骨颗粒大小可以作为筛选和构建仿生骨支架材料的重要参考指标之一。     

殊异韦荣菌乳酸脱氢酶基因的克隆及鉴定

目的：对殊异韦荣菌(V.dispar)乳酸脱氢酶(LDH)基因及其前后基因进行克隆和鉴定,为龋病的预防和治疗奠定理论基础。方法：提取殊异韦荣菌基因组DNA,利用PCR方法扩增LDH及其前后同源区序列片段,并克隆入pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109,酶切及PCR鉴定后,进行测序。结果：PCR扩增产物特异,全长2...     

殊异韦荣菌sahH基因的克隆、表达和纯化

目的:对殊异韦荣菌S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（sahH）基因进行克隆、鉴定、表达和纯化,为研究龋病的微生物致病机制提供理论依据。方法:提取殊异韦荣菌基因组DNA,采用PCR方法扩增sahH基因序列,构建pET28a-sahH重组质粒，转化到大肠杆菌（E.coli）BL21（DE3）感受态细胞中,酶切、PCR鉴定和测序后，IPTG诱导蛋白表达,并进行分离纯化。结果: PCR扩增产物全长为1 410 bp。测序结果经BLAST软件分析,与GenBank中所报道的绿脓假单胞菌sahH基因序列进行对比分析,其同源性为99%。该基因序列已登陆GenBank,序列号为KC477409。SDS-PAGE分析,重组质粒在E.coli JM109中表达并纯化,得到的融合蛋白相对分子质量约为50 000,诱导5 h蛋白表达量最高,浓缩后蛋白浓度为5.4 g/L。Western blotting法得到的蛋白条带与目的蛋白大小相符。结论:成功克隆了殊异韦荣菌sahH基因,并通过基因序列和氨基酸分析证明其具有完整的阅读框架，且重组载体表达出融合蛋白,分离纯化得到目的蛋白。     

殊异韦荣菌中乳酸脱氢酶重组蛋白的表达、纯化及活性分析

目的 进一步测定殊异韦荣菌中依赖性乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的活性,以期为研究该酶的具体功能及作用机制奠定基础,并为龋病预防和治疗提供新的思路.方法 重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中,采用不同时间及6种不同浓度的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyhhio-β-D-galactoside,IPTG)诱导乳酸脱氢酶蛋白表达,选择最佳条件诱导LDH蛋白表达.并经His-标记蛋白纯化柱(HisTRAP FF柱)提纯,用LDH活性试剂盒测定蛋白活性.结果 pET-28a-LDH转入BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示最适表达条件分别为IPTG终浓度0.4 mmol/L、30℃诱导8h,IPTG终浓度0.4 mmol/L、30 ℃诱导6h.经BandScan 5.0软件分析,pET-28a-LDH质粒转化BL21(DE3)表达相对含量为9.0％,高于Rosetta(DE3)的6.1％;LDH活性试剂盒测定的蛋白活性值为13.79.结论 本项研究获得了LDH蛋白的最适诱导条件,并测出殊异韦荣菌中依赖性LDH的活性,为进一步研究LDH的功能及在龋病防治中的作用奠定了基础.