基于CRISPR/Cas9技术建立敲除OSBPL2基因的HeLa细胞株

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建OSBPL2基因敲除的稳定HeLa细胞株?方法:设计3个单导向RNA(single-guide RNA,sgRNA),分别靶向OSBPL2基因的第2?3和5外显子,以PGK1.1为载体,构建出3个重组真核表达载体?分别转染HeLa细胞后,使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,CruiserTM敲除检测实验和测序共同检验载体靶向效率?选出靶向效率最高的质粒转染HeLa细胞,进行单克隆细胞培养,最后用Western blot 鉴定敲除效果?结果:sgRNA正确插入到PGK1.1载体,靶向第2外显子的重组载体转染HeLa细胞并筛选单克隆后,细胞未检测出OSBPL2蛋白的表达?结论:敲除OSBPL2基因的稳定HeLa细胞株构建成功?     

利用CRISPR/Cas9 系统构建稳定敲除CBX2基因的A549细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除CBX2基因的A549细胞系。方法:设计针对敲除CBX2的short guide RNA（sgRNA）,并克隆到载体PX459中。将测序正确的重组质粒转染到A549细胞中,利用嘌呤霉素筛选转染阳性细胞并分离得到5个单克隆细胞系,通过Western blot方法检测构建的细胞系中CBX2蛋白表达情况。结果:成功构建了靶向CBX2的CRISPR/Cas9重组质粒,筛选出的5个单克隆细胞系中CBX2蛋白表达水平均显著下降。结论:成功利用CRISPR/Cas9 系统构建了稳定敲除CBX2基因的A549细胞系。     

利用CRISPR/Cas9系统构建Lrtm1基因敲除的C2C12细胞系

目的：利用CRISPR/Cas9技术构建稳定敲除Lrtm1（leucine-rich repeats and transmenbrane domains 1）基因的C2C12细胞系,为研究Lrtm1基因的作用提供实验基础。方法：设计3对针对Lrtm1基因的向导RNA（sgRNA）,将sgRNA插入载体pCRISPR-LvSG06中;利用慢病毒包装系统包装含有sgRNA的重组质粒pCRISPR-LvSG06;将病毒感染C2C12细胞,并加入嘌呤霉素筛选,将筛选嘌呤霉素阳性的细胞提取RNA,逆转录成cDNA;设计Cas9引物,利用cDNA为模版,PCR验证C2C12细胞中Cas9的表达,确认慢病毒成功感染C2C12细胞;利用96孔板挑选单克隆细胞的方法筛选得到单克隆细胞;将扩增的单克隆细胞提取基因组DNA,测序Lrtm1基因相关序列并与野生型Lrtm1基因进行对比,确认敲除成功的克隆细胞株;诱导敲除Lrtm1稳定细胞株成肌分化,检测成肌分化标志因子Myosin的蛋白表达,RT-PCR检测转录因子PAX7的mRNA表达,Western blot检测H3K27me3蛋白水平。结果：测序结果显示向导RNA（sgRNA）成功插入载体质粒;将单克隆细胞DNA测序结果显示A和C克隆成功敲除Lrtm1基因;敲除Lrtm1基因后成肌分化标志因子Myosin蛋白表达降低,成肌转录因子PAX7 mRNA的表达降低,在分化72和96 h组,H3K27me3蛋白水平较野生型组增高。结论：利用CRISPR/Cas9技术成功敲除Lrtm1基因,稳定敲除Lrtm1基因的C2C12细胞系构建成功;敲除Lrtm1后能抑制C2C12细胞成肌分化,并且抑制成肌转录因子PAX7的mRNA表达,PAX7 mRNA表达降低的原因可能为H3K27me3水平增高。     

利用改良的CRISPR/Cas9基因编辑系统构建HeLa细胞SND1基因敲除稳定株

目的:利用改良的CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除HeLa细胞中SND1基因,构建HeLa细胞SND1基因敲除稳定株。方法:设计一对特异性识别SND1基因第二个启动子的上下游sgRNA,以PX462质粒为载体,构建出一对重组真核表达质粒。酶切和测序鉴定后,将一对重组质粒共同转染进入HeLa细胞中,使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,挑取单克隆细胞进行培养。最后用Western Blot鉴定敲除效果。结果:sgRNA正确插入到PX462质粒载体中,转染并筛选单克隆后的细胞中没有SND1蛋白的表达。结论:成功构建出HeLa细胞SND1基因敲除稳定株。     

CRISPR/Cas9介导的猪Six1和Six4基因敲除细胞系的建立

目的：利用干细胞囊胚互补技术再生同种或异种动物器官已得到验证,其重要的前提是需要构建出相应的器官缺失动物模型。本文拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立猪Six1单基因和Six1/Six4双基因敲除猪细胞系,为构建肾脏发育缺陷和缺失猪模型奠定重要的研究基础。方法：选取猪Six1基因和Six4基因第一外显子为敲除靶点,分别设计并合成单导向RNA（single guide RNA,sgRNA）,将其插入含有Cas9骨架的PX330质粒,分别构建Six1基因和Six4基因敲除打靶载体PX330?sgRNA1和PX330?sgRNA4;用T7EN1酶验证打靶载体敲除效率后,将高效打靶载体与含G418抗性的质粒（pCMV?tdTomato）共转染原代猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblasts,PFFs）中,并通过药物筛选获得单克隆细胞群落,随后对单克隆细胞进行基因型鉴定。结果：分别成功构建Six1和Six4基因的Cas9/sgRNA表达载体。转染Six1基因打靶载体经药物筛选后,利用PCR方法鉴定所获得的Six1基因敲除单克隆细胞系48个,其中Six1-/-细胞系21个。通过同样方法同时转染Six1基因和Six4基因打靶载体,经药物筛选后共获得44个单克隆细胞系,其中Six1-/- Six4-/-细胞系为13个。结论：通过CRISPR/Cas9基因编辑技术可高效获得Six1单基因敲除细胞系和Six1/Six4双基因敲除细胞系,为构建肾脏发育缺陷猪动物模型提供了基础,并有助于研究Six1和Six4基因在猪肾脏发育中的功能。     

人/猪OSBPL2同源性比较及猪PFFs靶基因敲除细胞系的建立

目的：基于CRISPR/Cas9技术构建猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblasts,PFFs）OSBPL2敲除细胞系,为构建小型猪致聋基因缺陷动物模型奠定重要的前期工作基础。方法：首先通过生物信息学方法对人与猪OSBPL2基因共线性和同源性进行分析,预测并模拟人与猪OSBPL2蛋白质二级、三级结构。其次,设计合成靶向猪OSBPL2第5、6外显子设计单导向RNA（single guide RNA,sgRNA）,以pX330质粒为载体,构建含有Cas9骨架的重组载体,转染至猪PFFs中,G418药物筛选阳性单克隆细胞。最后,T7EN1酶切实验检测靶向效率,序列分析检测单克隆细胞基因型。结果：生物信息学分析结果表明人与猪的OSBPL2在染色体上具有较好的共线性关系,蛋白质氨基酸同源性高达88%,且具有相似的功能结构域。成功构建打靶OSBPL2基因的Cas9/sgRNA表达载体,转染PFFs细胞,药物筛选获得OSBPL2基因双敲的单细胞克隆并测序证实了基因突变型。结论：人和猪OSBPL2基因具有高度的同源性。构建成功的Cas9/sgRNA表达载体在PFFs中预期实现了OSBPL2基因编辑并获得基因双敲的单细胞克隆,为后续OSBPL2基因敲除猪模型构建提供了必需的实验材料。     

人/猪SERPING1同源性比较及猪SERPING1敲除细胞系的建立

目的 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立SERPING1^-/-猪胎儿成纤维细胞(PFFs)系,为构建遗传性血管性水肿模型提供细胞实验材料。方法 首先比较人/猪SERPING1氨基酸同源性。其次,分析猪SERPING1基因有效的编码区,据此选择第八外显子为敲除靶点,设计并合成靶向猪SERPING1的单导向RNA(sgRNA),连接到含有Cas9核酸内切酶的pX330载体上,构建SERPING1打靶载体pX330sgRNA,将其转染至猪胎儿成纤维细胞中,G418药物筛选阳性单克隆细胞。最后,用T7E1酶切实验检测靶点编辑情况,测序验证单克隆细胞基因型。结果 生物信息学分析结果提示人/猪SERPING1蛋白氨基酸同源性较高,氨基酸比对相似性达到65.87%。成功构建打靶SERPING1的载体,并转染到细胞,药物筛选获得SERPING1基因敲除的单克隆细胞,测序确认了突变的基因型。结论 人/猪SERPING1蛋白同源性较高,适合用于构建遗传性血管性水肿模型。构建的Cas9/sgRNA表达载体实现了SERPING1基因编辑,获得基因敲除的单细胞克隆,为后续SERPI...     

应用CRISPR/Cas9技术制备Vasohibin-2基因敲除小鼠模型及验证

目的:利用Cas9/RNA system gene targeting技术高效构建Vash2基因敲除小鼠模型?方法:根据Vash2基因序列,设计2对Vsah2基因的单链向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)引物序列并克隆进入pU57-T7-GDNA载体?利用T7 RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9 mRNA?将体外转录的gRNA/Cas9 mRNA显微注射入小鼠受精卵,通过PCR和基因测序对Vash2移码突变进行检测和鉴定?繁育Vash2基因敲除小鼠并分析后代突变情况?结果:顺利构建表达sgRNA载体并体外转录,成功将有活性的sgRNA和Cas9 mRNA直接注射入受精卵?基因测序鉴定获得5只F0代初建鼠?选取5号鼠与野生型鼠回交,得到F1代鼠,再相互交配得到F2代鼠?PCR显示F2代鼠Vash2基因移码突变,成功建立Vash2基因敲除小鼠模型并传代繁育? 结论:通过Cas9/RNA systemgene targeting技术可以成功制备Vash2基因敲除鼠模型,是用于Vash2研究的有效工具?     

定量诱导表达PRDM1永久细胞系的建立

目的建立可定量诱导表达PRDM1的永久细胞系,为进一步研究PRDM1的功能创建平台。方法将野生型PRDM1基因的cDNA全长克隆到pMEP4表达质粒中,电穿孔法将pMEP4-PRDM1瞬时转染到细胞系SALT3,经潮霉素B筛选后挑选可增殖的单克隆细胞并大量扩增,在不同浓度的硫酸镉（CdSO4）诱导下检测PRDM1蛋白的表达状况。结果成功构建了pMEP4-PRDM1表达载体,在最佳电穿孔条件下将其转染到SALT3细胞,经潮霉素B筛选后扩增出6个细胞克隆。CdSO4诱导后运用免疫印迹法验证了PRDM1蛋白的表达与诱导剂CdSO4存在量效关系。结论运用pMEP4载体可建立定量诱导表达目的基因PRDM1的永久细胞系,为进一步研究PRDM1的功能奠定了基础。     

利用CRISPR/Cas9技术构建Aff4基因敲除B16-F10细胞系及AFF4的多克隆抗体制备

目的：利用CRISPR/Cas9技术构建ALF转录伸长因子4(AFF4)基因敲除的小鼠黑色素瘤细胞（B16-F10），自主制备特异的AFF4多克隆抗体。方法：设计一对分别靶向小鼠Aff4基因第3个外显子和第4个内含子的向导RNA(sgRNA)。将构建成功的重组质粒转染至B16-F10细胞中，并利用抗性筛选出单克隆细胞，进行基因型鉴定和AFF4表达水平检测。验证自主制备的AFF4多克隆抗体的特异性。结果：通过基因组DNA鉴定获得两株正确的单克隆细胞系，其Aff4基因m RNA水平（t=53.08,P<0.001）和AFF4蛋白表达水平（t=15.17,P<0.001）显著降低。免疫共沉淀实验和蛋白免疫印迹实验证明自主制备的抗人/鼠AFF4多克隆抗体特异性良好（t=264.7,P<0.000 1）。结论：成功构建了Aff4基因敲除的B16-F10稳定细胞系，并且成功制备抗AFF4蛋白的多克隆抗体。     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。     

妊娠晚期重度妊高征的监测

重度妊高征表现为高血压、蛋白尿、浮肿等症状 ,严重可以导致母婴死亡。对妊娠足月的重度妊高征 ,可以根据其临产与否及宫颈条件 ,立即决定其为阴道分娩或是剖宫产术。对于妊娠晚期的重度妊高征 ,因其胎龄不足月 ,胎儿生长发育及胎肺成熟度情况需通过一定时间的治疗 ,根据其病情变化来决定其治疗方案或终止妊娠的时机[1,2 ] 。这就需要我们对这一阶段的治疗进行监测 ,防止母儿并发症的发生。现将 2 0 0 0年至今我院收治妊娠晚期重度妊高征 30例的监测结果回顾分析如下。1　资料和方法1.1　研究对象　选择孕 31～ 36周重度妊高征 30例 ,其中 …     

80例局限性银屑病误诊原因分析

本文报告80例局限于小腿或手或足的银屑病。均经皮肤组织病理检查确诊。因部位比较特殊。受多种理化因素影响,使皮疹形态发生轻重程度不同的变化,常看不到典型损害,因而误诊为神经性皮炎,湿疹,慢性皮炎及癣等。作者对误诊原因进行了分析后,提出了鉴别诊断方法。     

腰椎间盘突出症再次手术的原因分析

目的解决腰椎间盘突出症手术中神经压迫。方法对1980～1998年再手术资料进行统计分析,讨论分析再手术原因,再次手术前影像学检查,观察病理变化以确定再手术方法。结果对11例随访6个月～1年,优7例(68．4％),良3例(36．8％),差1例(2．8％)。结论初次手术前详细查体和分析X线片,术中用导尿管和神经剥离探查,尽量避免髓核遗留,手术范围不宜太大,尽量减少对软组织和脊柱结构的破坏,避免形成硬膜囊与神经根粘连而致单纯形疤痕。     

尿液pH值对红细胞检验影响的探讨

[目的 ]通过尿液 pH值对红细胞检验影响的观察 ,更加科学、准确地诊断血尿和血红蛋白尿。[方法 ]采用干化学分析仪检测和尿液显微镜红细胞计数 ,观察 180例正常人尿标本加入正常人血标本后 ,不同 pH值 ,不同时间内 ,观察红细胞溶解情况。 [结果 ]pH <5 .5以下时 ,随着时间的延长 ,红细胞溶解现象明显。 1h后观察有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;2h后有非常显著性差异 (P <0 .0 1)。[结论 ]pH <5 .5时对红细胞计数影响较大 ,易致红细胞发生溶解现象 ,出现假性血红蛋白尿 ,对血尿和血红蛋白尿很难区分 ,给临床诊断造成不便 ,更易引起漏诊和误诊。     

喉癌主癌灶手术切缘的临床特点分析

目的探讨研究喉癌主癌灶手术的安全切缘在临床上的特点。方法回顾性分析2007年6月—2011年3月已经确诊喉癌的患者100例,随机分成A、B两组,A组为观察组50例,主要采取手术切缘后,然后采取镜下观察分析;B组为观察组50例,主要采取手术切缘后,然后采取肉眼观察分析,将结果进行临床特点分析比较。结果早期的喉癌患者和晚期的喉癌患者的阳性切缘例数,差异无统计学意义（P〉0.05）;晚期的阳性切缘发生次数高于早期的阳性切缘发生次数,差异有统计学意义（P〈0.05）。声门上区[SG]2、3和5、10mm;跨声门型[TG]2、3mm和5、10mm的切缘对比,差异有统计学意义（P〈0.05）。SG、G、TG、IG的2mm和3mm,5mm和10mm对,差异无统计学意义（P〉0.05）。肉眼阳性切缘观察39个,镜下阳性切缘观察43,两者差异无统计学意义（P〉0.05）。结论依据原发不同部位、不同分期和不同范围选取适合的切线,就可以有效地减少阳性切缘的发生。     

儿童腹痛328例病因诊断及分析

目的：根据儿童急性腹痛的特点，诊断儿童腹痛应综合临床及相关检查提供的依据，做出准确诊断，给予适当治疗。方法：对临床328例腹痛患儿进行选择性辅助检查和分析。结果：小儿腹痛病因复杂，腹腔内疾病占64．63％，共17种病因；腹腔外疾病占35．37％，共6种病因。结论：仔细询问病史、认真体格检查、密切观察病情、针对性地选择辅助检查，在儿童腹痛的诊断上具有重要的意义。     

87株幽门螺旋杆菌VacA等位基因的分析

目的以研究方法LiPA（Line Probe Assay）分析VacA等位基因的表达,了解幽门螺旋杆菌致病机理的理解。方法从三个不同城市87位进行胃镜检查患者的胃粘膜中培养出幽门螺旋杆菌,提取DNA,用LiPA方法分析VacA等位基因。结果（1）87位患者以sic（88．5％）和m2a（63．2％）分布为主,未发现s1b和s2;（2）混合菌株感染率为41．4％,远远高于西方国家,其中上海的混合感染率最高（62．5％）,与北京（41．0％）和南宁（20．8％）相比具有显著性差异,P〈0．01;（3）北京、海、南京三个不同城市s1、m等位基因亚型分布率存在差异;（4）溃疡病和非溃疡病患者m1和m2的分布率没有显著性差异。结论我国幽门螺旋杆菌多重菌株感染率较高,不同的m基因型与消化性溃疡的发生无显著性相关。