人/猪OSBPL2同源性比较及猪PFFs靶基因敲除细胞系的建立

目的：基于CRISPR/Cas9技术构建猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblasts,PFFs）OSBPL2敲除细胞系,为构建小型猪致聋基因缺陷动物模型奠定重要的前期工作基础。方法：首先通过生物信息学方法对人与猪OSBPL2基因共线性和同源性进行分析,预测并模拟人与猪OSBPL2蛋白质二级、三级结构。其次,设计合成靶向猪OSBPL2第5、6外显子设计单导向RNA（single guide RNA,sgRNA）,以pX330质粒为载体,构建含有Cas9骨架的重组载体,转染至猪PFFs中,G418药物筛选阳性单克隆细胞。最后,T7EN1酶切实验检测靶向效率,序列分析检测单克隆细胞基因型。结果：生物信息学分析结果表明人与猪的OSBPL2在染色体上具有较好的共线性关系,蛋白质氨基酸同源性高达88%,且具有相似的功能结构域。成功构建打靶OSBPL2基因的Cas9/sgRNA表达载体,转染PFFs细胞,药物筛选获得OSBPL2基因双敲的单细胞克隆并测序证实了基因突变型。结论：人和猪OSBPL2基因具有高度的同源性。构建成功的Cas9/sgRNA表达载体在PFFs中预期实现了OSBPL2基因编辑并获得基因双敲的单细胞克隆,为后续OSBPL2基因敲除猪模型构建提供了必需的实验材料。     

ApoE敲除导致小鼠耳蜗螺旋神经元功能损伤

目的：探究载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)基因缺陷引起小鼠耳蜗螺旋神经节处听神经损伤的可能机制。方法：对ApoE基因敲除(ApoE^-/-)小鼠进行听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)检测,并分析波群振幅及延迟期。免疫荧光及HE染色分析耳蜗螺旋神经节内听神经及带状突触的病理损伤情况。蛋白质印迹、qRT-PCR等实验检测Lim激酶1 (LIM domain kinase 1,Limk1)、丝切蛋白1(cofilin1)蛋白表达及磷酸化水平,并检测磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositide 3- kinases,PI3K)通路激活情况。结果：ApoE-/-小鼠ABR检测中波Ⅰ的振幅缩短,延迟期延长。螺旋神经节处染色结果显示ApoE^-/-小鼠带状突触及听神经纤维数量减少,并伴随结构受损。Western blot、qRT-PCR及免疫荧光染色发现Limk1与cofilin1在ApoE 敲除后蛋白磷酸化水平出现显著性下降,同时PI3K通路激活被抑制。结论：ApoE基因缺陷会引起耳蜗螺旋神经节处带状突触及听神经损伤,并可能与神经元肌动蛋白细胞骨架密切相关。     

USP14调控OSBPL2蛋白去泛素化作用的实验研究

目的：研究泛素特异性蛋白酶14（ubiquitin?specific peptidase 14,USP14）通过调控氧化固醇结合样蛋白2（oxysterol binding protein?like 2,OSBPL2）的泛素化水平稳定OSBPL2表达的分子机制。方法：以HeLa细胞为工具细胞,通过对USP14过表达、敲降以及活性抑制,检测OSBPL2的表达水平;采用体外过表达实验考察USP14对OSBPL2的泛素信号和泛素化水平的调控;采用免疫共沉淀（co?immunoprecipitation,Co?IP）阐明USP14与OSBPL2相互作用的具体结构域、不同结构域在蛋白相互作用中的作用以及OSBPL2的关键泛素化位点。结果：USP14与OSBPL2存在相互作用关系并稳定OSBPL2的表达而不改变其转录水平;体外过表达和Co?IP实验结果表明,USP14催化（catalytic,CAT）结构域与OSBPL2氧固醇结合蛋白相关结构域（OSBP?related domain,ORD）的相互作用降低OSBPL2的泛素化水平;类泛素（ubiquitin?like,UBL）结构域在USP14与OSBPL2相互作用中起到了促进作用;Lys209和Lys361是OSBPL2泛素化和去泛素化的关键位点。结论：USP14通过调控OSBPL2蛋白Lys209和Lys361两个位点的泛素化进而调控其泛素化水平,稳定OSBPL2蛋白的表达。     

GPRASP2基因编辑猪胎儿成纤维细胞系的建立

目的：采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建G蛋白偶联受体相关分选蛋白2（G protein?coupled receptor associated sorting protein 2,GPRASP2）基因敲除的猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblast,PFF）,为构建GPRASP2基因敲除巴马小型猪模型提供相应的供体细胞。方法：采用生物信息学方法对人与猪GPRASP2基因进行亲缘性和同源性分析,预测人与猪GPRASP2基因编码的氨基酸序列和蛋白二级结构;设计合成靶向巴马猪GPRASP2基因编码区上游和下游的单导向RNA（single guide RNA,sgRNA）,以pX330质粒为载体,构建含有Cas9骨架的重组打靶质粒,并将此重组质粒转染至PFF中,G418药物筛选阳性单克隆细胞,测序分析其基因型。结果：生物信息学分析提示人/猪GPRASP2亲缘关系相近,同源性较高,且主要功能结构域Arm2的二维和三维结构相似。构建了靶向猪GPRASP2基因的重组打靶质粒并转染PFF,通过药物筛选、基因型分析和Western blot验证,成功获得GPRASP2基因敲除单克隆PFF。结论：人/猪GPRASP2基因亲缘关系相近且高度同源;采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术成功构建GPRASP2基因敲除的单克隆PFF,为建立GPRASP2基因敲除巴马小型猪模型奠定了前期基础。