人/猪OSBPL2同源性比较及猪PFFs靶基因敲除细胞系的建立

目的：基于CRISPR/Cas9技术构建猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblasts，PFFs）OSBPL2敲除细胞系，为构建小型猪致聋基因缺陷动物模型奠定重要的前期工作基础。方法：首先通过生物信息学方法对人与猪OSBPL2基因共线性和同源性进行分析，预测并模拟人与猪OSBPL2蛋白质二级、三级结构。其次，设计合成靶向猪OSBPL2第5、6外显子设计单导向RNA（single guide RNA，sgRNA），以pX330质粒为载体，构建含有Cas9骨架的重组载体，转染至猪PFFs中，G418药物筛选阳性单克隆细胞。最后，T7EN1酶切实验检测靶向效率，序列分析检测单克隆细胞基因型。结果：生物信息学分析结果表明人与猪的OSBPL2在染色体上具有较好的共线性关系，蛋白质氨基酸同源性高达88%，且具有相似的功能结构域。成功构建打靶OSBPL2基因的Cas9/sgRNA表达载体，转染PFFs细胞，药物筛选获得OSBPL2基因双敲的单细胞克隆并测序证实了基因突变型。结论：人和猪OSBPL2基因具有高度的同源性。构建成功的Cas9/sgRNA表达载体在PFFs中预期实现了OSBPL2基因编辑并获得基因双敲的单细胞克隆，为后续OSBPL2基因敲除猪模型构建提供了必需的实验材料。

Homology comparison between human and pig OSBPL2 and establishment of pig PFFs with target gene knockout