利用CRISPR/Cas9技术构建ACE2基因修饰的猪胎儿成纤维细胞系

目的：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)基因编辑的长白猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF)细胞系,为构建新型冠状病毒即严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 型(se- vere acute respiratory syndrome coronavirus type 2,SARS-CoV-2)不易感猪模型提供实验材料。方法：①利用生物信息学方法对大鼠和鸡的ACE2氨基酸序列进行比对,将大鼠ACE2与SARS-CoV-2 S蛋白相互作用的关键氨基酸残基替换为鸡ACE2的氨基酸残基,设计嵌合的ACE2基因并构建ACE2基因敲入供体。②设计并合成靶向猪ACE2基因的sgRNA,克隆到pX330载体上构建ACE2基因打靶载体。③将ACE2打靶载体和ACE2基因敲入供体以及Neomycin抗性质粒共转染至长白猪PFF细胞,筛选G418抗性单细胞克隆并进行测序鉴定。结果：根据氨基酸序列比对结果,将大鼠ACE2蛋白的第19、31、34、35、42、353、354位氨基酸残基替换为鸡ACE2的氨基酸残基,设计合成了嵌合的ACE2基因。G418抗性单细胞克隆基因型分析结果显示获得了阳性单细胞克隆。结论：利用CRISPR/Cas9技术成功获得了内源ACE2基因敲除、嵌合ACE2敲入的长白公猪PFF细胞系,为构建SARS-CoV-2不易感猪模型奠定了基础。     

人/猪SERPING1同源性比较及猪SERPING1敲除细胞系的建立

目的 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立SERPING1^-/-猪胎儿成纤维细胞(PFFs)系,为构建遗传性血管性水肿模型提供细胞实验材料。方法 首先比较人/猪SERPING1氨基酸同源性。其次,分析猪SERPING1基因有效的编码区,据此选择第八外显子为敲除靶点,设计并合成靶向猪SERPING1的单导向RNA(sgRNA),连接到含有Cas9核酸内切酶的pX330载体上,构建SERPING1打靶载体pX330sgRNA,将其转染至猪胎儿成纤维细胞中,G418药物筛选阳性单克隆细胞。最后,用T7E1酶切实验检测靶点编辑情况,测序验证单克隆细胞基因型。结果 生物信息学分析结果提示人/猪SERPING1蛋白氨基酸同源性较高,氨基酸比对相似性达到65.87%。成功构建打靶SERPING1的载体,并转染到细胞,药物筛选获得SERPING1基因敲除的单克隆细胞,测序确认了突变的基因型。结论 人/猪SERPING1蛋白同源性较高,适合用于构建遗传性血管性水肿模型。构建的Cas9/sgRNA表达载体实现了SERPING1基因编辑,获得基因敲除的单细胞克隆,为后续SERPI...     

五指山小型猪近交系异种移植产业化研发进展

为了早日实现五指山小型猪(WZSP)近交系异种移植产业化目标,努力推进近交繁育获得近交系,同时开展克服异种移植免疫排斥和猪内源性逆转录病毒(PERV)传染生物安全性两大难题的研发内容。本文从WZSP近交系双基因敲除克隆猪繁育成功、猪-猴异种角膜内皮移植取得突破性进展、WZSP近交系PERV无传染性群体建立、WZSP近交系是理想的动物模型和异种移植供体等方面,介绍WZSP近交系异种移植产业化的研发进展。     

ADPRT-MEDIATED DECREASE OF CELLULAR NAD CONTENT AND THE DETECTION OF CHEMICALLY INDUCED DNA DAMAGE DEVELOPMENT OF A NEW SHORT-TERM SCREENING TEST FOR MUTAGENS

It was found that the DNA-damaging agents N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG),methyl-methanesulphonate(MMS)and 4-nitroquinoline-N-oxide(4NQO)could stimulate ADP-ribosyl transferase(ADPRT)activity and reduce the cellular NAD content in a dose-dependent way.The reduction of NAD after DNA damage could be partially or completelyprevented by ADPRT inhibitors,3-aminobenzamide or nicotinamide,which showed noinfluence on reduction of NAD induced by metabolic blocking agents.Therefore,a simpleand specific method to detect DNA-damaging mutagens by measuring ADPRT-mediateddecrease of cellular NAD content was explored.Using β-naphthofiavone,a mixed functionoxygenase inducer,together with induced or uninduced human amnion FL cells,it was foundthat aflatoxin B_1,benzo(a)pyrene,2-acetylaminofluorene,9,10-dimethylanthracene andethylcarbamate could induce the ADPRT-mediated decrease of cellular NAD content,while4-acetylaminofluorene,anthracene,isopropyl-N-(3-chlorophenyl)-carbamate,β-propiolactone,γ-butyrolactone,cyclophosphamide and safrol could not.The results indicate that this isa cheap and specific method to detect DNA damage caused by chemical carcinogens/mutagenswith a spccificity approaching that of the unscheduled DNA synthesis assay.     

(ADPR)_n与真核细胞的DNA修复

多聚ADP-核糖[(ADPR)_n]是六十年代新发现的普遍存在于真核细胞核内的一类核酸大分子。它由一种特异的核内酶——多聚ADP-核糖聚合酶或称ADP-核糖基转移酶(AD PRT)以尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)为底物催化生成。近二十年来,各国学者对(ADPR)_n的结构,功能进行了广     

人卵原细胞中DNA甲基化与X染色体失活

赖昂假说认为,在雌性哺乳动物体细胞中,有一条X染色体高度固缩,在遗传上没有功能。以后,这个假说得到多方面的证实。关于X染色体失活的一个解释是该染色体在甲基化后抑制了染色体上基因的活性。所以对人卵原细胞中的甲基化现象进行了研究,以弄清楚当X染色体出现失活时,其胚胎发育的真实情况如何。     

机体保护多肽对大鼠重复给药毒性研究

目的检测机体保护多肽（HuBPP）对大鼠产生的毒性反应,为临床提供无毒性反应剂量,从而为临床更安全地用药以及不良反应的监控提供参考信息。方法80只SD大鼠单次静脉和肌内注射给药以确认给药剂量。选择0.2 mg/kg、1 mg/kg和4 mg/kg为本次实验的低、中、高剂量,并设置溶媒对照组,每组30只大鼠,雌雄各半。连续肌内注射给药一个月,实验期间观察大鼠质量、摄食量等指标,给药末期和恢复期采血检测各临床指标,病理学检测各主要脏器毒性变化。结果急性毒性实验表明,20 mg/kg给药剂量下,实验组与对照组相比各观察指标未发现明显改变。长期毒性实验结果表明,与对照组相比,各剂量组大鼠质量、摄食量、主要脏器指标均未发现明显毒性反应（P>0.05）。长期毒性实验给药结束后,高剂量组雌鼠MCHC高于溶媒对照组,MPV低于溶媒对照组（P < 0.01和P < 0.05）;中剂量对照组雌鼠TG高于溶媒对照组,Na+浓度低于溶媒对照组（P < 0.05）;雄鼠高、中剂量组活化部分凝血活酶时间显著低于溶媒对照组（P < 0.05）,高剂量组Cl-浓度显著高于溶媒对照组（P < 0.05）。恢复期结束后高剂量组雄鼠红细胞体积分布宽度值低于溶媒对照组（P < 0.05）,低剂量组雌鼠丙氨酸氨基转移酶、血糖、三酰甘油显著高于溶媒组（P < 0.05~P < 0.01）,但均处于文献报道正常变化范围内;其他指标差异无统计学意义。结论在本实验条件下,HuBPP对大鼠的相对安全剂量为4 mg/kg及其以下剂量。     

人/猪OSBPL2同源性比较及猪PFFs靶基因敲除细胞系的建立

目的：基于CRISPR/Cas9技术构建猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblasts,PFFs）OSBPL2敲除细胞系,为构建小型猪致聋基因缺陷动物模型奠定重要的前期工作基础。方法：首先通过生物信息学方法对人与猪OSBPL2基因共线性和同源性进行分析,预测并模拟人与猪OSBPL2蛋白质二级、三级结构。其次,设计合成靶向猪OSBPL2第5、6外显子设计单导向RNA（single guide RNA,sgRNA）,以pX330质粒为载体,构建含有Cas9骨架的重组载体,转染至猪PFFs中,G418药物筛选阳性单克隆细胞。最后,T7EN1酶切实验检测靶向效率,序列分析检测单克隆细胞基因型。结果：生物信息学分析结果表明人与猪的OSBPL2在染色体上具有较好的共线性关系,蛋白质氨基酸同源性高达88%,且具有相似的功能结构域。成功构建打靶OSBPL2基因的Cas9/sgRNA表达载体,转染PFFs细胞,药物筛选获得OSBPL2基因双敲的单细胞克隆并测序证实了基因突变型。结论：人和猪OSBPL2基因具有高度的同源性。构建成功的Cas9/sgRNA表达载体在PFFs中预期实现了OSBPL2基因编辑并获得基因双敲的单细胞克隆,为后续OSBPL2基因敲除猪模型构建提供了必需的实验材料。     

利用CRISPR/Cas9建立PIN1基因敲除的成体神经干细胞系

目的：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除成体神经干细胞（neural stem cell,NSC）PIN1基因,建立PIN1基因敲除的成体神经干细胞系。方法：取8周龄C57BL/6小鼠脑室下区的脑组织进行体外培养;设计靶向小鼠PIN1基因的单导向RNA（single guide RNA,sgRNA）,以PX330质粒为骨架,构建PIN1的Cas9打靶载体,转染小鼠的成体神经干细胞,通过puro筛选和测序鉴定获得PIN敲除的单克隆细胞;利用免疫荧光染色和Western blot测定PIN1蛋白表达水平,免疫荧光染色鉴定神经干细胞的特征性标志物巢蛋白（Nestin）的表达,Beta Ⅲ Tubulin免疫荧光染色鉴定神经干细胞分化为神经元的能力。结果：成功构建PIN1基因的Cas9/sgRNA表达载体,转染后获得PIN1敲除的神经干细胞克隆9个。免疫荧光染色及Western blot显示PIN1蛋白无表达,免疫荧光染色显示PIN1敲除的神经干细胞Nestin阳性,神经干细胞分化培养时可部分分化为Beta Ⅲ Tubulin阳性的神经元细胞。结论：CRISPR/Cas9基因编辑技术可实现对小鼠成体神经干细胞PIN1基因的编辑。在PIN1基因敲除后PIN1蛋白无表达,初步表型分析显示,神经干细胞仍表达特征性标志物Nestin,并具有向神经元分化的能力。     

MicroRNA在同种及异种移植免疫排斥监测中的研究进展及应用前景

细胞、组织及器官移植是治疗器官功能衰竭、癌症等重大疾病直接有效的治疗策略。免疫排斥是同种及异种移植研究领域中难以彻底攻克的难题,因此对移植受体免疫排斥反应的实时监测尤为重要,针对同种及异种移植开发具有特异度高、早期灵敏度高、非侵入、快速等优点的生物标志物及其监测方法非常迫切。微小核糖核酸(miRNA)在免疫细胞的生成、发育以及免疫性功能中发挥重要的作用。本文对常规免疫排斥监测方法的局限性、miRNA的生物学特性以及miRNA在同种和异种移植免疫排斥中的应用进行总结,以探讨miRNA在同种和异种移植免疫排斥监测中的应用前景。