鬼针草及其近缘种的分子鉴定和亲缘关系研究

目的 构建鬼针草Bidens pilosa及其与近缘种之间系统发育关系,准确鉴别鬼针草及其近缘种。方法 提取鬼针草及其近缘种DNA,对核基因ITS片段和叶绿体基因psbA-trnH序列扩增和测序,计算物种种内、种间Kimura 2-parameter （K2P）遗传距离。采用最近距离、相似性搜索、构建Neighbor-joining（NJ）系统聚类树3种方法进行鉴定分析。结果 ITS和psbA-trnH分子系统树支持鬼针草不同居群样本聚为一单系分支,支持率为79%和87%;其中,鬼针草与白花鬼针草构成一单系分支,金盏银盘与婆婆针构成姐妹群分支,上述两分支ITS和联合数据支持率均为100%;狼把草与柳叶鬼针草、大狼把草构成一单系分支（ITS和联合数据支持率为100%,psbA-trnH数据支持率为96%）。鬼针草及其近缘种种间ITS和psbA-trnH序列的遗传距离为0.007 94～0.128 80和0.005 18～0.074 52,均远大于鬼针草种内遗传距离0～0.001 59和0～0.002 52。结论 鬼针草与白花鬼针草亲缘关系最近,金盏银盘与婆婆针构成姐妹群关系,狼把草与柳叶鬼针草、大狼把草亲缘关系较近。ITS和psbA-trnH序列可以准确鉴别鬼针草及其近缘种。     

碎米桠及其近缘种的分子鉴定和亲缘关系研究

目的 构建碎米桠Isodon rubescens及其与近缘种之间系统发育关系,准确鉴别碎米桠及其近缘种。方法 提取碎米桠及其近缘种DNA,对核基因ITS片段和叶绿体基因psbA-trnH序列扩增和测序,计算物种种内、种间Kimura 2-parameter（K2P）遗传距离。采用最近距离、相似性搜索、构建Neighbor-joining（NJ）系统聚类树3种方法进行鉴定分析。结果 ITS和psbA-trnH分子系统树支持碎米桠5个居群样本聚为一单系分支,支持率为94%和68%;其中,碎米桠与毛叶香茶菜、香茶菜和内折香茶菜聚在一支,支持率为70%和51%;溪黄草和显脉香茶菜构成姐妹群分支,支持率为81%和63%。碎米桠及其近缘种种间ITS和psbA-trnH序列的K2P遗传距离为0.007 08～0.072 61和0.008 06～0.024 76,均远大于碎米桠种内的遗传距离0～0.001 76和0～0.002 68。结论 碎米桠与毛叶香茶菜、香茶菜和内折香茶菜亲缘关系较近,溪黄草和显脉香茶菜亲缘关系最近。ITS和psbA-trnH序列可以准确鉴别碎米桠及其近缘种。     

娑罗子基原物种的DNA条形码鉴定研究

目的 筛选出适用于鉴定七叶树属药用植物的条形码序列。方法 考察了七叶树属10个物种42份样品的核ITS、ITS2与叶绿体psbA-trnH、rbcL、matK序列的PCR扩增和测序效率、种内及种间变异、鉴定效率,对初筛后的序列进行barcoding gap检验及NJ树聚类分析。结果 psbA-trnH序列的PCR扩增和测序效率均为100%,种间最小变异大于其种内最大变异,且鉴定效率为候选序列中最高,barcoding gap检验结果表明该序列在种间、种内变异重合比例较小,且NJ树聚类分析结果也表明psbA-trnH序列能够提供充分的辨析效果。结论 psbA-trnH序列能准确鉴定七叶树属药用植物,可作为七叶树属药用植物条形码序列。     

基于psbA-trnH序列的辽宁省黄精药材DNA条形码研究

目的 基于psbA-trnH序列,运用DNA条形码技术对辽宁省12个地区及省外2个地区黄精药材样本进行鉴别分析,为辽宁省黄精药材的鉴别和遗传多样性分析提供参考。方法 利用DNA试剂盒提取法,从38个黄精样本的药用部位中提取DNA,对psbA-trnH部分进行聚合酶链式反应（PCR）扩增及双向测序,并从GenBank下载药用植物黄精的不同来源和外群序列,运用SeqMan软件对测序结果进行拼接,使用MEGA软件对数据进行分析比对,计算K2P（Kimura 2-parameter）遗传距离,并采用邻接法（NJ）建立系统发育树进行分析。结果 根据NJ系统发育树结果可知,不同来源的所有黄精样品聚为一大支,外群猪牙花聚为一支,区别较明显;辽宁省、湖北省及贵州省黄精与美国国家生物技术信息中心（NCBI）所下载的黄精聚为一支,并且结合变异位点与遗传距离可知,辽宁省、湖北省及贵州省的黄精物种为黄精Polygonatum sibiricum Red.,种间差异较小,辽宁省所收集的黄精有4个样品出现了变异位点,其余样本碱基序列均相同。结论 使用psbA-trnH序列DNA条形码技术能够对黄精药材不同的基原植物进行区分鉴别且成功率较高,可用于对黄精属物种进行种内和种间鉴别,为保障辽宁省黄精药材来源的准确鉴定提供参考。     

ITS和psbA-trnH序列鉴别绿绒蒿属藏药植物

目的 应用核基因ITS和叶绿体psbA-trnH序列对绿绒蒿属Meconopsis Vig. 藏药进行鉴别。方法 采集欧贝3种基原植物罂粟科绿绒蒿属毛瓣绿绒蒿Meconopsis torquata、红花绿绒蒿Meconopsis punicea、全缘叶绿绒蒿Meconopsis integrifolia,才温2种基原植物罂粟科绿绒蒿属总状绿绒蒿Meconopsis racemosa、多刺绿绒蒿Meconopsis horridula,对植物核糖体DNA内转录间隔区、叶绿体psbA-trnH非编码区序列进行测定与分析。结果 ITS序列分析显示,总状绿绒蒿与多刺绿绒蒿序列一致,其余任意两种间具有变异位点;psbA-trnH序列分析显示,任意两种间均有变异位点;两者结合可有效对所有5种植物进行区分鉴定。结论 ITS和psbA-trnH序列相结合可用于绿绒蒿属藏药欧贝和才温的分子鉴定。     

蕨类药材石韦及其混伪品的psbA-trnH序列鉴定

为考察psbA-trnH序列鉴定蕨类药材的可行性,该研究以蕨类药材石韦及其混伪品作为研究对象,对其106份样品提取基因组DNA,通过聚合酶链式反应（PCR）扩增其叶绿体psbA-trnH序列,并采用Mega6.0软件进行多序列比对,计算种内及种间K2P遗传距离,采用最大似然法（ML）构建系统聚类树。结果表明：石韦药材3个基原植物的psbA-trnH序列种内最大遗传距离均小于其与混伪品的种间最小遗传距离;ML树显示石韦药材可与其混伪品明显分开;psbA-trnH序列可作为蕨类药材的DNA条形码,能准确、稳定鉴定蕨类药材石韦及其混伪品。     

基于叶绿体DNA序列的多基原黄精分子鉴定

目的 通过分析rpl20-rps12、trnL-trnF及psbA-trnH序列变异特点,评价其对3种不同基原黄精的鉴定能力。方法 分别提取3种基原黄精总DNA,以rpl20-rps12、trnL-trnF及psbA-trnH引物进行聚合酶链式反应（PCR）扩增和测序。采用MEGA 5软件寻找其特异位点,计算样品K2-P（Kimura 2-parameter）遗传距离,并构建邻接（neighbor-joining,NJ）系统聚类树。结果 rpl20-rps12、trnL-trnF及psbA-trnH序列长度分别为722~737、293、457~531 bp,简约信息位点占比分别为0.4%、1.0%和2.4%。rpl20-rps12和psbA-trnH序列中种内最大遗传距离均小于种间最小遗传距离。基于3个序列构建的NJ树显示,3种基原黄精都表现出良好单系性,能明显区分。结论 从序列特点和种内、种间变异性综合分析,rpl20-rps12序列更适宜黄精的基原鉴定。     

基于ITS2和psbA-trnH序列鉴别金线兰及其近缘种

目的 应用ITS2和psbA-trnH条形码鉴定金线兰Anoectochilus roxburghii及其近缘种。方法 提取金线兰及其近缘种的DNA,对ITS2和psbA-trnH序列进行扩增和测序,计算物种种内、种间遗传距离,构建邻接法（neighbor-joining,NJ）系统聚类树直观反映鉴定结果。结果 经PCR扩增后测序,金线兰及其近缘种ITS2序列长度为250～254 bp,GC含量为48.2%～51.6%;psbA-trnH序列长度为636～704 bp,GC含量为31.8%～32.0%。根据K2P遗传距离计算,金线兰的种内遗传距离明显小于种间遗传距离。基于ITS2序列构建的NJ树结果显示,除长片金线兰A.longilobus外,金线兰与其余混伪品可以明显区分。基于psb A-trnH序列构建的NJ树结果显示,除长片金线兰和丽蕾金线兰A.lylei外,金线兰与其余金线兰属近缘种可以明显区分。结论 ITS2和psb A-trnH序列可以鉴别金线兰与其遗传距离较远的近缘种。     

基于ITS2和psbA-trnH序列对细小种子类药材车前子的鉴定比较

为考察ITS2 序列和psbA-trnH 序列对车前子药材及其常见混伪品的鉴定能力,该研究对车前子2个基原物种及7种混伪品共71份样本进行了研究。采用MEGA 5.1对获得的ITS2和psbA-trnH进行序列比对,计算种内和种间kimura 2-parameter（K2P）遗传距离,并构建系统发育树。结果显示,车前和平车前的ITS2 序列长度分别为199,200 bp;两者的ITS2序列种内最大 K2P 遗传距离均小于与混伪品的最小种间K2P 遗传距离;基于ITS2 序列构建的NJ 树中,车前、平车前及其混伪品都表现出良好单系性,都能相互明显区分。表明ITS2序列能将车前子药材与混伪品进行很好的区分。车前和平车前的psbA-trnH序列长度均为340 bp,两者的psbA-trnH 序列种内最大K2P 遗传距离小于与混伪品的最小种间K2P 遗传距离;基于psbA-trnH 序列构建的NJ 树结果显示,除大车前外,车前子药材与其余混伪品可以明显区分。因此,ITS2序列作为DNA条形码,车前子及其混伪品具有良好的鉴别能力,对保障车前子用药安全具有重要意义。     

基于ITS2序列的茅苍术及其近缘种DNA分子鉴定

目的 应用ITS2条形码鉴定茅苍术Atractylodes lancea及其近缘种药材.方法 提取不同产地29份茅苍术、北苍术A. chinesis及白术A. macrocephala基因组DNA,通过PCR扩增ITS2序列并进行双向测序,测序结果提交至GenBank;从GenBank下载茅苍术及其菊科近缘种10种45条ITS2序列;对提交与下载的73条序列,应用MEGA 5.1软件进行序列比对,计算种内和种间距离,采用相似性搜索法、最近距离法进行鉴定分析,并构建Neighber-jioning(NJ)系统进化树直观反映鉴定结果.结果 茅苍术药材ITS2序列长度均为229 bp,是1个单倍型;与菊科近缘种苍术属药材距离较近,与菊科其他属近缘种之间遗传距离较远,NJ树结果显示茅苍术及其近缘种药材均可明显区分,表现出良好的单系性,依据ITS2二级结构,也可以直观地将茅苍术与菊科近缘种药材区分.结论 ITS2序列作为DNA条形码能稳定、准确鉴别茅苍术药材,为保障临床安全用药提供了新的技术手段.     

千金子制霜前后提取物对大鼠肠道菌群的影响

目的研究千金子制霜前后提取物对正常大鼠肠道菌群的影响,为进一步阐明千金子制霜减毒机制提供参考。方法大鼠ig高、中、低剂量的千金子生品和霜品提取物,采用平板菌落计数法考察千金子制霜前后大鼠粪便中4类代表性肠道菌群双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、肠球菌的数量变化。结果平板菌落计数实验结果表明,ig千金子生品与霜品提取物后大鼠出现菌群失调现象,且千金子霜品较生品引起的菌群紊乱程度低,在低剂量给药时可使条件致病菌肠球菌和大肠杆菌的数量减少。结论千金子制霜前后提取物均会影响肠道菌群的生物多样性,影响肠道菌群平衡,且千金子制霜后对4类肠道菌群的作用减弱,引起肠道菌群紊乱程度减小,这与千金子霜品泻下作用缓和的研究结果相一致,表明从肠道微生态角度考察千金子制霜前后对肠道菌群的干预作用,可揭示制霜与肠道菌群数量变化可能存在相关性。     

不同比例甘草配伍祖师麻抗大鼠佐剂性关节炎的实验研究

目的 观察不同比例甘草配伍祖师麻对大鼠佐剂性关节炎（AA）模型的治疗作用,筛选两者配伍比例,探讨其配伍意义。方法 采用足跖皮内注射弗氏完全佐剂制备AA模型,将140只模型大鼠随机分成14组：模型组,雷公藤多苷片组,祖师麻低、中、高剂量组,甘草低、中、高剂量组,祖师麻-甘草（3：1）低、中、高剂量组,祖师麻-甘草（3：2）低、中、高剂量组,另取10只正常大鼠为对照组,给药组大鼠造模前2 d开始ig给药,连续给药31 d,观察各组大鼠体质量变化,计算足肿胀度、关节炎指数（AI）,采用ELISA法检测大鼠血清炎症细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）的水平,观察大鼠膝关节组织病理变化,通过免疫组化法测定大鼠膝关节滑膜组织中血管内皮生长因子（VEGF）、巨噬细胞游走抑制因子（MIF）的表达。结果 与模型组比较,祖师麻组、祖师麻甘草配伍组能够明显抑制AA大鼠体质量减轻的趋势,对抗AA大鼠足肿胀度及AI的增加,降低异常升高的血清TNF-α、IL-1β水平,改善关节病理组织变化,减少滑膜组织VEGF、MIF的表达,其中以祖师麻-甘草（3：2）配伍组效果最优。结论 祖师麻甘草配伍后,对AA大鼠各项指标改善作用显著,作用优于单用祖师麻,其最佳配伍比例为祖师麻-甘草（3：2）。调节血清炎症细胞因子TNF-α、IL-1β及滑膜组织VEGF、MIF的表达,可能是祖师麻甘草配伍治疗类风湿性关节炎机制之一。     

基于毛蕊花糖苷含量分析陈皮和砂仁在熟地黄炮制中的影响性研究

[目的] 针对熟地黄的药性特点，深入研究熟地黄炮制过程中，陈皮与砂仁对其炮制过程中毛蕊花糖苷含量的影响，并建立超高压液相色谱-串联质谱（UPLC-MS）法检测熟地黄中毛蕊花糖苷含量的方法，并根据其含量变化，验证其炮制方法的科学性与合理性，为丰富熟地黄的炮制品种并建立其质量控制标准提供参考。[方法] 参考熟地黄在全国各省市《中药炮制规范》中的炮制方法，采用其中具有临床实用特色的方法，即：陈皮制熟地黄、砂仁制熟地黄（酒蒸法和拌制法），并以2015版《中华人民共和国药典》中熟地黄的质量标准为参照指标，采用UPLC-MS检测技术对其炮制过程中毛蕊花糖苷的含量变化进行研究，并结合性状评分，进行综合评价及统计学分析。[结果] 检测的线性范围为（1~1 000 ng/mL，r=1），其精密度、重复性、稳定性、准确度均较好（RSD<3%）。本实验中炮制后的熟地黄其毛蕊花糖苷的含量均超过药典标准，在炮制过程中当性状达到药典及传统标准时，其毛蕊花糖苷的含量能保持在较高水平，以陈皮制熟地黄后的毛蕊花糖苷含量最高，炮制过程中含量变化最显著。[结论] 陈皮制熟地黄可明显稳定和控制毛蕊花糖苷在熟地黄炮制过程中的下降趋势。这对通过相应的炮制方法，在有效保存熟地黄指标性成分的同时，扩大熟地黄临床使用范围有积极意义。同时UPLC-MS法由于操作简便、速度快、准确度高，可用于熟地黄炮制过程中毛蕊花糖苷含量的检测。     

肉豆蔻、麸煨肉豆蔻中总木脂素的含量测定

目的:建立肉豆蔻、麸煨肉豆蔻中总木脂素的含量方法.方法:采用紫外分光光度法,以去氢二异丁香酚为对照品,测定波长275 nm.结果:去氢二异丁香酚质量浓度在1.5～9.0 mg·L-1与吸光度呈良好线性关系,r=0.999 8,平均回收率97.6％(n=6),RSD 1.2％.结论:建立的方法简便、快速、重复性好.     

酸碱药对甘草-马钱子配伍汤液沉积相态释放特性研究

目的 探讨甘草-马钱子配伍汤液沉积相态的释放行为,为甘草-马钱子配伍减毒提供科学参考。方法 建立沉积相态释放测定HPLC法,通过体外释放实验,追踪沉积相态在蒸馏水、人工胃液、人工肠液等不同介质中主成分的释放行为,并对其释放结果进行拟合研究分析。结果 甘草酸、马钱子碱以及士的宁在人工肠液中的释放量较大,且马钱子碱>甘草酸>士的宁。马钱子碱和甘草酸均与一级动力学模型拟合结果最佳,士的宁与Higuchi模型拟合结果最佳。结论 甘草-马钱子沉积相态主要毒效成分呈现出难溶性骨架材料缓释制剂的释放特性,毒(效)成分士的宁可能以沉积共聚体形式存在,在体释放呈缓释行为而减毒;同时,甘草酸的释放对减毒增效起到协同作用。     

椪柑柠檬苦素-UDP-葡萄糖基转移酶基因的克隆、分析及表达

目的克隆中药橘核主要来源品种椪柑Citrus reticulata的柠檬苦素-UDP-葡萄糖基转移酶(limonoid-UDP-glucosyl transferase gene,LGT)基因,并进行生物信息学及表达分析为橘核有效成分合成及调控机制研究提供基础。方法克隆获得LGT序列,通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,构建LGT与相关物种LGT的系统进化树,利用RT-PCR分析橘皮、橘肉以及橘核中LGT基因表达量,并进行分析和比较。结果测序所得椪柑LGT序列全长为1 530 bp,具有1 509 bp的完整开放阅读框,编码502个氨基酸。并对其蛋白二级、三级结构进行了分析和预测。基因表达分析结果发现椪柑LGT基因在橘核中表达量最低,其次为橘皮,表达量最高为橘肉。结论成功克隆、分析并表达了椪柑LGT基因,为橘核中柠檬苦素类物质合成及调控机制研究提供基础。     

夏天无HPLC指纹图谱及多指标含量测定研究

目的建立夏天无HPLC指纹图谱及多指标成分测定方法,为夏天无药材质量标准提升提供科学依据。方法采用HPLC法,Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱;以乙腈-0.2%冰醋酸溶液(三乙胺调pH 6.0)为流动相,梯度洗脱;体积流量1.0 mL/min;柱温35℃;进样量10μL;检测波长280 nm;建立15批夏天无药材的指纹图谱,用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012A版)进行评价,聚类分析和主成分分析将15批药材分为2类,同时测定原阿片碱、黄藤素、荷包牡丹碱和延胡索乙素4种成分的含量。结果建立了夏天无药材的HPLC指纹图谱,共标定了10个共有峰;原阿片碱、黄藤素、荷包牡丹碱和延胡索乙素线性关系良好,r均大于0.999 9,平均回收率分别为97.12%、100.09%、98.53%、99.71%。结论 HPLC指纹图谱结合多指标成分测定可为夏天无药材质量评价提供参考。     

动态观测艾片、天然冰片、合成冰片、苏合香、安息香5种开窍药对脂多糖致发热大鼠生理指标的影响

目的基于中医整体观、动态观,平行比较艾片、天然冰片、合成冰片、苏合香、安息香5种开窍药调节脂多糖(LPS)致发热模型大鼠生理指标的作用节点及强度。方法采用Data Science International(DSI)植入式生理信号遥测技术,动态观测开窍药对模型大鼠体温(T)、心率(HR)、血压(SBP、DBP)、活动度(A)等生理参数的影响,用SPSS 17.0、SAS 9.2、Origin Pro 8.5处理数据及作图。结果 3种冰片(艾片、天然冰片、合成冰片)对模型大鼠的T、HR有抑制作用,艾片最优;苏合香对模型大鼠HR、SBP、DBP、A等总体呈现先兴奋后抑制趋势;安息香对各项指标无显著影响。主成分分析结果显示天然冰片、苏合香对模型大鼠作用有一致倾向性;合成冰片能同时对A、SBP、DBP产生较大影响。聚类分析和对应分析均表明3种冰片的作用特点可归为一类;苏合香、安息香具有各自作用规律。结论 3种冰片对各生理指标有抑制作用;苏合香整体呈现出先兴奋后抑制趋势,可能与其性温的时间窗有关;安息香对发热模型无显著影响,可能与其平性相关;今后可从开窍药对该模型大鼠作用机制展开研究。     

配伍药物与pH值环境对大黄蒽醌类成分溶出变化的影响规律

目的 研究配伍药物与pH值环境对大黄药对中蒽醌类成分溶出变化的影响规律。方法 首先检测与大黄配伍的药物（醋甘遂、牡丹皮、黄芩、黄连、附子、枳实、厚朴）单煎液的pH值,然后在相同pH值的水溶液中加入大黄进行煎煮,采用UV-Vis法和HPLC法测定此pH值的水煎液中蒽醌类成分的量,与大黄药对共煎液中蒽醌类成分的量进行比较。结果 UV-Vis法检测结果显示,大黄与黄连配伍时,总蒽醌的溶出量最低,而大黄与黄芩配伍时总蒽醌的溶出量最高。用盐酸水溶液提取大黄,总蒽醌的溶出量随pH值升高而增加;HPLC法测定结果显示,在测定的7个药对中,黄连与大黄配伍时,蒽醌类成分溶出量最低,而附子与大黄配伍时,蒽醌类成分的溶出量最高。使用不同pH值的盐酸水溶液提取大黄时,蒽醌类成分的量在pH值为5.6时最高。结论 大黄在煎煮过程中,与其配伍的药物和pH值环境均会引起蒽醌类成分溶出量的变化,但是不同药物配伍后形成的pH值环境与用盐酸调整的pH值环境对蒽醌类成分产生的影响存在不一致性,pH值环境对其影响较大。     

不同居群栝楼各药用部位质量综合评价研究

目的对不同居群栝楼Trichosanthes kirilowii的瓜蒌子、瓜蒌皮、根(天花粉)的质量进行综合评价,建立栝楼各药材质量评价新模式。方法采用AA3连续流动分析仪、紫外可见分光光度法、硫酸-苯酚法对栝楼各药用部位蛋白、黄酮、多糖进行测定,HPLC法对瓜蒌子中3,29-二苯甲酰基栝楼仁三醇(3,29-DR)及天花粉中葫芦素B进行测定,并采用主成分分析法和聚类分析法对栝楼各药用部位进行综合质量评价。结果瓜蒌子质量以河南安阳黎园栝楼最优,其3,29-DR和粗蛋白的量最高;山西绛县栝楼作药材瓜蒌皮质量较佳,其粗蛋白和多糖量较高;安徽岳西黑大片栝楼宜作为药材天花粉种植,其粗蛋白量较高、淀粉量较低、葫芦素B量适中。结论所采用的主成分分析法和聚类分析法是栝楼各药用部位质量评价的有效方法,所建立的多指标综合评价模式在栝楼各药材研究中具有一定的现实意义。