橘核柠檬苦素葡萄糖基转移酶基因(lgt)的克隆与表达分析

目的:从橘核主要来源品种大红袍Citrus reticulata‘Dahongpao’的总RNA中克隆获得柠檬苦素葡萄糖基转移酶基因(lgt),并对其进行生物信息学相关表达分析。方法:提取橘核总RNA,克隆获得了lgt基因序列,通过生物信息学对其蛋白的特征进行分析,构建lgt与其相关物种lgt的系统进化树,利用RT-PCR分析橘核不同时期的lgt基因表达量,并进行分析。结果:克隆获得lgt基因的总长度为1 372 bp,编码457个氨基酸,利用生物信息学分析其属于糖基转移酶超家族的亲水性蛋白,有较多的α-螺旋和自由卷曲,存在于真核生物细胞质,通过RT-PCR分析种子在脱水干燥时期表达量最低,其次为形态建成时期,成熟时期表达量最高。结论:首次从大红袍中成功克隆lgt基因,为橘核中柠檬苦素类物质合成及调控机制奠定了基础。     

橘核角鲨烯合成酶基因(ss)的克隆、分析及表达

目的:从大红袍Citrus reticulata‘Dahongpao’种子的总RNA中克隆角鲨烯合成酶基因(ss),并对其进行生物信息学及表达分析。方法:采用RT-PCR技术克隆基因并对其在橘核不同生长时期的表达进行分析,利用在线分析工具对基因进行生物信息学分析。结果:克隆所得ss总长度为1 205 bp,编码397个氨基酸,与芸香科柑橘属Citrus L.甜橙Citrus sinensis、克莱檬蒂娜橘Citrus clementina角鲨烯合成酶(SS)蛋白质序列具有99%的相似性。将橘核生长发育过程分为形态建成末期、成熟期和脱水期3个阶段,其中,种子成熟期的ss表达量最高。结论:首次从大红袍中成功克隆ss,可为橘核中柠檬苦素类化合物生物合成及调控机制的研究提供参考。     

橘核柠檬苦素类化合物积累与功能基因表达的灰色关联度分析

目的研究橘核传统药用品种大红袍Citrus reticulata‘Dahongpao’中柠檬苦素类化合物生物合成机制与转运规律。方法利用UPLC法测定橘种子生长发育过程中茎、叶、果皮及种子中的柠檬苦素、诺米林、黄柏酮等柠檬苦素类化合物的量,采用灰色关联度分析方法,与克隆获得的角鲨烯合成酶基因(ss)、角鲨烯环氧酶基因(se)、葡萄糖基转移酶基因(lgt)表达量进行关联度分析。结果不同器官中柠檬苦素类化合物在种子中得到最大积累;不同器官中柠檬苦素类化合物的积累与ss、se、lgt基因表达均有较大的关联,但在种子中柠檬苦素的积累与ss、se、lgt基因表达最密切,其中ss基因表达对柠檬苦素、诺米林、黄柏酮的积累贡献最大。结论本实验为柠檬苦素类化合物合成机制与转运规律提供可靠、科学的依据。     

橘核遗传多样性与柠檬苦素类化合物含量的相关性分析

目的研究橘核种质资源遗传多样性与柠檬苦素类化合物含量的相关性,为筛选橘核的主要基原品种提供参考。方法以四川不同产地、不同品种的35份橘核样品为材料,首先利用NTSYSpc2.10e软件对ISSR标记结果进行多态性分析;再采用UPLC法测定橘核样品中柠檬苦素类化合物(柠檬苦素、诺米林、黄柏酮)的含量;最后通过SPSS 21.0软件对二者数据进行相关性分析。结果筛选出的33条ISSR引物共扩增出240条清晰可辨DNA带,遗传相似系数变化范围为0.72~0.92;其中椪柑与大红袍亲缘关系最近,且柠檬苦素类化合物含量类似,而其余品种橘核与大红袍亲缘关系较远,柠檬苦素类化合物含量差异较大。结论与大红袍亲缘关系越接近的品种其类柠檬苦素含量越高,可考虑将椪柑作为橘核的主要基原品种。     

五味子PLR基因及其启动子的克隆与表达分析

目的从五味子中克隆木脂素生物合成途径松脂醇-落叶松脂素还原酶(Pinoresinol-lariciresinol reductases,PLR)基因及其启动子序列,并进行生物信息学与表达分析。方法根据转录组PLR测序序列设计特异性引物,克隆ScPLR并进行生物信息学分析;采用TAIL-PCR对Sc PLR启动子序列扩增,并进行序列分析;采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析果实不同发育时期ScPLR的表达。结果 Sc PLR基因开放阅读框(ORF)全长837bp,编码278个氨基酸;ScPLR蛋白相对分子质量31419.85,理论等电点8.97;具有跨膜结构,无信号肽,为稳定性疏水蛋白,主要由α-螺旋和无规卷曲构成;亚细胞定位预测Sc PLR主要定位于细胞质;系统进化显示Sc PLR与蓖麻PLR亲缘关系较近。克隆到Sc PLR基因启动子长994bp,具有TATA-box、CAAT-box基本元件、光调控、生长素响应、厌氧诱导、防御和应激反应的多种调控元件;qRT-PCR结果显示ScPLR表达量呈现果实膨大期快速增加而进入着色期迅速降低的变化趋势。结论获得了Sc PLR基因及其启动子序列,ScPLR果实着色期之前高水平表达的趋势和木脂素的动态变化相一致,为进一步研究该基因功能及表达调控奠定了理论基础。     

调控红花类黄酮合成MYB转录因子基因克隆及表达分析

目的在红花Carthamus tinctorius中克隆调控类黄酮合成的MYB转录因子基因,通过序列及表达分析初步鉴定参与调控类黄酮合成的MYB转录因子基因。方法对已报道调控类黄酮合成MYB转录因子进行序列比对,设计简并引物克隆核心序列,采用RACE技术克隆MYB转录因子基因全长,利用生物信息学方法分析基因序列,采用半定量PCR分析基因在红花不同组织及不同花期的表达情况。结果克隆得到3个调控类黄酮合成候选MYB转录因子基因,命名为CtFRMYB1、CtFRMYB2及CtFRMYB3。序列全长分别为1 223、1 080、1 348 bp,蛋白质相对分子质量分别为17 878.15、28 766.45、27 987.89。序列分析表明3个转录因子都具DNA结合功能,属MYB转录因子家族。进化分析表明CtFRMYB1和CtFRMYB2同AtMYB12关系较近。表达分析表明CtFRMYB1和CtFRMYB2仅在花中表达且在花期3(开花第3天)表达量较高。结论成功克隆3个调控类黄酮合成候选MYB转录因子基因CtFRMYB1、CtFRMYB2及CtFRMYB3,经生物信息学及表达分析初步鉴定到2个调控红花类黄酮合成MYB转录因子基因CtFRMYB1及CtFRMYB2,为红花类黄酮合成的调控机制研究奠定基础。     

红花2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶基因的克隆及表达分析

目的克隆红花维生素E合成相关关键酶2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶(MPBQ MT)基因,并进行生物信息学及表达分析,为红花维生素E生物合成及调控机制研究奠定基础。方法根据红花种子转录组数据库中得到的中间序列,采用RT-PCR和RACE方法从红花种子中克隆MPBQ MT基因序列,通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,构建MPBQ MT与相关物种MPBQ MT的系统进化树,利用RT-PCR方法分析在红花种子不同发育时期MPBQ MT基因的表达量。结果MPBQ MT基因全长1 392 bp,命名为Ct MPBQ MT,具有完整的开放阅读框(ORF),共1 038 bp,编码345个氨基酸。生物信息学分析显示,该基因编码的蛋白理论相对分子质量约为38 900。保守结构域预测表明,该基因编码的蛋白具有典型的SAM蛋白功能结构域。结合其他物种的MPBQ MT基因构建系统树表明,红花MPBQ MT基因与其他物种氨基酸具有一定的同源性,其中与向日葵和生菜同源性高达89%和86%。实时荧光定量PCR分析表明,MPBQ MT基因在红花开花后50 d的种子中表达量最高。结论成功地对MPBQ MT基因进行克隆及表达分析,为红花维生素E合成及调控机制研究奠定基础。     

刺五加法尼基焦磷酸合酶基因的克隆、 生物信息学及表达分析

目的:克隆刺五加的法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,FPS)基因,并对其进行生物信息学和表达分析.方法:采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆刺五加FPS基因的全长cDNA序列.运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构与功能.并通过RT-PCR法检测FPS在不同器官中的表达情况.结果:刺五加FPS基因的cDNA全长为1 499 bp,开放阅读框长1 029 bp,编码342个氨基酸的蛋白,包含2个富含天冬氨酸(DDXXD)的保守功能域.FPS蛋白无跨膜区域,定位于细胞质中.RT-PCR的结果显示,刺五加FPS基因在各器官中均有表达,但表达最具有显著差异(P＜0.05).结论:首次分离并报道了刺五加FPS的cDNA克隆,并证实其在不同器官中的表达量不同,为进一步研究FPS对刺五加皂苷合成的影响和表达调控奠定了基础.     

白木香查尔酮合酶(AsCHS1)基因的克隆和生物信息学分析

目的:对国产沉香的源植物白木香Aquilaria sinensis查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)基因AsCHS1编码区进行克隆,并对其进行生物信息学分析和表达分析.方法:根据已报道的白木香伤害转录组高通量测序结果分析获得1条具有查尔酮合酶保守结构域的CHS基因序列,采用RT-PCR技术,以不同伤害时间白木香木质部混合样品总RNA为模板克隆得到白木香AsCHS1的基因编码区序列,并对AsCHS1蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析.另外,采用qRT-PCR方法,以组蛋白(histones)为内参对AsCHS1基因在伤害胁迫下的表达模式进行分析.结果:序列分析表明,所克隆的AsCHS1基因编码区开放阅读框(opening reading frame,ORF)长为1 194bp,编码397个氨基酸残基,命名为AsCHS1.qRT-PCR实验证明该基因表达量在伤害后12h最大,说明该基因能够在早期响应伤害胁迫.结论:白木香AsCHS1基因的编码区序列的分离克隆为进一步研究AsCHS1蛋白在白木香中黄酮合成途径中的功能及表达调控奠定基础.     

红花查尔酮合成酶基因的克隆、生物信息学分析及表达

目的克隆红花查尔酮合成酶基因(chalcone synthase,CHS),运用生物信息学分析CHS,比较花期中每天CHS的表达,为红花有效成分合成及调控机制研究提供基础。方法从新鲜红花花冠中提取RNA,反转录为cDNA,设计特异性引物,克隆获得CHS。通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,使用MEGA5.1构建CHS与相关物种CHS的系统进化树,利用real-time PCR分析花期中每天红花CHS的表达量,并进行分析和比较。结果克隆获得的红花CHS,序列全长为1 149 bp,具有1 041 bp的完整开放阅读框,编码346个氨基酸。将该蛋白通过NCBI上的Blastp比对发现,该蛋白属于CHS家族,比对结果显示红花CHS与100余种NCBI上登录的植物有相似性,其中与水飞蓟、翠菊、菊花、红凤菜的相似性分别达95%、95%、94%、94%。将相似性在90%以上的物种用MEGA5.1构建进化树,结果显示红花CHS与水飞蓟CHS亲缘关系最近。通过ProtParam预测红花CHS蛋白分子式为C1678H2693N451O493S20,相对分子质量为37 700,等电点为6.10,负电荷的氨基酸残基数(Asp+Glu)为42,正电荷的氨基酸残基数(Arg+Lys)为38。基因表达分析结果表明红花CHS在花期第3天的相对表达量最高,远远高于花期其余时间。结论成功克隆、分析并表达了红花CHS,为红花有效成分合成及调控机制研究提供基础。     

铁皮石斛中性/碱性转化酶(DoNI2)基因的克隆和表达分析

目的克隆珍稀濒危兰科药用植物铁皮石斛中性/碱性转化酶(alkaline/neutral invertase,NI)家族基因成员,并对其进行定量表达以及生物信息学分析。方法采用转录组测序和RACE技术相结合克隆NI基因的cDNA序列,利用生物信息学工具对其进行分析,并采用实时荧光定量PCR方法检测NI基因在铁皮石斛根、茎和叶中的表达情况。结果克隆获得1个新的铁皮石斛NI基因,命名为DoNI2(Gen Bank登录号KY794404),全长2 397 bp,开放阅读框(ORF)为1 836 bp,编码611个氨基酸。DoNI2蛋白预测的理论相对分子质量和等电点分别为69 050和6.38,不稳定系数为42.95,疏水性系数为-0.232。DoNI2基因在铁皮石斛根、茎和叶中均有表达,其中在茎中表达量最高,根中最低。不同生长年限茎中DoNI2基因表达量与NI酶活性呈显著正相关。结论克隆了线粒体型的DoNI2基因的全长c DNA序列,为进一步阐明该基因在铁皮石斛蔗糖代谢途径中的重要作用奠定基础。     

黄花蒿MCS基因的克隆及其序列分析与原核表达

目的 从黄花蒿中克隆MEP途径关键酶2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合成酶(MCS)基因,进行序列特征分析、原核表达以及组织表达的研究.方法 根据黄花蒿MCS (AaMCS)基因EST序列,克隆MCS cDNA及基因组序列.将MCS编码区与表达载体pET-21a(+)重组,构建pET-21a (+)-MCS的原核表达载体并转入大肠杆菌BL21 (DE3),IPTG诱导获得MCS融合蛋白.半定量RT-PCR检测MCS的组织表达情况.结果 AaMCS cDNA全长994 bp,包含681 bp的开放阅读框,编码226个氨基酸,基因全长2 540 bp,包含3个外显子和2个内含子.构建pET-21a (+)-MCS重组质粒,获得稳定的pET-21a (+)-MCS原核表达体系.AaMCS在根、茎、叶、花中均有表达,其中花中表达量较高,根和茎中表达量低.结论 克隆了AaMCS基因,建立pET-2 1a (+)-MCS稳定的原核表达体系,为研究AaMCS蛋白的活性及其功能奠定了基础.     

丹参转录因子SmbHLH93的克隆及表达模式分析

目的 克隆丹参碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)类转录因子SmbHLH93,并初步探究该基因的功能.方法 采用PCR和RT-PCR技术分别从DNA和cDNA水平克隆得到了SmbHLH93基因,进一步通过BD Walking获得了该基因的5'启动子区.生物信息学分析SmbHLH93蛋白的理化性质、结构特点和系统进化关系.结合启动子区分析软件和qPCR,研究SmbHLH93在丹参不同部位和环境诱导下的表达模式.结果 获得SmbHLH93基因序列954 bp和5'启动子区1 583 bp,其中开放阅读框(ORF)657 bp,有3个内含子和4个外显子,编码218个氨基酸,含有bHLH和ACT_UUR-ACR-like结构域,无跨膜区域,可能定位于细胞核.表达模式分析结果显示该基因的表达量在根中最高,茎中最低,且随着花的形成逐渐降低.光和低温诱导SmbHLH93的高表达,而水杨酸(SA)抑制其表达.结论 克隆得到丹参bHLH类转录因子新成员SmbHLH93,初步预测其参与了丹参花的发育过程和丹参次生代谢途径的调控.     

滇龙胆1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因GrDXR的克隆、序列分析与原核表达

目的从滇龙胆Gentiana rigescens幼叶中克隆萜类合成关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因GrDXR,进行序列分析和原核表达。方法根据滇龙胆转录组中GrDXR基因序列,设计引物,通过RT-PCR扩增得到GrDXR开放阅读框(ORF)序列,并进行TA克隆、测序和序列分析;构建原核表达载体pGEX-4T-1-GrDXR,转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,在IPTG诱导下进行表达。结果 GrDXR ORF全长1 425 bp,编码474个氨基酸。序列分析表明,GrDXR基因是DXR家族成员;蛋白质序列系统发育分析表明,GrDXR与萝芙木RvDXR、橡胶树HbDXR和长春花CrDXR亲缘关系较近。构建pGEX-4T-1-GrDXR重组质粒,获得稳定的原核表达体系。SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。结论克隆了GrDXR基因,建立其稳定的原核表达体系,为进一步纯化GrDXR蛋白,研究其结构和功能奠定基础。     

红花bZIP20转录因子基因的克隆、表达分析及植物表达载体构建

目的克隆红花花瓣中b ZIP20(Basic region/leucine zipper motif)基因,研究其在不同组织中的表达量并构建其植物表达载体。方法根据红花转录组测序结果挑选b ZIP基因的设计引物,以红花花瓣总RNA为模板,采用RT-PCR法扩增b ZIP20基因开放阅读框(ORF)片段,利用RT-PCR法分析在红花不同组织以及尖孢镰刀菌侵染后红花根部b ZIP20基因的表达量,同时构建植物表达载体p BASTA-b ZIP20。结果 b ZIP20基因ORF长981 bp,编码326个氨基酸(Gen Bank登录号为KT692605)。红花b ZIP20与其他物种氨基酸具有一定的同源性,其与芝麻、野茶树的氨基酸序列相似性高达85.41%和83.99%。实时荧光定量PCR分析表明,b ZIP20基因在不同组织中的表达水平具有显著差异,在花中呈现高表达,而在其他组织中低表达。接种尖孢镰刀菌的红花根部组织中b ZIP20基因的表达显著上调。结论成功地对b ZIP20基因进行克隆及表达分析,并构建植物表达载体p BASTA-b ZIP20。     

滇龙胆香叶醇-10-羟化酶基因克隆、生物信息学分析和表达

目的克隆滇龙胆Gentiana rigescens香叶醇-10-羟化酶(geraniol-10-hydroxylase,G10H)基因,对其进行定量表达以及生物信息学分析。方法采用PCR技术获得G10H的c DNA序列,对G10H蛋白进行理化性质、二级结构和三级结构等生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR方法检测G10H基因在滇龙胆根、茎、叶中的表达情况。结果克隆得到滇龙胆G10H基因,全长为1 400 bp,ORF 1 248 bp,编码415个氨基酸。生物信息学预测该基因编码蛋白质分子式为C_(2131)H_(3390)N_(586)O_(615)S_(17),等电点为7.62,不稳定系数为44.20,疏水性系数GRAVY为-0.245。G10H基因在滇龙胆根、茎、叶中均有表达,其中在根中表达量最高,茎中最低。结论首次从滇龙胆中克隆得到了G10H基因,为进一步阐明该基因的羟基化功能在滇龙胆龙胆苦苷生物合成途径中的重要作用奠定基础。     

白木香倍半萜合成酶As-SesTPS1基因的克隆、生物信息学和表达分析

目的基于前期对白木香Aquilaria sinensis转录组测序结果,从白木香总RNA中克隆白木香倍半萜合成酶基因(As-Ses TPS1),并对其进行生物信息学及表达分析。方法利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从白木香总RNA中获得倍半萜合成酶基因As-Ses TPS1的c DNA全长序列;利用生物信息学手段对该序列进行相似性和同源性分析,并预测其编码蛋白的结构和功能;利用q RT-PCR技术检测该基因在白木香不同样品中的表达水平。结果得到倍半萜合成酶基因As-Ses TPS1,开放阅读框(ORF)全长1 671 bp,编码556个氨基酸,其与多条倍半萜合成酶基因具有较高相似性,并含有RRx8W和DDxx D的保守序列;该基因在白木香的沉香样品中高表达。结论 As-Ses TPS1的克隆及其生物信息学和在白木香不同部位表达差异性分析,为白木香倍半萜生物合成代谢途径的研究奠定基础。     

金线莲UGPase基因克隆与表达及在多糖合成中的作用

目的克隆出金线莲Anoectochilus roxburghii尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-Glucose pyrophoshorglase,UGPase)基因全长,并对其表达量及酶活性与多糖积累量之间的相关性进行分析,以研究UGPase基因在金线莲多糖合成代谢途径中的调控作用。方法利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR)技术和RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术克隆金线莲中UGPase基因序列;以金线莲尖叶、无纹等7个品种组培期及种植期茎段部位为材料,采用qRT-PCR、ELISA试剂盒法及苯酚-硫酸法分别测定UGPase基因表达量、酶活和多糖含量,并对其进行相关性分析。结果克隆得到的序列全长1786 bp。开放阅读框为1425 bp,编码475个氨基酸。7个不同品种金线莲中UGPase基因表达量、酶活与多糖含量具有极显著正相关(相关系数分别为0.823、0.785)。结论成功克隆出金线莲UGPase全长基因,初步证明UGPase基因是参与金线莲多糖合成代谢的关键基因之一。