膀胱尿路上皮癌与正常尿路上皮组织LncRNA表达谱差异性的研究

目的利用基因芯片技术,检测人膀胱尿路上皮癌与正常膀胱组织之间LncRNA表达谱的差异,对差异表达的LncRNA进行分类汇总,分析其生物学信息。方法取人膀胱尿路上皮癌组织与配对的癌旁正常组织3对。分别提取尿路上皮癌组织及正常癌旁组织的总RNA并纯化RNA,与人LncRNA芯片杂交。使用Agilent Genespring GX(Agilent)软件分析尿路上皮癌组织及正常癌旁组织的LncRNA表达情况。结果人膀胱尿路上皮癌组织与配对的癌旁正常组织的LncRNA表达谱差异明显。以P0.05,上调或下调信号差异大于2倍变化为标准,与正常膀胱组织比较,共筛选出差异表达基因1 122个,其中上调基因734个,下调基因388个。结论膀胱尿路上皮癌的发生发展是一个涉及多基因调控、多条染色体参与的复杂过程。所获得的膀胱癌差异表达LncRNA,尤其差异表达明显的上调基因AK124776、lincRNA-RAB12-1、KRT8P25、RP11-474J18.4、AC000110.1、KRT8P13、KRT8P10、BC072678等、下调基因nc-HOXB9-206、RP11-160A10.2、nc-HOXA11-86、nc-HOXD10-7、nc-HOXB9-205、CES4、nc-HOXD12-3等,考虑上述上调、下调基因对于膀胱癌发生的分子机制及膀胱癌的临床早期诊疗具有重要意义。     

TargetScan筛选退变椎间盘髓核细胞凋亡相关lncRNA的研究

[目的]寻找退变椎间盘髓核细胞凋亡相关lncRNA,为髓核细胞凋亡的分子机制研究提供指导。[方法]比较miRNA靶基因预测方法,选择灵敏性和特异性均较高、包含不保守区域分析的Target Scan作为预测工具。基于现有lncRNA的序列信息,运行Target Scan的perl脚本,替换mRNA序列信息为lncRNA的序列信息,寻找miRNA的靶lncRNA。根据Target Scan预测结果,综合评估miRNA结合位点数量,靶lncRNA长度,Context+Score评分等指标,筛选目标lncRNA。[结果]文献回顾发现,hsa-miR-27a-3p是退变椎间盘髓核细胞凋亡的关键分子,退变髓核细胞中共有1 052个lncRNA存在差异表达(Fc值≥2,P0.05),其中有186个lncRNA表达下调。检索Ensemble数据库、UCSC基因浏览器和miRbase数据库,明确差异表达的lncRNA的序列及定位信息,将序列定位明确的117个表达下调的lncRNA纳入研究,筛选退变髓核细胞差异表达lncRNA中含有hsa-miR-27a-3p结合位点的lncRNA。共有28个差异表达的lncRNA含有47个hsa-miR-27a-3p结合位点,其中,ENST00000486904和ENST00000408017的Context+Score百分位数≥90,ENST00000450202长度为459 bp,含有3个hsa-miR-27a-3p结合位点,ENST00000440936、ENST00000441356、ENST00000455216和ENST00000498840分别含有2个hsa-miR-27a-3p结合位点,可能通过吸附miR-27a在椎间盘退变过程中抑制PI3K介导的髓核细胞凋亡。[结论]应用Target Scan数据库进行生物信息学分析,可以有效预测退变椎间盘髓核细胞凋亡相关lncRNA,为进一步的实验研究提供良好的指导。     

Illumina高通量测序技术研究肌少-骨质疏松症与骨质疏松症患者骨组织microRNAs差异表达谱及差异分析

目的采用高通量测序技术筛选"肌少-骨质疏松症"(sarco-osteoporosis,SO)与骨质疏松症(osteoporosis,OP)患者骨组织标本中miRNA差异表达谱,并对差异显著的miRNA进行生物信息分析。方法运用Illumina Hiseq 2500测序技术筛查2017年至2019年期间福建省老年医院SO组与OP组患者的6对骨组织样品中miRNA表达谱;差异显著表达的miRNA运用层次聚类图和火山图分析,并结合基因本体论(GO)富集分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路分析探讨miRNA参与成肌细胞、成骨细胞增殖和分化的生物过程。结果 SO组与OP组进行组间对比,12份骨组织中共鉴定到3 064个(P0.05;|log2 Fold Change|0.0)差异表达的miRNAs,其中上调的1 432个,下调的1 632个,筛选出其中差异表达显著的22个miRNAs︱log2 Fold Change︱≥2且P 0.05包括15个在SO组骨组织中表达上调的miRNAs和7个表达下调的miRNAs;层次聚类图和火山图分析提示,SO和OP骨组织中的miRNA差异表达谱具有统计学意义; GO分析结果显示,miRNA的靶基因富集于成肌细胞与成骨细胞的生物过程,还参与细胞的氧化代谢、增殖和分化以及凋亡等生物过程。KEGG通路分析显示,hsa-miR-382-3p、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-1226-5p、hsa-miR-3934-5p和hsa-miR-451a的靶基因集合显著富集于NF-κB、Wnt、MAPK和P53等信号通路中。结论 Illumina高通量测序技术能有效筛查出肌少-骨质疏松症骨组织中差异表达的miRNA;通过分析5个差异显著基因的下游靶基因,并结合分子生物学相关数据库与查阅大量文献发现这些差异miRNA可能参与肌少-骨质疏松症疾病状态下成骨细胞和成肌细胞多种生物活性过程。这一研究结果为后续深入研究miRNA及其靶基因调控机体骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化的机制提供了新思路和理论依据。     

脊柱结核椎间盘LncRNA表达差异性分析及潜在诊断标志物筛选

目的 :应用表达谱芯片检测脊柱结核(spinal tuberculosis,STB)患者椎间盘中差异表达的长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)及mRNA,并筛选有诊断标志物潜力的LncRNA。方法:从2018年9月～2020年12月于宁夏医科大学附属总医院脊柱骨科就诊的患者中选取STB患者(实验组)及脊柱退变患者(对照组)各28例。收集两组患者病变椎间盘并提取总RNA,两组各挑选3例合格标本通过Arraystar人类LncRNA V5.0版芯片进行检测并进行芯片数据处理计算各RNA的差异倍数(fold change,FC),其中FC≥2的LncRNA及mRNA为差异表达的RNA(P0.05)。将差异表达的LncRNA邻近的差异表达的mRNA视为cis-靶基因,将LncRNA可能结合的蛋白质视为trans-靶蛋白,并对mRNA、cis-靶基因、trans-靶蛋白进行基因功能注释分析。从差异表达的LncRNA中选取cis-靶基因与STB发病可能相关的LncRNA用剩余各25例标本进行RT-PCR验证,筛选有诊断标志物潜力的LncRNA并进行基因功能注释分析。结果:基于两组间芯片数据的差异共筛选出444个差异表达的LncRNA、186个差异表达的mRNA。基因功能注释分析提示差异表达的LncRNA的cis-靶基因主要参与对转录、翻译、剪接、免疫反应、自然杀伤细胞介导的细胞毒性等生物学过程的调控及信号通路的传递;trans-靶蛋白主要参与对RNA的剪接、加工、转运等基因表达过程的调控;差异表达的mRNA主要参与对转录、翻译、剪接、炎症反应、免疫反应等生物学过程的调控及信号通路的传递。RT-PCR验证发现LINC01128-201、Lnc-DNALI1-205在STB患者中存在明显下调表达,与芯片检测结果一致,且这两个LncRNA可能通过调控ISG15、SNIP1、HES4表达量在STB发病过程中发挥重要作用。结论:STB患者与脊柱退变患者椎间盘的LncRNA及mRNA存在较大的表达差异,其中下调表达的LINC01128-201、Lnc-DNALI1-205可能在STB发病过程中发挥重要作用,且有成为诊断标志物的潜力。     

基于Illumina高通量测序技术研究肌少-骨质疏松症与骨质疏松症患者骨组织microRNAs差异表达谱及差异分析

目的 采用高通量测序技术筛选“肌少-骨质疏松症”（sarco-osteoporosis,SO）与骨质疏松症（osteoporosis,OP）患者骨组织标本中miRNA差异表达谱,并对差异显著的miRNA进行生物信息分析。方法 运用Illumina Hiseq 2500测序技术筛查2017年至2019年期间福建省老年医院SO组与OP组患者的6对骨组织样品中miRNA表达谱;差异显著表达的miRNA运用层次聚类图和火山图分析,并结合基因本体论（GO）富集分析、京都基因与基因组百科全书 (KEGG)信号通路分析探讨miRNA参与成肌细胞、成骨细胞增殖和分化的生物过程。 结果 SO组与OP 组进行组间对比,12份骨组织中共鉴定到 3 064个（P<0.05;| log2 Fold Change |>0.0）差异表达的miRNAs,其中上调的1 432个,下调的1 632个,筛选出其中差异表达显著的22个miRNAs︱log2 Fold Change︱≥2 且P <0.05包括15个在SO组骨组织中表达上调的 miRNAs 和 7个表达下调的 miRNAs;层次聚类图和火山图分析提示,SO和OP骨组织中的miRNA差异表达谱具有统计学意义;GO 分析结果显示,miRNA的靶基因富集于成肌细胞与成骨细胞的生物过程,还参与细胞的氧化代谢、增殖和分化以及凋亡等生物过程。KEGG通路分析显示,hsa-miR-382-3p、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-1226-5p、hsa-miR-3934-5p和hsa-miR-451a的靶基因集合显著富集于NF-κB、Wnt、MAPK和P53 等信号通路中。结论 Illumina高通量测序技术能有效筛查出肌少-骨质疏松症骨组织中差异表达的miRNA;通过分析5个差异显著基因的下游靶基因,并结合分子生物学相关数据库与查阅大量文献发现这些差异miRNA可能参与肌少-骨质疏松症疾病状态下成骨细胞和成肌细胞多种生物活性过程。这一研究结果为后续深入研究miRNA及其靶基因调控机体骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化的机制提供了新思路和理论依据。     

长链非编码RNA低表达与胃癌患者预后关系的Meta分析

目的对胃癌组织中长链非编码RNA（LncRNA）表达水平与患者临床病理特征关系及预后价值进行系统性评价。 方法计算机检索中国学术期刊全文数据库（CNKI）、中国生物医学文献数据库（CBMdisc）、万方数据库、重庆维普数据库和英文数据库EMbase、PubMed、The Cochrane Library（2017年4期）、Web of Science,查找建库至2017年4月发表的有关胃癌组织中LncRNA低表达与患者预后的研究。经2名研究人员独立地进行筛选文献、提取数据、质量评价后,采用STATA 12.0软件对数据行Meta分析,Begg's和Egger's漏斗图评价发表偏倚。 结果共纳入6篇594例胃癌患者LncRNA低表达的研究,组织样本均来自于国内。胃癌患者的LncRNA表达水平与TNM分期（RR=2.06,95% CI =1.73~2.46,P=0.001）、肿瘤浸润深度（RR=2.73,95% CI =2.17~2.43,P=0.001）和区域淋巴结转移（RR=1.63,95% CI =1.37~1.94,P=0.001）相关,而其他临床病理特征与LncRNA表达水平无相关关系,差异无统计学意义。5篇报道胃癌患者总生存期（OS）的研究间存在统计学异质性（I²=68.9%,P=0.012）,分析显示与LncRNA高表达组相比,LncRNA低表达组患者的OS较短,总体生存情况较差,差异有统计学意义（HR=0.56,95% CI =0.31~0.99,P=0.046）。3篇报道无疾病进展生存期（DFS）的研究存在统计学异质性（I²=71.0%,P=0.032）,分析显示LncRNA高表达组和低表达组间DFS差异无统计学意义（HR=0.57, 95% CI=0.32~1.03,P=0.061）。各项研究对合并OS影响的敏感性分析结果显示合并HR的结果稳定性好,发表偏倚可能性较小（Egger's,P=0.651;Begg's,P=0.806）。 结论低表达的LncRNA是胃癌预后不良的危险因素,LncRNA的表达水平与胃癌患者的TNM分期、肿瘤的浸润深度和区域淋巴结转移密切相关。     

反义微小RNA-21寡核苷酸对食管癌EC9706细胞生长的抑制作用

目的 观察微小RNA-21 (miRNA-21)反义寡核苷酸对食管癌EC9706细胞的生长抑制作用.方法 反义寡核苷酸转染食管癌EC9706细胞,噻唑蓝(MTT)法检测细胞生长抑制率,实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测细胞miRNA-21水平,流式细胞仪检测细胞凋亡,FQ-PCR检测程序性细胞死亡因子4 (PDCD4) mRNA表达水平,免疫荧光检测PDCD4蛋白表达.结果 反义寡核苷酸抑制细胞活性的最佳浓度为0.5 μmol/L,转染反义寡核苷酸后细胞内miRNA-21的表达水平明显下调为无义组的0.045 ±0.021,细胞凋亡明显增加为12.95％,生存率显著降低为(48.21±9.56)％,差异有统计学意义(P＜0.05).反义寡核苷酸组中PDCD4 mRNA相对表达增高为0.452±0.002,且蛋白质表达水平增高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 miRNA-21反义寡核苷酸可通过上调PDCD4有效抑制食管癌EC9706细胞增殖并促进凋亡.     

分拣微管连接蛋白9对常染色体显性多囊肾病初级纤毛结构和功能的影响

目的探讨分拣微管连接蛋白9(sorting nexin 9,SNX9)对常染色体显性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)初级纤毛的影响和作用机制,为ADPKD的治疗提供新的干预靶标。方法运用免疫荧光法观察人ADPKD囊肿衬里上皮细胞(WT9-12细胞)中SNX9的定位,采用免疫印迹法检测正常人肾小管上皮细胞(human renal tubular epithelial cells,RCTEC)和WT9-12细胞中SNX9的差异表达;在RCTEC细胞中分别下调和上调SNX9表达,采用免疫印迹法检测纤毛内运输蛋白88(intraflagellar transport proteins,IFT88)表达,并用免疫荧光法观察纤毛长度的变化。结果本研究发现SNX9位于WT9-12细胞的胞膜和胞质,并且表达低于其在RCTEC中的表达水平(P<0.05)。当SNX9表达下调后,IFT88表达减少,纤毛变短(P<0.05);而通过慢病毒SNX9上调SNX9表达后,IFT88表达增加,纤毛变长(P<0.01)。结论ADPKD时SNX9存在于囊肿上皮细胞的胞膜和胞质中,且表达低于正常肾小管上皮细胞,会引起初级纤毛形态和功能受损。而当SNX9表达增多时,对初级纤毛的结构功能具有保护作用,可能成为ADPKD治疗的新靶标。     

Survivin对PC-3细胞微小RNA表达的影响

目的 检测Survivin抑制后PC-3细胞微小RNA( miRNAs)表达谱的变化,探讨Survivin与相关miRNAs之间的关系.方法 利用负载Survivin短发夹RNA (shRNA)重组腺病毒( pGSadeno-sur shRNA),体外转染PC-3细胞,96 h后,收集细胞提取RNA,检测miRNA表达谱的变化.结果 共有650个miRNAs表达信号在雄激素非依赖前列腺癌PC-3细胞中可以被检测到,有9个miRNAs的表达信号水平高于1000,其中的6个miRNAs表达谱同实验组比较差异有统计学意义(P＜0.01).实验组与空白对照组比较有75个miRNAs表达差异有统计学意义(P＜0.01),其中42个表达上调、33个表达下调;阴性对照组与实验组比较有27个miRNAs表达差异有统计学意义(P＜0.01),其中22个表达上调、5个表达下调;实验组与空白对照组及阴性对照组比较均表达上调的miRNAs有15个,表达下调的miRNA有1个.结论 抑制PC-3细胞中Survivin的表达对miRNAs 表达谱有明显影响,为明确相关miRNAs在PC-3细胞中的作用提供新线索.     

胃癌和癌旁黏膜与距癌远端切缘胃黏膜基因表达谱差异的研究

目的用基因芯片技术研究胃癌 （T）和癌旁黏膜 （P）与距癌远端切缘胃黏膜 （C）基因表达谱差异,筛选与早期癌变相关的基因.方法利用国际学术界公认的标准化 Affymetrix公司生产的 U133A基因芯片分别检测 T和 P及 C基因表达谱,并利用生物信息学方法对检测结果进行分析.结果 （1）T与 C比较差异 4倍以上共有 766个基因,其中表达上调 [信号比的对数值 （SLR）〉2]有 530个,表达下调 （SLR〈- 2）有 236个;（2）P与 C比较差异 4倍以上共有 64个基因,其中表达上调 （SLR 〉2）有 50个,表达下调 （SLR〈- 2）有 14 个;（3）T和 P同时与 C比较 （T、 P两者之一差异 4倍以上 ）共有 143个相同的基因,其中表达上调 （SLR 〉2）有 108个,表达下调 （SLR〈- 2）有 35个.结论癌旁黏膜在基因表达水平上显示 143个基因与胃癌表达的基因相同,提示这些基因可能与早期胃癌癌变的启动和演化有关.     

中下段直肠癌E-钙黏附素表达与淋巴结微转移的关系研究

目的:分析中下段直肠癌E-钙黏附素(E-cadherin)表达与淋巴结微转移的关系。方法:应用CK-20免疫组化技术,对56例中下段直肠癌中661枚淋巴结微转移状况进行检测,同时观察肿瘤组织中E-钙黏附素的表达情况。结果:HE染色检测出29例中的190枚淋巴结呈转移,其CK-20免疫组化检测均呈阳性,后者在该29例中另检出12例55枚淋巴结呈阳性;在27例HE染色未检出淋巴结转移者中,有8例12枚淋巴结免疫组化检测呈阳性。20例(36%)67枚(10%)淋巴结检出微转移。中下段直肠癌E-钙黏附素表达阴性率为44.6%(25/56)。中下段直肠癌E-钙黏附素表达阴性与浸润深度(P=0.028)、分化程度(P=0.012)和淋巴结转移(P=0.007)密切相关。20例检测出淋巴结微转移的癌组织中14例(70%)E-钙黏附素表达阴性,而36例未检测出淋巴结微转移的癌组织中仅有11例(30.6%)E-钙黏附素表达阴性;二者差异有统计学意义(P=0.004)。结论:中下段直肠癌E-钙黏附素表达下调参与了淋巴结微转移的发生。     

前列腺癌恩杂鲁胺耐药细胞株的建立及相关lncRNA和mRNA的筛选

目的:构建人前列腺癌恩杂鲁胺耐药细胞株并筛选恩杂鲁胺耐药对lncRNA和mRNA表达谱的影响。方法:体外以恩杂鲁胺10μmol/L浓度诱导培养人前列腺癌LNCa P及C4-2B细胞株6个月,建立耐药细胞株LNCa P-ENZA及C4-2B-ENZA。MTT法检测各细胞株IC50值和耐药指数,Western印迹检测前列腺癌恩杂鲁胺耐药相关基因FL-AR、AR-V7、HnRNPA1在各细胞株中的表达。应用高通量芯片技术筛选C4-2B和C4-2B-ENZA细胞中差异表达的lncRNA与mRNA。结果:恩杂鲁胺耐药细胞株LNCa P-ENZA和C4-2B-ENZA的IC50值分别为60.83、88.32μmol/L,与亲本细胞(分别为12.31、18.96μmol/L)相比显著增高(P0.05),其耐药指数分别为4.94和4.67。Western印迹结果表明LNCa P-ENZA和C4-2B-ENZA中恩杂鲁胺耐药相关基因AR-V7、HnRNPA1的蛋白表达量相较与LNCa P和C4-2B细胞显著升高,而FL-AR的表达量未见显著改变。通过lncRNA芯片技术筛选后发现与C4-2B相比,在C4-2B-ENZA细胞中显著差异表达的lncRNA有1 440个,其中上调倍数最大者为DPP10-AS1(fold change=33.6),下调最大倍数为G090385(fold change=186.41);mRNA有1 236个,其中上调倍数最大者为BCHE(fold change=193.70),下调倍数最大者为ANKRD1(fold change=182.90)。结论:成功建立了人前列腺癌恩杂鲁胺耐药细胞,并且筛选出了与耐药相关的lncRNA与mRNA,为前列腺癌恩杂鲁胺耐药的治疗提供分子依据。     

Par-3蛋白在转化生长因子?茁1介导的大鼠肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的 观察转化生长因子（TGF)β1诱导的正常大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK52E）转分化（EMT）过程中细胞极性蛋白Par-3的表达及上调Par-3蛋白表达对TGF-β1诱导NRK52E细胞转分化进程的影响。 方法 应用TGF-β1 (10 μg/L)刺激NRK52E细胞，采用RT-PCR、Western印迹和免疫荧光方法分别检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Par-3 mRNA和蛋白的表达；应用Lipofectmine 2000将pKH3-HA-Par-3质粒瞬时转染NEK52E细胞，采用Western印迹观察上调表达Par-3对上述指标的影响。 结果 TGF-β1刺激后，NRK52E细胞α-SMA蛋白和mRNA水平上调，E-cadherin蛋白和mRNA的表达下调；Par-3蛋白表达呈时间依赖模式下调，72 h TGF-β1刺激组与对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。但Par-3 mRNA水平在各时间点差异均无统计学意义（P > 0.05）。脂质体转染外源性质粒pKH3-HA-Par-3上调表达Par-3可显著抑制TGF-β1诱导NRK52E细胞α-SMA蛋白的上调表达；逆转E-cadherin蛋白的下调表达。 结论 在TGF-β1诱导NRK52E细胞转分化进程中细胞极性Par-3蛋白表达下调，基因转染上调表达Par-3可部分减轻EMT的程度，提示Par-3蛋白在TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化和肾脏纤维化中可发挥保护性作用。     

六味地黄丸对绝经后骨质疏松症肾阴虚证差异表达基因的影响

目的 探讨六味地黄丸对绝经后骨质疏松症肾阴虚证(POP)差异表达基因的影响。方法 用基因芯片技术比较POP肾阴虚证组与POP肾阳虚证组、POP无肾虚证组、健康对照组受试者外周血基因表达谱,筛选出差异表达基因;六味地黄丸治疗 POP肾阴虚证组3个月后,用基因芯片检测六味地黄丸对这些差异表达基因的影响。结果 ①基因芯片筛选POP肾阴虚证组与其他3组比较均有显著性差异的差异表达基因：ASB1、CLCF1、PROK2、GPR27、C3orf35、GSTM5、MUC12,其中ASB1、CLCF1、 PROK2、GPR27和C3orf35表达下调,GSTM5和MUC12表达上调。②六味地黄丸治疗POP肾阴虚证组3个月后,基因芯片检测 ASB1、CLCF1的表达显著上调,CLCF1参与JAK-STAT信号通路中JAK1、CBP显著下调、STAT4显著上调,而PROK2、GPR27、 C3orf35和GSTM5表达水平治疗前后比较无显著性差异。③六味地黄丸治疗POP肾阴虚证组3个月后,与治疗前相比,共有5701个差异表达基因,其中上调基因3072个,下调基因2629个。结论 六味地黄丸上调POP肾阴虚证差异基因ASB1、CLCF1 的表达,其治疗POP肾阴虚证的机理可能与其上调CLCF1介导JAK-STAT信号通路调控下游CBP表达有关。     

同种异基因大鼠心脏移植急性排斥反应的相关基因分析

目的运用基因芯片技术分析同种异基因大鼠心脏移植后急性排斥反应的基因表达谱。方法建立同种异基因大鼠颈部心脏移植模型,并设同种同基因大鼠颈部心脏移植作为对照。术后5d,两组移植心脏中抽提总RNA,纯化后的mRNA进行逆转录制备杂交探针,应用含有4096个靶基因的表达谱芯片对两组移植心脏组织进行差异表达谱分析。结果两组之间杂交信号有明显差异,同种异基因心脏移植术后差异表达基因共有210条(下调96条,上调114条),其中已知基因有33条(下调13条,上调20条),未知基因177条(下调83条,上调94条);已知基因中有15条(上调2条,下调13条)尚未见报道。结论运用基因芯片技术分析同种异基因心脏移植术后急性排斥相关基因,可为进一步研究其发病机理和为治疗提供新思路。     

应用液相芯片分析肝细胞癌及癌旁组织小分子RNA表达谱差异

目的运用液相芯片技术研究肝细胞癌（HCC）及毗邻癌旁组织中小分子RNA（miRNA）表达谱差异。方法常规抽提20例HCC及对照癌旁组织中总RNA，采用含有114种miRNA的液相芯片及配套的Luminex 100检测系统进行miRNA差异表达谱分析；选取部分筛选出的差异表达miRNA，以半定量逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）和Western blot分析其相对应的靶mRNA和目的蛋白表达状况。结果HCC的miRNA表达谱中差异表达miRNA共有28个，其中上调6个，下调22个，20例标本中共存性差异表达miRNA有9个（上调2个，下调7个，P〈0．01）；选取表达明显上调的miR-222作为进一步研究对象，半定量RT—PCR和Western blot分别证实其调节的靶目标-结缔组织生长因子（CTGF）在mRNA水平HCC和癌旁组织中差异无统计学意义。而蛋白质水平在HCC中表达明显下降。结论液相芯片筛选差异表达miRNA为HCC发病机制和诊断治疗的研究提供了新的思路；miR-18可能通过转录后基因沉默机制抑制CTGF mRNA翻译，从而促进HCC浸润转移。     

醛固酮瘤中长链非编码RNA的差异表达及功能分析

目的研究在醛间酮瘤中有差异表达的长链非编码RNA (Long non-coding RNA,lncRNA)并初步分析后者在醛同酮瘤发生发展中的作用。方法通过基因芯片筛选醛固酮瘤中瘤体相对于瘤旁有差异表达的lncRN A,通过分析得出目标lncRN A,并使用RT-qPCR对目标lncRNA的表达情况进行验证,初步分析该目标lncRNA可能具有的功能。结果经过基因芯片筛选及分析后,得出两条目标lnCRNA——NR_040090、T065445。经过RT-qPCIR验证可知二者在瘤体中表达均为上调,与基因芯片结果一致。经过lncRNA与mRNA共表达分析以及联合分析可知,NR_040090可能与醛固酮合成相关;T065445则既可参与醛固酮合成,也可能介导肾上腺细胞增生从而形成肿瘤。结论 lncRNA——NR_040090、T065445在醛固酮瘤瘤体中表达上调,前者可能与醛固酮瘤中醛固酮过量合成相关,后者可能与醛固酮合成异常及肿瘤形成相关。     

胃癌基因表达谱和蛋白质表达谱的分析研究

目的从转录组水平和蛋白质组水平寻找胃癌组织与正常胃组织间的差异表达基因和蛋白。方法应用含有14592个已知基因及表达序列标签的cDNA表达谱芯片获取基因表达谱信息．50％以上样本中Cy3／Cy5荧光强度比大于或等于2和小于或等于0．5的基因分别为在胃癌中表达上调或下调的基因。采用双向凝胶电泳（2-DE）分离32例经手术切除的胃癌患者的胃癌组织和正常胃组织总蛋白．对差异表达蛋白质点利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI—TOF—MS）进行分析．获取肽质量指纹图谱（PMF）。同时搜索SWISS-PROT数据库鉴定蛋白质。结果与正常组织相比．胃癌组织中差异表达基因共有387个,其中表达上调的有149个基因．上调超过3倍的有29个基因：表达下调的有238个基因．其中下调超过5倍的有21个基因。在蛋白质水平鉴定了15个差异表达蛋白．在肿瘤组织中高表达的有10个．其余5个在肿瘤组织中低表达。胃癌中过表达的基凶与蛋白产物主要与细胞骨架运动、细胞增殖及信号传导有关．表达下调的则主要与细胞免疫防御、毒理代谢有关。结论从转录组水平和蛋白质组水平对胃癌基因表达谱进行分析．不仅有助于从分子水平全方位理解胃癌的发病机制及生物学特性．同时也有助于进一步发现新的胃癌相关标志物和基因治疗的靶点。     

臭椿酮抑制ENST00000441270/miR-149轴影响结直肠癌细胞增殖和凋亡的实验研究

目的探讨臭椿酮对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响。方法根据检测结果实施分组,采用低(0.2μmol/L)、中(0.4μmol/L)、高剂量(0.6μmol/L)的臭椿酮干预结直肠癌SW1116细胞24 h,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞活力,集落形成实验检测克隆形成数,流式细胞术检测细胞凋亡,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测ENST00000441270和微小RNA-149(miR-149)的表达水平。转染ENST00000441270小干扰RNA(si-ENST00000441270)至SW1116细胞,采用上述方法检测干扰ENST00000441270表达对SW1116细胞活力、克隆形成以及凋亡的影响。双荧光素酶报告基因实验验证ENST00000441270与miR-149之间靶向关系。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。结果臭椿酮低剂量组SW1116细胞的活力[(0.84±0.05)比(0.84±0.05),t=0.529,P>0.05]、克隆形成数[(110.00±3.56)个比(111.33±3.86)个,t=0.499,P>0.05]、凋亡率[(7.56±0.80)%比(7.35±0.63)%,t=0.307,P>0.05]、ENST00000441270[(0.98±0.06)比(0.99±0.06),t=0.238,P>0.05]和miR-149[(1.01±0.07)比(0.99±0.07),t=0.303,P>0.05]表达与对照组比较,差异均无统计学意义。臭椿酮中、高剂量组SW1116细胞的活力(0.63±0.04、0.40±0.03比0.84±0.05,t=7.667、12.667,P<0.05]、克隆形成数[(85.67±2.87)个、(58.33±2.62)个比(111.33±3.86)个,t=9.487、24.666,P<0.05]、ENST00000441270表达[(0.69±0.05)、(0.41±0.03)比(0.99±0.06),t=7.138、13.799,P<0.05]低于对照组,差异均有统计学意义,细胞凋亡率[(12.61±0.91)%、(21.66±0.97)%比(7.35±0.63)%,t=7.715、12.036,P<0.05]、miR-149表达[(1.48±0.08)、(1.92±0.10)比(0.99±0.07),t=7.415、14.074,P<0.05]高于对照组,差异均有统计学意义。si-ENST00000441270组SW1116细胞活力[(0.35±0.02)比(0.88±0.05),t=17.047,P<0.05]、克隆形成数[(49.67±2.87)个比(112.67±3.40)个,t=24.525,P<0.05]低于阴性对照(si-NC)组,细胞凋亡率[(22.62±0.82)%比(7.58±0.65)%,t=24.896,P<0.05]高于si-NC组,差异均有统计学意义。miR-149是ENST00000441270的靶基因。结论0.4、0.6μmol/L的臭椿酮能够抑制结直肠癌细胞SW1116增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能与抑制ENST00000441270/miR-149分子轴有关。     

尿肾损伤分子-1预示常染色体显性多囊肾病早期发展速度

目的：探讨尿KIM-1水平与早期ADPKD患者病情进展的相关性,及其预示作用。方法：（1）收集临床确诊为ADPKD患者（CKD1,2期）及体检健康人群各40例,并取其晨起后第2次尿液标本,采用ELISA方法测定尿液中Kim-1浓度,比较多囊肾病人群与正常人群在Kim-1表达程度的差异;（2）用多囊肾患者肾脏体积增长速度判断疾病进展状况,用MRI肾脏成像的方法计算6个月间隔后肾脏体积增长情况;（3）去除肾脏总体积大于1500cm3的患者,以肾脏体积半年增长率2.7%为界,将患者划分为高平均速度组和低平均速度组,比较两组间KIM-1水平差异。结果：（1）多囊肾患者与正常人群相比,eGFR水平（采用CKD-EPI公式计算）差异无统计学意义（P〉0.05）,但尿中Kim-1水平多囊肾病组显著升高[（837.9±821.5）pg/mlvs（440.3±270.2）pg/ml,P〈0.05];（2）多囊肾患者半年肾脏体积增长速度为（4.88±3.86）%,显著高于国外报道的多囊肾患者半年体积增长速度;（3）高平均速度组KIM-1水平高于低平均速度组（P〈0.05）。结论：Kim-1作为肾小管损伤后出现的一种重要的生物标记物在多囊肾病患者群中表达显著升高,能预示早期肾脏体积并未发展到一定程度的多囊肾患者肾体积的增长快慢,但Kim-1在疾病进展中的作用机制仍需要进一步的实验研究阐明。