大鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞的体外培养和鉴定

目的探索大鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞（EPCs）的体外培养、诱导分化及鉴定方法。方法采用密度梯度离心法从Wistar大鼠骨髓中分离出骨髓单个核细胞,并在诱导培养基（EGM-2MV）中培养,贴壁筛选法分离,诱导分化为EPCs;观察EPCs的生长分化过程,对其形态、表型、功能加以鉴定。结果培养3 d,细胞贴壁较为完全,第4天换液后,细胞呈现克隆样生长,第7～8天形成类似成熟血管内皮细胞形态,呈现典型的"铺路石"样外观;诱导培养第7、10天的贴壁细胞CD34、Flk-1及CDl33染色均呈阳性;荧光显微镜下观察,DIL-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色的细胞数占贴壁细胞数的75%以上。结论采用密度梯度离心法获得骨髓单个核细胞,在培养液中贴壁培养,可以扩增出具有典型特征的EPCs。     

兔骨髓源性单核细胞分化为血管内皮祖细胞的体外研究

目的探讨采用密度梯度离心法和差速贴壁法分离兔骨髓源性血管内皮祖细胞,并对分离细胞进行培养及鉴定。方法通过细胞形态观察、免疫荧光染色、管腔形成实验以及低密度脂蛋白吞噬和植物凝集素贴附实验进行鉴定。结果分离培养的细胞呈多角形生长,细胞能够形成放射样克隆集落,细胞表达血管假性血友病因子(vW F),在基质胶呈管腔样生长,吞噬低密度脂蛋白并能够黏附植物凝集素。结论采用密度梯度离心法和差速贴壁法分离兔骨髓源性干细胞,在一定条件下能分化成为血管内皮祖细胞。     

成人骨髓间充质干细胞的体外分离培养与鉴定

目的 对成人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)进行体外分离培养与鉴定,研究其生物学特性.方法 将密度梯度离心法获得的单个核细胞,用贴壁培养法分离纯化、扩增获得大量hBMSCs,观察细胞形态,分析细胞生长特性,并经流式细胞仪检测细胞表面抗原、细胞周期,和进行成骨诱导鉴定.结果 经密度梯度离心和贴壁培养法可成功分离纯化、扩增得到大量hBMSCs,其细胞形态、分化特性和表型均符合干细胞特点,在特定培养条件下能向成骨细胞分化.结论 骨髓间充质干细胞分离扩增容易,细胞增殖能力和成骨性能好,是骨组织工程理想的种子细胞.     

脐血间充质干细胞的分离扩增及向成骨及脂肪细胞的分化

目的探讨新生儿脐血间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）体外分离、纯化、扩增，以及向成骨及脂肪细胞定向诱导分化的方法与条件。方法无菌条件下收集新生儿脐血60～120ml，枸橼酸钠抗凝，以Ficoll—Hypaque淋巴细胞分离液密度梯度法、沉降红细胞后密度梯度法及CD34^＋免疫磁珠负选法分离单个核细胞（mononuclear cells，MNCs）。分离获得的MNCs采用L—DMEM培养基或Mesencult^TM培养基／10％胎牛血清进行MSCs培养传代，获得第3代集落生长细胞作流式细胞仪表面抗原测定，并向成骨及脂肪细胞定向诱导分化，成骨细胞钙沉积经茜素红染色鉴定，脂肪细胞胞浆油滴经油红染色鉴定。结果经沉降红细胞后分离的MNCs，使用Mesencult^TM培养基／10％胎牛血清培养成功率高，第3代可出现明显的集落生长，而另两种方法分离培养的细胞则难以形成集落；集落细胞表面抗原测定表达CD29、CD59、CD71而不表达CD34、CD45及HLA—DR等分子。成骨定向诱导分化的集落细胞经茜素红染色胞浆中出现有大量的钙沉积；成脂肪定向诱导分化的集落细胞油红染色示胞浆充满油滴空泡。结论新生儿脐血中可分离出MSCs，并可在体外进行培养扩增。以甲基纤维素沉降红细胞后密度梯度离心分离的MNCs培养较为有效，集落细胞表达基质细胞表面抗原，能够向成骨细胞及成脂肪细胞定向诱导分化。     

骨髓血管内皮祖细胞移植提高缺血皮瓣存活率的研究

目的：探讨大鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）移植促进缺血皮瓣的血管新生,从而提高皮瓣存活率的可能性。方法：在Wistar大鼠背部形成2cm×8cm蒂部位于双侧髂棘连线上的随意型超比例皮瓣,建立缺血皮瓣模型。采用密度梯度离心法从Wistar大鼠骨髓中分离出骨髓单个核细胞,并在专有的诱导培养基（EG-M2MV）中培养,贴壁筛选法分离,诱导分化为EPCs;对细胞的形态、表型、功能加以鉴定。将EPCs注射移植于iWstar大鼠背部的缺血皮瓣,大体观察皮瓣的存活率,vWF免疫酶染色法检测皮瓣毛细血管密度。以缺血皮瓣单纯注射磷酸盐缓冲液（PBS）的Wistar大鼠作为对照组。结果：骨髓中分离培养的EPCs呈现典型的＂铺路石＂样外观,表达CD34、Flk-1及CDl 33表型,能够摄取DIL-ac-LDL和特异性结合FITC-UEA-1。注射EPCs组的缺血皮瓣存活率以及毛细血管密度显著高于对照组（P〈0.05）。结论：骨髓中的EPCs在体外培养后注射移植于皮瓣内,可以促进缺血性皮瓣的血管新生,提高缺血性皮瓣的存活率。     

内皮祖细胞体外侵袭肝癌及成管能力的研究

目的 探讨小鼠骨髓源性血管内皮祖细胞(EPCs)体外形成管腔样结构和侵袭H22肝癌细胞的可能性和条件.方法 密度梯度离心法获取小鼠骨髓中单个核细胞,利用序列差速贴壁方法(依次在培养1 h和24h后提取上清液中细胞)诱导培养,噻唑蓝(MTY)比色法检测在1、3、7、10、13、16、20d的细胞增殖能力,从细胞形态、免疫荧光、细胞免疫表型对培养细胞进行鉴定并观察培养1周后细胞的体外形成管腔结构及侵袭肝癌细胞的能力.结果 EPCs在1周内呈集落样生长,1周后"鹅卵石"样结构;能吞噬低密度脂蛋白和膜连接荆豆凝集素,双染阳性率(96.46±1.74)%;EPCs表达CD34(91.23±3.76)%、血管内皮生长因子受体(VEGFR)-2(92.85±2.12)%,但CD133(61.54±13.71)%;EPCs在能够形成管腔样结构(26.6±13.4)/高倍镜(×100);并向肿瘤细胞富集.结论 小鼠骨髓中富含EPCs,利用序列差速贴壁方法得到较高纯度EPCs,并表现成血管倾向、侵袭肿瘤组织的能力.

Abstract：

Objective To investigate the possibilities and terms of endothelial progenitor cells (EPCs) derived from mouse bone marrow forming the tube and invading the hepatocellular carcinoma cells H22 Clusters. Methods Bone marrow mononuclear cells were gained by density-gradient centrifugation.After culture for 1 h and 24 h, the nonadherent cells were extracted with the method of sequence of differential adhesion and then were induced by EGM-2 medium. Cell multiplication was tested by methyl thiazol tetrazolium (MTT) chromatometry at 1, 3, 7, 10, 13, 16, 20 days. The cells were identified by cell morphology, immunofluorescence and flow cytometry analysis, and the abilities of forming the tube and invading the hepatocellular carcinoma cells were observed after culture for 1 week. Results The EPCs grew as colony-forming units within 1 week and as cobblestones after 1 week. The cells could phagocytize the lowdensity lipoprotein and membrane binded Ulex Europaeus agglutinin with double-positive percentage (96. 46 ± 1.74)%. The positive expression rate of CD34 and vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR)-2 was (91.23 ±3.76)% and (92. 85 ±2. 12)% respectively, and that of CD133 was (61.54 ± 13.71)%. EPCs could form tubes and recruit to the tumor cells. Conclusion EPCs were rich in mouse marrow and could be obtained by means of sequence of differential adhesion. The EPCs can form tubes and invade the malignant cell cluster.     

血管紧张素Ⅱ对骨髓间充质干细胞定向诱导为角质形成细胞调控作用的实验研究

目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为角质形成细胞的可能性及在此过程中血管紧张素Ⅱ （AngⅡ）对其的调控作用.方法：抽取Wistar大鼠的骨髓,经全骨髓法分离、纯化MSCs,鉴定后建立MSCs细胞模型,用成胶质细胞诱导培养基诱导其为角质形成细胞,显微镜下观察其形态学变化.以添加了AngⅡ 的成角质形成细胞诱导培养基组与单纯成角质形成细胞诱导培养基组在诱导MSCs 7天、10天后行角蛋白10（CKP10）免疫组织化学染色及流式细胞仪检测,并进行对比观察分析.结果：培养的MSCs具有成脂、成骨分化的能力.MSCs可以成功诱导为角质形成细胞,添加Ang Ⅱ的诱导组与对照诱导组CKP10免疫组化染色均有阳性表达,但添加AngⅡ组阳性细胞数高于对照组.流式细胞仪检测显示CKP10阳性细胞百分率,AngⅡ组为80.62％,对照组（32.46％）,两者相差显著（P＜0.05）.结论：MSCs可以诱导分化为角质形成细胞,ANGⅡ对MSC的成角质形成细胞分化有显著的促进作用,这一作用可能是AngⅡ 促进创面愈合的机制之一.     

胚胎源脊髓组织诱导骨髓基质干细胞向神经元样细胞的分化

目的体外诱导大鼠骨髓基质干细胞（BMSC）分化为神经元样细胞。方法采用Percoll（密度：1．073g／ml）梯度分离液，离心分离鼠BMSC，体外培养，提取大鼠胚胎脊髓组织匀浆诱导BMSC分化为神经元样细胞。形态学观察及免疫组织化学鉴定神经元烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF-200）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。结果大鼠骨髓基质干细胞在诱导后细胞形态变化，突起交织；免疫组织化学发现分化细胞NSE、NF-200表达阳性率分别为（68．0±1．7）％，（76．2±2．9）％，少数GFAP阳性。结论胚胎脊髓组织匀浆可诱导骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞。     

人骨髓内皮祖细胞的分离、诱导培养和扩增

目的 探讨并改进从人骨髓中分离、诱导培养和体外扩增内皮祖细胞(EPCs)的方法 ,为EPCs参与基础研究和临床应用奠定基础. 方法 采用不同的细胞分离液,用密度梯度离心法从正常人骨髓中分离单个核细胞(hBMMNCs),分别培养在包被人纤维连接蛋白(HFN包被组),包被明胶(明胶包被组)和未包被(未包被组)的培养皿内,利用EBM-2培养4～7 d后出现细胞克隆集落(cell colony-forming units,CFUs),挑选内皮祖细胞样CFUs继续培养(CFUs挑选法),采用流式细胞仪检测CD34 KDR 和CDl33 KDR 双荧光阳性细胞,细胞免疫化学法检测EPCs表面标记CD133、CD34、CD31、vWF和KDR的表达. 结果 用OptiprepTM分离液可从人骨髓中更有效地分离出hBMMNCs,进而诱导获取更多EPCs并可进行体外培养扩增;流式细胞仪检测结果 显示CD133 KDR 细胞高达70.4%±5.4%,CD34 KDR 细胞高达69.1%±8.7%;HFN包被组和明胶包被组细胞生长一样旺盛,均可促进EPCs的贴壁生长,促进其生长的作用差异无统计学意义(P＞0.05),而未包被组细胞生长数量最少.培养7d的贴壁细胞表面标记CD133、CD31、vWF和KDR均呈阳性,培养14d的贴壁细胞表面标记CD34呈阳性. 结论 CFUs挑选法可以从人骨髓中成功地获取更多EPCs并在体外扩增,提出了另一种获取EPCs的高效简单方法 ,进一步拓宽了获取EPCs的方法 和范围.     

内皮祖细胞的生物学特性及其在皮肤创面修复中的作用

内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）主要生成和存在于骨髓中,是一种能定向分化为成熟血管内皮细胞（endothelial cells,ECs）,具有自我更新、游走、高增殖潜能和定向分化特性的前体细胞。     

内皮前体细胞与口腔鳞癌细胞自发性融合的实验研究

目的：探讨骨髓源间充质干细胞之外的其它骨髓来源的细胞是否能够与口腔鳞癌细胞发生自发性融合。方法：5ml外周血经密度梯度离心和EGM-2MV培养基进行诱导培养内皮前体细胞。PKH26标记的内皮前体细胞（EPCs）与CFSE标记的口腔鳞癌细胞系Cal 27,SCC 4及SCC 9共培养,24h后双阳性且具有多个核的细胞为融合细胞。细胞流式分析检测内皮前体细胞与三种鳞癌细胞系的融合率。免疫荧光双染检测具有上皮标记物（Cytokeratin）及间质细胞标记物（Vimentin）的双阳性细胞。结果：单个核细胞诱导培养8～12天可见内皮样克隆形成;共培养24h能够检测到具有多个核PKH26/CFSE双阳性细胞;细胞流式分析显示内皮前体细胞与不同口腔鳞癌细胞的融合率分别为0.62±0.028,0.59±0.057,0.65±0.099。统计学分析表明融合率之间无显著统计学差异（P=0.706）.荧光双染显示共培养体系中存在共表达Cytokeratin/Vimentin的双阳性细胞。结论：内皮前体细胞能够与口腔鳞癌细胞发生自发性融合且融合细胞共表达Cytokeratin/Vimentin,可为从细胞融合角度解释EMT转化及肿瘤侵袭提供基础研究依据。     

辛伐他汀对骨髓源性内皮祖细胞动员及迁移的影响

目的研究辛伐他汀对兔内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）迁移、动员的影响。方法将2只兔从髂骨抽取骨髓,采用贴壁法,在条件培养基M199中培养EPCs,并用免疫荧光法鉴定CD34、CD133、VEGFR-2。经鉴定的EPCs,在不同浓度辛伐他汀（分别为0.01,0.1,1.0μmol/L）作用下,Transwell实验观察辛伐他汀对EPCs迁移的影响。6只兔随机分为实验组和对照组,每组3只。6只兔颅骨造极限骨缺损模型,实验组和对照组在颅骨缺损处分别植入辛伐他汀复合聚乳酸薄饼或聚乳酸薄饼,术后10天,取外周血,流式细胞仪检测CD34/CD133双阳性细胞表达率,观察辛伐他汀对EPCs动员的效果。结果Transwell实验,辛伐他汀作用于EPCs16小时,0.1μmol/L和1.0μmol/L辛伐他汀组细胞迁移数量OD值（0.097±0.011,0.099±0.019）较0.01μmol/L辛伐他汀组（0.075±0.013）与对照组（0.077±0.014）多,差异有显著性（P〈0.05）。造模术后10天,辛伐他汀组3只兔外周血中CD34^＋/CD133^＋细胞表达率为0.28%,0.84%,0.28%,对照组为0.26%,0.11%,0.09%。结论辛伐他汀可动员EPCs到外周血,可提高骨髓源性EPCs的迁移能力。     

长期血液透析患者内皮祖细胞变化与同型半胱氨酸的关系

目的检测长期血液透析患者内皮祖细胞（EPCs）数量和功能的改变，并探讨其与同型半胱氨酸的关系。方法采用密度梯度离心法分离培养长期血液透析患者和健康者的外周血单个核细胞，将其接种在人纤维连接蛋白包被培养板，7d后取贴壁细胞进行Dil—LDL和FITC—UEA-I双染色，并通过流式细胞仪检测其表面标志CD34、CD133、KDR，以鉴定EPCs。采用改良的Boyden小室、粘附功能检测评价其迁移和粘附能力，并与患者血清半胱氨酸含量进行相关性分析。结果患者EPCs的数量和迁移、粘附功能都低于健康者，差异有统计学意义（P〈0．05）；患者血清半胱氨酸含量[（57．10±24．76）umol／L]显著高于健康者[（6．75±3．58）umol／L]（P〈0．05），并且含量与患者EPCs的数量和迁移、粘附功能分别呈明显负相关（P〈0．05）。结论长期血液透析患者的EPCs数量减少，功能降低，可能与患者的高同型半胱氨酸血症有关。     

Differential analysis of peripheral blood‐ and bone marrow‐derived endothelial progenitor cells for enhanced vascularization in bone tissue engineering

For tissue engineering applications, effective bone regeneration requires rapid neo‐vascularization of implanted grafts to ensure the survival of cells in the early post‐implantation phase. Incorporation of autologous endothelial progenitor cells (EPCs) for the promotion of primitive vascular network formation ex vivo has offered great promise for improved graft survival, enhanced rate of vascularization and bone regeneration in vivo. For clinical usage, identification of an optimal EPC isolation source from the patient is critical. We have, for the first time, characterized and directly compared EPCs from rabbit peripheral blood and bone marrow (PB‐EPCs and BM‐EPCs, respectively). PB‐EPCs outperformed BM‐EPCs on all measures. PB‐EPCs displayed typical endothelial cell markers, such as CD31, as well as high angiogenic potential in three‐dimensional extracellular matrix in vitro. Furthermore, PB‐EPCs cultured simultaneously with mesenchymal stem cells, displayed significantly enhanced expression levels of key osteogenic and vascular markers, including alkaline phosphatase, bone morphogenetic protein 2, and vascular endothelial growth factor. On the contrary, putative BM‐EPCs did not express CD31, and instead, expressed key smooth muscle markers. BM‐EPCs further failed to display vasculogenic activity. Hence, the highly angiogenic PB‐derived EPCs may serve as an ideal cell population for enhanced vascularization and success of engineered bone tissue. © 2012 Orthopaedic Research Society. Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res 30:1507–1515, 2012     

体外诱导骨髓间充质干细胞向肾小管上皮样细胞分化

目的 观察不同条件下骨髓间充质干细胞（MSC）体外诱导分化为肾小管上皮样细胞的差异。 方法 抽取SD大鼠的骨髓,经密度梯度离心分离,联合贴壁筛选法获取纯化的MSC。以流式细胞仪鉴定间充质干细胞表面标志。取扩增3代的MSC分组培养：（1）对照组：用含胎牛血清培养基;（2）全反式维甲酸（ATRA）组：胎牛血清+缺血再灌注肾脏匀浆上清+ATRA;（3）联合诱导组：胎牛血清+缺血再灌注肾脏匀浆上清+ATRA+表皮生长因子（EGF）+骨形成蛋白（BMP-7）。诱导7 d后,倒置显微镜下观察细胞形态变化;化学染色检测细胞碱性磷酸酶表达;免疫细胞化学法检测细胞角蛋白18（cytokeratin-18）、E钙黏蛋白(E-cadherin)的表达。 结果 流式细胞仪显示,体外分离培养的第3代MSC,CD44阳性细胞表达率为97.8%±0.9%;CD90阳性细胞表达率为96.8%±1.4%;CD29阳性细胞表达率为97.6%±2.4%;而CD11b/c阳性细胞表达率为13.2%±0.6%; CD34阳性细胞表达率为1.2%±0.5%。诱导7 d后,与对照组长梭形细胞相比,ATRA组部分细胞为圆形、短梭形单层排列;联合诱导组的大部分细胞为圆形、短梭形,细胞密集处呈鹅卵石样排列。碱性磷酸酶染色显示,对照组细胞为阴性;ATRA组部分细胞阳性;联合诱导组阳性细胞数明显增多。免疫细胞化学显示,ATRA组和联合诱导组细胞cytokeratin-18阳性表达率分别为29.47%±1.08%和47.52%±2.13%,显著高于对照组（P ＜ 0.05）;E-cadherin阳性表达率分别为14.88%±2.46%和36.15%±1.13%,也显著高于对照组（P ＜ 0.05）。 结论 在体外模拟的急性肾衰竭微环境中加入ATRA可诱导MSC部分分化为肾小管上皮样细胞。联合EGF、BMP-7共同诱导能进一步促进MSC向肾小管上皮样细胞分化。     

人脐血CD133+血管内皮祖细胞的培养、鉴定与分化研究

目的探讨从人脐血中分离、体外培养CD133^＋血管内皮祖细胞（EPCs）的方法及其生长特性和鉴定。方法采用密度梯度离心法结合MACS分选法提取人脐血中CD133^＋细胞,进行流式细胞仪检测纯度,予EBM-2培养液接种培养,观察其生长特性;利用Dil-LDL及FITC-Lectin摄取实验、细胞免疫组织化学等进行鉴定。结果经流式细胞仪检测CD133^＋细胞平均占单核细胞的（1．13±0．10）％,磁珠分选所得CD133^＋细胞平均纯度为（91．45±1．04）％;CD133^＋细胞贴壁生长,可分化为梭形血管内皮细胞及形成集落;CD133^＋细胞培养过程中Dil-LDL及FITC-Lectin摄取阳性,双染阳性率为（95．83±1．72）％;CD133^＋细胞培养1周后经免疫组织化学检测CD34、Ⅷ因子阳性率分别为（95．83±2．23）％和（95．92±1．43）％,与人脐静脉内皮细胞比较差异无统计学意义;CD133^＋细胞体外培养4d、1周可形成小血管结构。结论免疫磁珠分选法可获取较高纯度CD133^＋血管内皮祖细胞,在生长因子作用下诱导其分化为成熟血管内皮细胞。     

紫绀型先天性心脏病病人循环内皮祖细胞的数量及功能变化

目的 探讨紫绀型先天性心脏病病人外周血内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)的数量及功能特点.方法 选取法洛四联症及单纯室间隔缺损病人各10例,采用Ficoll密度梯度离心法从外周血中分离单个核细胞,用添加牛脑垂体提取物和胎牛血清的M199培基进行体外诱导分化培养.用免疫组化和透射电镜行EPC表型鉴定;采用流式细胞仪计数CD133+/KDR+细胞;采用改良的Boyden小室,黏附能力测定实验和MTT比色法,观察EPC的迁移、黏附及增殖能力.结果 紫绀型先天性心脏病病人外周血内皮祖细胞的数量增多[集落记数(14.7±3.1)/100倍视野对(8.2±1.3)/100倍视野;DiIAcldl+/UEA-Ⅰ+细胞数(72.2±9.73)/200倍视野对(51.2±3.83)/200倍视野;CD133+/KDR+细胞百分比(0.66±0.20)%对(0.18±0.08)%,P＜0.01],其迁移能力[(140.6±9.24)/200倍视野对(91.84±8.58)/200倍视野]、黏附能力[(149.00±11.58)/200倍视野对(112.6±7.02),200倍视野]及增殖能力(OD值0.34±0.02对0.27±0.01)增强(P＜0.01).结论 紫绀型先天性心脏病病人循环内皮祖细胞的数量增多,其迁移、黏附及增殖能力增强.     

Adult endothelial progenitor cells retain hematopoiesis potential

Hematopoietic stem cells (HSCs) are derived from endothelium in the aortic-gonado-mesonephric (AGM) region during embryogenesis. But little is known about whether endothelial progenitor cells (EPCs) retain hematopoiesis potential after birth. In this study, we isolated adult EPCs from the bone marrow of C57BL/6 mice and identified them with an endothelial functional assay and by the CD31(+) CD133(+) CD45(-/dim) VEGFR2(+) phenotype. EPCs isolated from green fluorescence protein (GFP) transgenic C57BL/6 mice were cotransfused with bone marrow cells from wild-type C57BL/6 mice into lethally irradiated BABL/c mice. One month after transplantation, granulocytes (25.73 ± 5.43%) and lymphocytes (12.68 ± 3.26%) in peripheral blood showed GFP(+), referred to as donor EPC-derived blood cells. After an additional month, the percentage of GFP(+) granulocytes decreased to (3.69 ± 1.43%), whereas the percentage of GFP(+) lymphocytes showed no significant difference. Most of the GFP(+) elements showed a diffuse distribution in the spleen; but some were present as aggregates forming lymphoid nodules. GFP(+) endothelial cells were observed in the liver sinusoids, intestinal villi, and lung of recipient mice. These results indicated that adult EPCs not only took part in vasculogenesis, but also retained hematopoietic ability.