BMS-345541对人骨肉瘤细胞MG63凋亡及其作用机制

目的研究BMS-345541对人骨肉瘤细胞MG63凋亡的影响及其可能的机制。方法以0、2、4、6、8、10μmol/L BMS-345541处理MG63细胞24、48 h后,用CCK-8法检测细胞存活率。用0、2、4、8μmol/L药物作用细胞24 h后,以PI染色法观察细胞凋亡情况、流式细胞仪检测细胞凋亡。以同样浓度作用细胞48 h,Western-blot检测cleaved Caspase-3蛋白表达情况。结果 (4-10)μmol/L的BMS-345541均可抑制MG63细胞的增殖,其抑制效应呈剂量-时间依赖性,48 h最低存活率只有(0.412±0.024)(P0.05)。PI染色荧光显微镜观察结果发现:随药物浓度增高,相同视野下正常细胞数逐渐降低,凋亡细胞数逐渐增高。流式细胞仪分析:0、2、4、8μmol/L的作用BMS-345541 24 h后,凋亡率分别为(5.2±0.78)%、(5.82±0.82)%、(8.86±1.71)%、(11.01±2.69)%,与对照组相比,8μmol/L组差异有统计学意义(P0.05)。Western blot结果显示MG 63细胞中的cleaved caspase-3蛋白表达量上调,与对照组相比,2、4、8μmol/L组差异均有统计学意义(P0.05)。结论 BMS-345541可抑制MG63细胞增殖,并诱导其发生凋亡,其作用机制可能与cleaved caspase-3表达上调有关。     

成骨诱导双基因共表达腺病毒载体的构建

目的 探讨用一条Link序列T2A连接骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因构建含目的 基因的腺病毒载体的可行性.方法 先从cDNA中扩增得到全长BMP-2和bFGF基因片段,再接于Link序列T2A的两端.通过T2A Peptide的互补.延伸得到BMP2-T2A-bFGF的全长PCR产物,利用上游引物的Bgl Ⅱ酶切位点和下游引物的EeoRV酶切位点将其插入到pShuttle-IRES载体中,酶切、测序鉴定;利用同源重组技术将目的 基因表达框从穿梭质粒转移到腺病毒载体,鉴定阳性克隆;将PacI线性化后的腺病毒载体转染到293A细胞,观察GFP表达,PCR鉴定后进行大量扩增,并用CsCl梯度离心法进行纯化;测量A260,计算病毒感染滴度.结果 克隆得到的BMP-2与bFGF基因测序正确.经BglⅡ和EeoR Ⅴ双酶切得到的BMP2-bFGF 2个基因全长序列完全克隆到穿梭质粒和重组腺病毒载体质粒中;转染293A细胞2周后观察到明显的GFP聚集表达,即病毒包装成功,扩增纯化后滴度为3.6×1011 VP/ml.结论 经酶切鉴定BMP-2与bFGF双基因共表达腺病毒载体构建成功.     

新型钌(Ⅱ)配合物抑制人骨肉瘤U-2OS细胞增殖及其机制

目的研究新型钌(Ⅱ)多吡啶配合物[Ru(dmp)2Nadpip](Cl O4)2(Ru 1)对人骨肉瘤U-2 OS细胞增殖抑制及相关机制。方法 MTS法检测细胞增殖抑制情况,DAPI染色观察细胞吸收Ru1作用部位情况,Hoechst-33258染色观察Ru1作用后细胞核的形态变化,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期情况。结果 (6.25~100.00)μmol/L的Ru 1均能不同程度抑制骨肉瘤细胞增殖,其24、48、72 h半数抑制浓度(IC50)分别为113.26、45.52、41.00μmol/L,对骨肉瘤细胞增殖抑制作用呈时间-剂量依赖关系。细胞吸收结果显示Ru 1能进入细胞质,聚集并作用于细胞核内。药物处理后的细胞经Hoechst-33258染色,细胞核出现致密浓染,或呈碎块状致密浓染。100.0、50.0、25.0μmol/L Ru 1作用于细胞48 h后的凋亡率分别为(38.51±3.72)%、(21.13±2.03)%、(11.75±2.54)%,与对照组比较,差异均有统计学意义(P0.05)。流式检测药物作用后的U-2 OS细胞呈现G0/G1期阻滞,并呈时间-剂量依赖效应。结论 Ru 1能抑制U-2 OS细胞增殖,诱导其发生凋亡并呈现G0/G1期阻滞,均与时间、剂量正相关。     

成人骨髓间充质干细胞的体外分离培养与鉴定

目的 对成人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)进行体外分离培养与鉴定,研究其生物学特性.方法 将密度梯度离心法获得的单个核细胞,用贴壁培养法分离纯化、扩增获得大量hBMSCs,观察细胞形态,分析细胞生长特性,并经流式细胞仪检测细胞表面抗原、细胞周期,和进行成骨诱导鉴定.结果 经密度梯度离心和贴壁培养法可成功分离纯化、扩增得到大量hBMSCs,其细胞形态、分化特性和表型均符合干细胞特点,在特定培养条件下能向成骨细胞分化.结论 骨髓间充质干细胞分离扩增容易,细胞增殖能力和成骨性能好,是骨组织工程理想的种子细胞.     

新型钌(Ⅱ)配合物抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖并诱导其凋亡

目的 通过体外实验探讨新型钌(Ⅱ)多吡啶配合物△-[Ru(phen)2MCMIP]2+(△-1)对人骨肉瘤细胞MG-63株增殖及凋亡作用. 方法 CCK-8法检测经0.00、12.50、25.00、50.00、100.00、150.00 μmol/L△-1作用24、48、72 h后,MG-63细胞的增殖情况;流式细胞术检测经0.00、25.00、50.00、100.00 μmol/L△-1作用24h后,MG-63细胞的凋亡及周期变化. 结果 △-1可明显抑制人骨肉瘤MG-63细胞增殖,并呈明显剂量和时间依赖性;24、48、72 h IC5o分别为57.80 μmol/L、45.27 μmol/L、32.51 μmol/L;流式细胞术检测得不同浓度△-1作用24h后,细胞早期凋亡比例从(1.06±0.12)％上升至(37.10±1.25)％,细胞周期被阻滞在Go/G1期. 结论 △-1能抑制MG-63细胞增殖,诱导细胞凋亡,并将细胞周期阻滞在Go/G1期.     

钌(Ⅱ)多吡啶配合物诱导骨肉瘤细胞凋亡及其机制

目的 研究钌(Ⅱ)多吡啶配合物[Ru(dmb)2 (DBHIP)] (ClO4)2对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡的诱导作用及机制. 方法 在培养液体系中加入不同浓度的钌(Ⅱ)多吡啶配合物对骨肉瘤MG-63细胞进行诱导,以CCK-g计数法测细胞生长曲线、细胞集落形成法观察细胞生长抑制情况,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡情况,Hoechst-33258染色观察细胞核的形态变化. 结果 发现(6.25～100) μmol/L钌(Ⅱ)多吡啶配合物均能不同程度抑制骨肉瘤细胞增殖,其半数致死浓度(LD50)为(66.10±0.228) μmol/L,对骨肉瘤细胞生长有抑制作用呈时间和剂量依赖关系,作用96 h后最高抑制率达80.2％.50.0、25.0、12.5 μmol/L钌(Ⅱ)多吡啶配合物作用于细胞24h后的凋亡率分别为(71.43±9.99)％、(57.63±2.78)％、(24.07±3.83)％,与对照组(3.30±0.33)％比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);流式检测药物作用后的骨肉瘤细胞,呈现G1/G0期阻滞,并呈剂量依赖效应,浓度越高细胞处在G1/G0期的比例越高.药物处理后的细胞经Hoechst-33258染色,细胞核出现浓染致密的固缩形态和颗粒状荧光. 结论 钌(Ⅱ)多吡啶配合物能够诱导人骨肉瘤细胞发生凋亡,呈现G1/G0期阻滞,与时间、剂量正相关.     

钌(Ⅱ)配合物[Ru(dmp)2(NMIP)](ClO4)2抗骨肉瘤HOS细胞的凋亡

目的探讨钌(Ⅱ)配合物[Ru(dmp)_2(NMIP)](ClO_4)_2对人骨肉瘤HOS细胞的凋亡作用初步作用机制。方法采用荧光定量PCR检测钌(II)配合物作用于人骨肉瘤HOS细胞后RNA变化,蛋白免疫电泳法检测钌(II)配合物作用于人骨肉瘤HOS细胞后细胞凋亡蛋白变化。结果钌配合物作用于HOS细胞24 h后,提取总基因逆转录后做荧光定量PCR。相比对照组,25、50、100μmol/L钌配合物组Bcl_2的mRNA表达明显降低(分别为0.86±0.02、0.52±0.01、0.4±0.01)(P<0.05),而Bax的mRNA表达明显升高(分别为1.18±0.18、1.7±0.10、1.69±0.10),Caspase3的mRNA表达明显升高(分别为1.22±0.11、1.61±0.12、1.62±0.06)。0、25、50、100μmol/L钌配合物能降低细胞体内Bcl2蛋白表达(分别为0.52±0.03、0.55±0.08、0.39±0.02、0.14±0.01),增加Bax蛋白表达(分别为0.52±0.01、0.60±0.02、0.64±0.03、0.62±0.02),增加Caspase3蛋白表达(分别为0.57±0.01、0.61±0.01、0.68±0.01、0.64±0.01)(P<0.05)。结论钌配合物通过线粒体引起的内源性凋亡通路引起骨肉瘤细胞凋亡。     

蝎毒多肽对人骨肉瘤细胞株MG-63活性的影响

目的探讨蝎毒多肽对人骨肉瘤MG-63细胞增殖凋亡的影响。方法利用0、4、8、12μg/mL浓度蝎毒多肽处理MG-63细胞12、24、48 h,CCK-8法检测细胞活性、镜下观察细胞形态变化、吖啶橙荧光染色法观察细胞凋亡,8μg/mL蝎毒多肽处理MG-63细胞24、48 h,Hoechst-33258荧光染色观察细胞核染色质形态。结果 4、8、12μg/mL的蝎毒多肽可抑制MG-63细胞活性,抑制其增殖,呈剂量-时间依赖性。8μg/mL处理24 h细胞存活率为0.5506±0.0502,与对照组比较,差异有统计学意义(P0.01)。吖啶橙荧光染色,细胞染色质浓缩,细胞核碎裂成点状,被染成大小不一、致密浓染的绿色颗粒,随着浓度增大、时间延长,坏死细胞逐渐增多。呈现凋亡核碎裂典型变化,随剂量增加更趋明显。呈剂量依赖性抑制其增殖能力。Hoechst-33258染色观察可见凋亡细胞染色质呈固缩或碎裂状染色质,染色质着色不均,核形态各异。随作用时间增加而更趋明显。结论蝎毒多肽可以抑制骨肉瘤细胞活性,抑制其体外增殖,诱导其发生凋亡,该作用呈剂量依赖和时间依赖。