灵芝液体发酵产漆酶最佳培养基和培养条件研究

目的研究灵芝液体发酵产漆酶的最佳培养基和培养条件。方法以灵芝S3号菌株为试验材料,以灵芝漆酶活性为衡量指标,通过正交试验分别对灵芝液体发酵培养基及培养条件进行优化筛选。结果筛出最佳培养基组成为葡萄糖30g/L、棉花0.2%、磷酸氢二铵0.66g/L、干酪素0.5%、聚山梨酯-800.15%;优化培养条件为初始pH5.5、装液量75mL、接种量12.5%、菌龄5×24h、培养时间9×24h。结论优化培养基及培养条件后,发酵液中灵芝漆酶活性显著提高。     

里氏木霉产胞外多糖发酵条件的优选研究

目的：建立简便有效的里氏木霉胞外多糖提取发酵工艺,为木霉胞外多糖的进一步开发利用奠定基础。方法以粗胞外多糖产量为指标,采用单因素试验优化发酵培养基配方,利用正交试验对摇瓶培养过程中的发酵液初始 pH、孢子接种量、发酵温度及发酵时间进行优选。结果里氏木霉发酵最佳控制参数为：培养基配方为蔗糖50 g/L、酵母粉20 g/L、K2HPO4·3H2O 8 g/L、MgSO40.5 g/L;发酵条件为发酵液初始 pH5.0、孢子接种量10%、发酵温度28℃、发酵时间190 h。优选发酵条件下里氏木霉粗胞外多糖产量达到21.6 g/L（RSD=2.54%, n=3）。结论优化的里氏木霉胞外多糖发酵提取工艺是一种简便、合理、可行和产量较高的提取工艺。     

链霉亲和素产生菌培养条件的研究

目的；通过对分泌链霉亲和素（streptavidin)的菌株L－183最佳培养条件的研究，为提高链霉亲和素的产量及其规模生产打下了基础。方法：选用3种种子培养基和5种发酵培养基，通过检测种子菌体湿质量、间接ELISA检测发酵液中链霉亲和素的效价，筛选出菌体生长快的种子培养基及链霉亲和素产量高的发酵培养基。结果：B号种子培养基、2＃发酵培养基最适合L－183的生长和链霉亲和素合成；不同菌种接种量对链霉亲和素的产量也有明显影响，在140ml发酵液中，种子接种量为0．3ml，链霉亲和素产量可达111mg/L。结论：本实验筛选的培养基价格低廉，且L－183生长快、链霉亲和素产量高，可以作为规模生产链霉亲和素的首选培养基。     

槲寄生内生真菌发酵液的抗肿瘤作用机理研究

目的：对槲寄生内生真菌抗肿瘤活性菌株发酵液的抗肿瘤机理进行初步研究,为进一步开发利用槲寄生内生真菌资源提供实验和理论依据。方法：利用实时细胞分析系统(RT-CES系统)对该菌株发酵液作用于细胞群落的整体生物学功能进行实时检测,构建发酵液作用效果的“细胞指纹图谱”,推断发酵液可能的抗肿瘤作用机理;进一步采用透射电镜、DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术检测该菌株发酵液诱导的肿瘤细胞凋亡作用。结论：通过本研究,我们推断发酵液的抗肿瘤作用机理是：通过抑制微管解聚使肿瘤细胞有丝分裂终止促进肿瘤细胞凋亡,最后导致肿瘤细胞死亡;通过诱导肿瘤细胞凋亡抑制其生长,从而导致细胞死亡。     

长双歧杆菌液态发酵条件的优化及生长曲线的测定

目的优化长双歧杆菌的液态发酵条件。方法通过单因素试验方法,考察长双歧杆菌液态培养基的最佳初始pH、培养温度、接种量和培养时间。结果长双歧杆菌的最佳发酵条件为:发酵液初始pH 7.0、发酵培养温度39℃、发酵接种量6%、最佳培养时间8～10 h。结论本课题研究确定的发酵工艺有效地提高了长双歧杆菌的培养效率。     

厚朴内生真菌的分离鉴定及药理学活性的分析

目的：从要用植物厚朴的枝条的皮质部分离内生真菌,并对抗肿瘤,抑菌等药理学活性进行分析。方法：采用马铃薯葡萄糖培养基（PDA）为分离及发酵培养基,并对分离出的内生真菌进行发酵培养,提取代谢产物进行抑菌活性分析。结果：从来源不同的三种厚朴中共分离出51株内生真菌;分别来自青霉属（Penicillium）,镰刀菌属（Fusarium）,交链孢属（Alternaria）,等20个属。其中青霉属有生长优势。对各菌株发酵液的提取物进行药理学检测,发现各发酵产物均呈现出不同的抗肿瘤及抑菌活性,而其中的13株有抑菌活性。结论：发酵产物中含有大量的抑菌物质。可以并有良好的抑菌效果。可以为下一步开发提供良好的微生物资源基础。     

海洋来源微生物的分离培养与抗肿瘤活性筛选

目的 从海洋环境样品中分离纯化微生物，经发酵培养与活性筛选，获取抗肿瘤活性菌株以供筛选药源活性产物，获无活性菌株以供核糖体工程转化研究。方法 通过单菌落挑选与划线培养分离纯化微生物菌株，经摇床发酵和提取操作制备活性测试样品。采用MTT法结合显微镜下细胞形态学检测的方法，测试样品的抗肿瘤活性。结果 从渤海湾驴驹河潮间带海泥样品中分离得到了微生物127株，其中真菌80株、放线菌47株。在127株中100 mg·L^-1样品浓度下对K562细胞的抑制率大于40%的活性菌株为8株，占菌株总数的6.3%(其中放线菌4株，占放线菌数的8.5%，真菌4株，占真菌数的5%)，抑制率在20%～40%的放线菌6株，占放线菌数的12.7%。结论 从渤海湾海泥样品中分离得到真菌80株、放线菌47株，从中获得抗肿瘤活性真菌4株、放线菌10株，从放线菌中获得抗肿瘤活性菌株的频率远远高于真菌。活性菌株为寻找药源活性产物提供了菌株，无活性菌株则为核糖体工程拓展药源菌株来源研究提供了资源。     

巴斯德毕赤酵母表达的人抑瘤素M发酵条件及发酵产物分析

目的：研究巴斯德毕赤酵母表达的人抑瘤素M（hOSM）大规模发酵条件。方法：利用hOSM毕赤酵母高表达菌株,于试管水平进行发酵pH条件的摸索,以补料分批培养方式在 80 L发酵罐中对hOSM工程菌进行3个批次的高密度发酵,控制和优化各种发酵条件,通过SDS-PAGE对发酵产物进行分析。结果：最终确定在pH 5.0的FM21培养基中扩增菌体,待菌体密度达190 g/L 时添加甲醇诱导,在发酵液pH 5.5的条件下,发酵温度稳定在28℃,通入空气的流量为2 vvm, 转速为650 r/min,罐内压力为10 P,溶解氧保持在25%左右,甲醇流加速度在9.3 mL/h/L 初始发酵液体积,诱导36 h时结束发酵,hOSM占分泌总蛋白的28%,产量达到280 mg?L-1。结论：应用hOSM工程菌能够进行稳定的发酵,为进行下一步生物学功能测定提供充足的物质基础。     

槲寄生内生真菌发酵液抗肿瘤作用机制研究

目的观察槲寄生内生真菌抗肿瘤活性菌株发酵液的抗肿瘤作用机制。方法利用实时细胞分析系统（RT-CES）对该菌株发酵液作用于细胞群落的整体生物学功能进行实时检测,构建发酵液作用效果的＂细胞指纹图谱＂,推断发酵液可能的抗肿瘤作用机制;透射电镜、DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术检测该菌株发酵液诱导的肿瘤细胞凋亡作用。结果槲寄生内生真菌发酵液具有诱导肿瘤细胞凋亡效应。结论发酵液的抗肿瘤作用机制可能通过抑制微管解聚使肿瘤细胞有丝分裂终止,促进肿瘤细胞凋亡,或通过诱导肿瘤细胞凋亡抑制其生长,从而导致细胞死亡。     

海洋盐单胞菌属微生物的鉴定及生物学活性分析

目的对36株海洋盐单胞菌进行16S rDNA的序列测定和生物学活性的初步分析。方法用PCR方法扩增36株细菌的16S rDNA序列,将获得的全部序列运用Clustal X1.8软件进行多序列比对并用MEGA4.1软件绘制进化树。利用MTT法测定菌株发酵液的细胞毒活性;采用DPPH和ABTS抗氧化模型检测菌株发酵液的抗氧化活性;采用人白细胞弹性蛋白酶(human leukocyte elastase,HLE)抑制剂筛选模型检测菌株发酵液对HLE的抑制率。结果经与GenBank数据库比对,36株菌均与盐单胞菌属有很高的相似性(96%～99%)。菌株发酵液有不同程度的细胞毒活性、抗氧化活性和HLE抑制活性。11株菌对HepG2细胞有抑制作用,抑制率为(4.40±1.2)%～(24.90±3.5)%;20株菌对HL-60细胞有抑制活性,抑制率为(1.70±1.1)%～(50.90±4.2)%。7株菌对ABTS自由基有清除能力,清除率为(4.49±2.1)%～(58.43±4.4)%;3株菌对DPPH自由基有清除能力,清除率为(5.68±3.7)%～(59.06±3.2)%;3株菌具有HLE抑制活性,抑制率为(12.71±1.81)%～(71.19±5.62)%。结论 36株海洋盐单胞菌属微生物表现出不同程度的细胞毒活性、抗氧化活性和HLE抑制活性,部分高活性菌株具有潜在的药用研究价值。     

苦参碱对SMMC-7721细胞周期及凋亡的影响

目的:研究苦参碱对肝癌细胞周期和凋亡的影响。方法:体外培养SMMC-7221细胞,采用MTT法观察不同浓度苦参碱对SMMC-7721细胞抑制情况,应用免疫组化法观察激活型Caspase-3蛋白表达,采用流式细胞术PI单染观察细胞周期。结果:苦参碱抑制SMMC-7221细胞增殖,抑制率呈浓度依赖关系,IC50为1.1 g/L,0.8 g/L和1.2 g/L苦参碱作用48 h,SMMC-7221细胞激活型Caspase-3表达增强,引起G1期阻滞。结论:苦参碱能够抑制肝癌增殖,诱导其凋亡。     

猫人参注射液体外抗肝癌实验研究

目的:观察单味猫人参注射液在体外对肝癌细胞的抑制作用.方法:噻唑蓝还原法(MTT法)检测猫人参注射液对体外培养的人肝癌细胞株SMMC-7721、小鼠肝癌细胞株H22、大鼠肝癌细胞株CBRH-7919的生长抑制作用.结果:体外实验结果表明:250mg/ml浓度猫人参注射液对H22、CBRH-7919、SMMC-7721肝癌细胞株均有抑制作用,抑制率分别63.68%、41.51%、32.92%,IC50分别为:107.70mg/ml、519.49mg/ml、667.56mg/ml;在24h,48h,72h三个时相,对小鼠H22肝癌细胞的生长抑制作用存在较明显的时效关系,在72h内16.88mg/ml～250mg/ml浓度内药物浓度与抑制作用有正相关趋势,其相关系数为0.91.结论:猫人参注射液对不同肝癌细胞株有一定的抑制作用.     

三氧化二砷对人肝癌细胞生长及其侵袭转移能力的影响

目的探讨三氧化二砷(As_2O_3)对人肝癌SMMC-7721细胞生长及其侵袭转移能力的影响。方法 MTT法检测不同浓度As_2O_3对人肝癌SMMC-7721细胞生长的影响,之后检测经As_2O_3作用前后对基底膜黏附能力的影响;Transwell膜侵袭系统观察As_2O_3作用前后SMMC-7721细胞游走与穿透基底膜能力的改变。结果 As_2O_3能显著抑制人肝癌SMMC-7721细胞的生长以及对Matrigel的黏附能力,相同浓度不同作用时间比较及相同作用时间不同浓度比较,差异均有统计学意义(P<0.01);As_2O_3能抑制细胞游走与穿透基底膜的作用,与对照组比较,游走穿膜细胞数及侵袭穿膜细胞数均减少(P<0.05)。结论 As_2O_3具有抑制人肝癌细胞生长增殖以及侵袭转移的能力。     

赶黄草木脂素及黄酮类成分抑制肝癌细胞增殖的作用

目的:研究赶黄草中木脂素类及黄酮类成分体外抑制肝癌细胞增殖的作用。方法:采用MTT法评价赶黄草中8个木脂素(1~8)和5个黄酮(9~13)体外抗人肝癌细胞SMMC-7721和Hep G2增殖的活性以及对正常肝细胞LO_2活力的影响。运用Image-i T DEAD Green/Hoechst 33342荧光双染和高内涵成像分析化合物1对SMMC-7721细胞的影响。结果:化合物1、6、8~11可抑制SMMC-7721的增殖,6、9、11、13可抑制Hep G2的增殖。除化合物11以外,以上化合物对正常肝细胞LO_2均无明显细胞毒作用,且化合物3、4、5、13还可促进LO_2增殖。结论:赶黄草中部分木脂素及黄酮类成分不仅具有抑制肝癌细胞增殖的作用,而且对正常肝细胞无毒作用,甚至可保护正常肝细胞,表现出较好的选择性。     

槲皮素对人肝癌SMMC-7721细胞生长的抑制及细胞凋亡的诱导作用

目的探讨槲皮素体外对人肝癌SMMC-7721细胞的生长抑制作用及诱导细胞凋亡的作用机制。方法以10、30、60、100#mol／L槲皮素作用于体外培养的SMMC-7721细胞,MTT法检测细胞生长抑制率,Annexi—V／PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡情况,免疫组化染色法检测bcl-2、bax蛋白表达的变化。结果30、60、100umol／L槲皮素可显著地抑制SMMC-7721细胞的生长（P〈0．01）,诱导细胞发生凋亡（P〈0．01）,并呈现量墩和时-效关系;槲皮素作用48h后,免疫组化染色法检测显示bcl-2蛋白表达降低和bax蛋白表达上调。结论槲皮素体外通过引起人肝癌SMMC-7721细胞bcl-2蛋白表达下调和bax蛋白表达上调诱导细胞发生凋亡,抑制细胞生长,槲皮素可能成为一种潜在的抗肝癌药物。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因旁观者效应的实验研究

目的 :研究单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因 (HSV -Ⅱtk)对人原发性肝细胞癌SMMC - 772 1的旁观者效应 .方法 :HSV -Ⅱtk基因通过阳离子脂质体Lipofectin介导 ,体外转染人原发性肝细胞癌SMMC -772 1,孵育 18h .取出细胞及上清液 ,对倍稀释 ( 2× ,4× ,8× ,16× ,3 2× )后分别加入另一 2 4孔板 .结果 :正常SMMC - 772 1细胞的浓度升高 ,亲本细胞的存活率随之降低 ,两者呈明显的负向相关关系 ;细胞组的OD值明显低于上清液组及空白对照组 (P <0 0 1) ;细胞组可见凋亡峰出现 ,而上清液组则无凋亡峰出现 .结论 :HSV -Ⅱtk基因对人原发性肝细胞癌SMMC - 772 1细胞具有旁观者效应 ,其作用机制可能与细胞紧密连接及细胞凋亡有关     

三氧化二砷对肝癌细胞增殖的影响

目的：研究三氧化二砷（As2O2）对肝癌SMMC-7721细胞的增殖抑制作用。方法：应用台盼蓝拒染法、MTT比色法及细胞克隆形成试验，研究As2O2对肝癌SMMC-7721细胞的增殖抑制和细胞毒作用。结果：AS：0，能显著抑制肝癌细胞的生长，5μmol／L As2O2抑制程度明显强于1μmol／L。1．5μmol／L和1μmol／L As2O2作用后细胞克隆形成率分别为（1．5±1．2）％和（12．3±2．2）％，明显低于对照组的（30．0±4．2）％，（P〈0．01）。As2O2对肝癌细胞有较强的细胞毒作用，且呈明显剂量和时间依赖性，其对肝癌细胞的杀伤率高于5-氟脲嘧啶（5-Fu）和丝裂霉素（MMC），但差异无统计学意义。As2O2与5-Fu及MMC存在协同效应，联合应用杀伤率明显升高。结论：As2O2具有明显的抑制肝癌细胞增殖作用，有必要进一步探讨其对肝癌的治疗价值。     

三氧化二砷与人参皂甙Rg3联合对人肝癌SMMC-7721细胞侵袭转移能力的影响

目的探讨三氧化二砷(As2O3)和人参皂甙Rg3(ginsenoside Rg3)联合运用对人肝癌SMMC-7721细胞黏附侵袭转移能力的影响以及与单独运用的差异。方法采用MTT法观察经As2O3、人参皂甙Rg3单独与联合作用后人肝癌SMMC-7721细胞对基底膜黏附能力的影响;Transwell膜侵袭系统观察As2O3与人参皂甙Rg3单独与联合作用后SMMC-7721细胞游走与穿透基底膜能力的影响。结果As2O3和人参皂甙Rg3单独与联合应用均能显著抑制人肝癌SMMC-7721细胞与Marigel的黏附,抑制细胞游走与穿透基底膜的能力(P<0.05),其联合抑制作用优于单独运用(P<0.05)。结论As2O3和人参皂甙Rg3均有抗肿瘤侵袭转移作用,两者联合可增强抑制效应。     

5-烯丙基-7-二氟亚甲氧白杨素抑制肝癌细胞NF-κB表达的研究

目的：研究5-烯丙基-7-二氟亚甲氧白杨素（ADFMChR）抑制体外培养人肝癌SMMC-7721细胞增殖和诱导凋亡作用及机制。方法：体外培养SMMC-7721细胞,MTT比色法测定ADFMChR对SMMC-7721细胞增殖活性的影响;Western Blotting法分析ADFMChR对SMMC-7721细胞NF-kB蛋白表达活性的影响。结果：MTT比色法结果显示ADFMChR有效抑制SMMC-7721细胞增殖活性,呈剂量依赖性,其IC50值为3.56μM;Western Blot分析证实ADFMChR下调NF-κB蛋白表达,呈浓度和时间依赖性。结论：ADFMChR具有抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖和诱导细胞凋亡作用,其机制与NF-κB蛋白表达有关。     

三氧化二砷抑制人肝癌细胞侵袭性的体外研究

目的：研究三氧化二砷（As2O3）对人肝癌SMMC-7721细胞侵袭能力的影响,为As2O3用于原发性肝癌的治疗提供实验依据。方法：以0.25、0.5、1.0、2.0、4.0μg/ml的As2O3与人肝癌细胞株SMMC-7721孵育24、48和72h后,应用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）观察As2O3对细胞生长的影响;应用Transwell小室进行人工重组基底膜侵袭和运动实验,观察As2O3对肝癌细胞侵袭能力的影响。结果：应用As2O3处理后人肝癌SMMC-7721细胞生长受到抑制,且有时间-浓度依赖性;同时肝癌细胞过膜细胞数减少,侵袭能力受到抑制。结论：As2O3在体外能有效抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖和侵袭能力,且有浓度依赖性。