人骨髓来源多能成体祖细胞与人肝细胞体外直接共培养向肝样细胞分化的实验研究

目的 探索人骨髓来源多能成体祖细胞(ZHJ-MAPCs)在与人肝细胞系L02在体外共培养条件下诱导分化为肝细胞的可行性.方法 直接共培养:将CFSE荧光(绿色)标记的ZHJ-MAPSs与L02(密度均为1×104/ml)按照各50%比例混合行直接共培养.5 d后用SABC-Cy3免疫荧光(红色)双标后在激光共聚焦显微镜下分别观察ZHJ-MAPCs表达ALB,AFP,CK-18的情况.并设阳性对照(单独培养的L02细胞)和阴性对照(单独培养未经诱导的ZHJ-MAPCs).结果 在共培养第5天检测ALB和CKl8时出现较多胞浆内呈黄色荧光的阳性细胞即向肝细胞分化的ZHJ-MAPCs,而在检测AFP时阳性细胞较少.结论 ZHJ-MAPCs与人肝细胞系L02行直接共培养能够诱导其向成熟肝样细胞定向分化.     

肝细胞生长因子诱导人骨髓来源的多能成体祖细胞向肝样细胞分化的可行性

目的探索人骨髓来源多能成体祖细胞(mulfipotent adult progenitor cells from human bone marrow，hMAPCs)在一定诱导条件下分化为肝细胞的可行性，为肝组织工程提供新的种子细胞来源。方法分组：A组1(hepatocyte growth factor，HGF)20ng／mL诱导；B组(阳性对照组)：L-02人肝细胞株；C组(阴性对照组)：未加任何诱导因素的MAPCs。免疫细胞化学鉴定不同诱导分化阶段细胞的白蛋白(albumin，ALB)、甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AVP)、细胞角蛋白18(cytokeratin 18，CK-18)、细胞角蛋白19(cytokeratin 19，CK-19)等肝细胞特征的表型变化并计数阳性细胞比率；Western blot检测诱导分化第21、35天后细胞的ALB的表达。结果免疫细胞化学结果：ALB、CK-18在不同时间段基本为阳性着色；CK-19在各组均为阴性着色，AFP作为早期不成熟肝细胞的一个标志，仅在诱导第7天为阳性着色；Western blot检测结果：在诱导分化第21、35天，ALB均有阳性表达。结论hMAPCs在一定诱导条件下具有向肝样细胞分化的潜能。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞（mMSCs）在体外定向诱导分化为肝细胞及其方法。方法：采用梯度离心法分离纯化雄性SD大鼠的mMSCs。A组原代培养；B组原代培养分别加刺激因子50ng／ml肝细胞生长因子（HGF）和50ng／ml成纤维细胞生长因子4（FGF-4），倒置显微镜连续观察细胞分化过程的形态学变化。于培养的7、14、21、28d，细胞免疫荧光法检测各组细胞甲胎蛋白（AFP）、白蛋白（ALB）、细胞角蛋白18（CK-18）、细胞角蛋白19（CK-19）的表达。采用过碘酸希夫（PAS）染色法检测各组细胞糖原染色情况。结果：分离纯化B组大鼠的mMSCs，应用HGF和FGF-4诱导10d后变为肝细胞样圆形。细胞免疫荧光测定B组显示，培养第7dAFP即出现阳性，第21d表达明显减弱；第7dCK-19染色阳性，以后增强；第14d白蛋白与CK-18染色开始阳性，以后表达逐渐加强。A组在培养过程中不表达AFP、ALB、CK-18和CK-19。糖原染色显示，B组第14d开始阳性，-直持续到第28d；A组未见阳性染色。结论：大鼠mMSCs在较高浓度的HGF及FGF-4诱导下可分化为肝细胞。     

体外诱导人骨髓间质干细胞分化为肝细胞样细胞

目的:探讨人骨髓间质干细胞(MSCs)在体外特定条件下是否可以转化为肝细胞样细胞.方法:分离培养人骨髓间质干细胞,采用肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)及CCl4损伤的小鼠肝脏共培养等诱导方式,在不同时间点分别用RT-PCR和荧光定量PCR检测肝细胞特异性基因的表达,免疫组织化学染色检测肝细胞标志. 结果: 在HGF和bFGF诱导第7天时甲胎蛋白(alpha fetal protein,AFP)、细胞角蛋白18(cytokeratin-18, CK18)和色氨酸2,3-双加氧酶(tryptophan 2,3-dioxygenase,TDO)基因表达阳性,CK18和TDO的表达随诱导时间延长增高;第7天诱导细胞组织化学染色AFP、白蛋白(ALB)、肝细胞核因子(hepatocyte nuclear factor,HNF)、肝细胞特异性抗原(HSA)和CK18表达阳性.与损伤小鼠肝组织共培养21 d后细胞表达AFP和TDO.结论:HGF和bFGF联合诱导以及与CCl4损伤肝组织共培养的方法可体外促进人MSCs分化为肝细胞样细胞,可为肝脏疾病或肝损伤的干细胞治疗提供细胞来源.     

人骨髓间充质干细胞体外分化为肝样细胞的实验研究

目的 探索肝细胞生长因子（HGF）联合成纤维细胞生长因子-4（FGF-4）诱导人骨髓间充质干细胞（HMSCs）向肝细胞方向分化的能力,为生物人工肝及肝细胞移植等找到新的种子细胞来源。方法 分别用HGF、FGF-4、HGF＋FGF-4诱导HMSCs分化为肝样细胞：以未加诱导因素的HMSCs、L-02人肝细胞株为阴、阳性对照组。相差显微镜观察细胞形态的变化：在不同诱导分化阶段免疫细胞化学染色检测AFP和CK18,并用图像分析法计算HMSCs的分化比率;免疫荧光细胞化学染色法检测AFP、ALB的表达;RT-PCR检测AFP和ALB mRNA表达的情况。结果 HMSCs经诱导向肝样细胞转化,变成纺锤形、不规则圆形或多角形细胞。免疫细胞化学染色各诱导组均可检测出AFP和CK18表达,图像分析表明HGF＋FGF-4联合诱导分化的AFP、CK18阳性率最高,HGF次之,FGF-4则较弱;免疫荧光细胞化学染色发现各诱导组AFP、ALB均为阳性表达,而阴性对照组则为阴性表达;各诱导组RT-PCR均可检测出AFP和ALB mRNA的表达,而阴性对照组则没有表达。结论 HGF、FGF-4、HGF＋FGF-4均能诱导HMSCs分化为肝样细胞,分化的肝样细胞能分泌肝细胞特异性产物AFP、ALB、CK18等。以HGF＋FGF-4诱导HMSCs分化为肝样细胞的阳性率最高,HGF次之,FGF-4则较弱。     

VIP对人脐血CD34+细胞向肝系分化的影响初探

目的探讨血管活性肠肽(VIP)对人脐血造血干细胞(HSC)向肝系分化的影响.方法采用免疫磁分选技术纯化人脐血CD34+细胞,流式细胞术鉴定纯度;VIP和混合因子(包括VIP、EGF、HGF)作用CD34+细胞后,酶联免疫化学法测定CD34+细胞及上清AFP水平,免疫细胞化学法检测CD34+细胞上肝系标志AFP、白蛋白(ALB)、细胞角质素19(CK-19)的表达,Western blot方法检测CD34+细胞上ALB表达;巢式RT-PCR方法检测CD34+细胞上AFP、ALB的mRNA表达,随机选送ALB产物测序.结果免疫组化结果显示CD34+细胞上不表达CK-19蛋白,但有AFP和ALB蛋白表达;VIP作用CD34+细胞14 d后, 细胞内的AFP质量浓度(165.00±8.51 pg/mL)较对照组(270.00±11.37 pg/mL)显著下降(P<0.05).Western blot显示VIP作用后CD34+细胞内ALB蛋白表达有减弱趋势.人脐血CD34+细胞表达了AFP mRNA和ALB mRNA,随机选取ALB产物测序与GeneBank中ALB基因序列完全相同.结论人脐血CD34+细胞表达肝系标志AFP、ALB,虽未见CK-19表达,但仍提示造血干细胞有向肝细胞横向分化的可能.VIP降低了人脐血CD34+细胞AFP及ALB表达.这种对造血干细胞内胚层细胞标志物表达的抑制,提示VIP对HSC向肝细胞横向分化具有抑制作用.     

外源性和内源性结缔组织生长因子对大鼠肝脏前体细胞分化的影响

目的肝脏前体细胞(WB-F344)在不同的刺激下可以分化成肝细胞或胆管细胞。本研究旨在比较外源性和内源性结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)对WB-F344细胞分化的影响。方法重组人CTGF直接刺激WB-F344细胞,MTT法观察CTGF对WB-F344细胞活性的影响;用Western blotting方法检测CTGF对WB-F344细胞分化的影响:包括肝系标志物甲胎蛋白(α-feto protein,AFP)、白蛋白和胆系标志物细胞角蛋白-19(CK-19)蛋白水平的变化。构建含CTGF全长编码基因的质粒(dl6-96-CTGF)转染WB-F344细胞,用G418筛选稳定表达CTGF的WB-F344细胞株,Western blotting方法同样检测上述标志物蛋白水平的变化。结果重组人CTGF作用于WB-F344细胞24h后,可以轻度抑制细胞活性,但剂量关系不明显。高剂量CTGF作用于WB-F344细胞24h后,可以明显改变WB-F344细胞表面标志物的表达:幼稚肝细胞标志物AFP的表达减少,而成熟肝细胞标志物白蛋白和胆管细胞标志物CK-19的表达均增加。成功构建CTGF全长编码基因的质粒,并用G418获得稳定转染CTGF全长质粒的WB-F344细胞株。稳定转染dl6-95-CTGF的WB-F344细胞,与转染dl6-95相比,AFP和CK-19表达均减少,白蛋白表达增加,但诱导程度没有外源性明显。结论与内源性结缔组织生长因子相比,外源性结缔组织生长因子可以明显改变肝脏前体细胞表面标志物的表达,具有诱导肝脏前体细胞向成熟肝脏细胞分化的潜能。     

体外诱导人脐血单个核细胞向肝细胞样细胞的分化

目的:探讨人脐血单个核细胞（MNC）能否在体外诱导分化为肝细胞样细胞。方法:采集正常产妇脐血,淋巴细胞分离液分离MNC,流式细胞仪检测其表面标志。分别用肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子-4(FGF4)、HGF+FGF4、无生长因子4种处理因素 进行诱导培养,于诱导前及诱导后的第7、14、21、28天采用RT-PCR检测AFP、白蛋白及C-met、FGFR₂ mRNA的表达,免疫细胞化学法检测肝细胞抗原和CK18的表达,PAS 法进行糖原染色。结果:诱导前检测到C-met、FGFR₂ mRNA的表达,诱导后第7和21天分别检测出AFP和白蛋白mRNA的表达,第28天检测出CK18、肝细胞抗原的表达及糖原染色阳性细胞,无生长因子诱导组未检测到肝系细胞标志。HGF+FGF4诱导组肝系细胞标志阳性率均高 于单独生长因子诱导组(P<0.05)。结论：HGF、FGF4均能在体外诱导人脐血MNC分化为肝细胞样细胞,且二者在一定程度上有联合作用。     

模拟子宫微环境诱导大鼠胎盘间充质干细胞向子宫内膜上皮细胞方向分化的实验研究

目的 模拟子宫微环境诱导大鼠胎盘间充质干细胞（PMSCs）向子宫内膜上皮细胞方向分化。方法 原代培养大鼠PMSCs及传代,绘制细胞生长曲线,制备子宫内膜条件培养液,用子宫内膜条件培养液和雌激素（β-雌二醇）进行体外诱导分化PMSCs;免疫荧光化学法检测细胞波形蛋白和角蛋白的表达;实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测上皮细胞标记细胞角蛋白7（CK-7）、细胞角蛋白18（CK-18）、细胞角蛋白19（CK-19）、上皮膜抗原（EMA）的基因表达;Western blotting检测波形蛋白和角蛋白表达量。结果 实验组CK-7、CK-18、CK-19、EMA mRNA相对表达量高于对照组（P <0.05）;实验组波形蛋白相对表达量低于对照组（P <0.05）;实验组角蛋白相对表达量高于对照组（P <0.05）。结论 使用子宫内膜诱导培养液和雌激素能够促进大鼠PMSCs向子宫内膜上皮细胞方向分化,其作用显著,体外模拟子宫微环境在PMSCs向子宫内膜上皮细胞方向分化中有着重要的作用。     

大鼠骨髓细胞CD34+β2m-CD90+亚群体外培养诱导分化

目的在体外用HGF EGF诱导骨髓CD34 β2m-CD90 细胞向成熟肝细胞转化.方法四氯化碳皮下注射建立大鼠肝纤维化模型,磁式细胞分离法取骨髓CD34 β2m-CD90 细胞,流式细胞仪检测;DMEM培养细胞,HGF EGF诱导分化;免疫荧光显微镜、免疫细胞化学和RT-PCR检测AFP、白蛋白和CK-18的表达;ELISA法检测培养上清白蛋白浓度,PAS染色法检测糖原的合成.结果实验组CD34 ,β2m-,CD90 亚群数量均较正常对照组显著增加(P＜0.05);诱导分化培养后,细胞的形态与正常肝细胞类似;培养的细胞白蛋白和CK-18的表达随培养时间(第1～21天)的延长而增加,AFP的表达逐渐下降(P＜0.05);上清白蛋白浓度,糖原的合成增加(P＜0.05).结论大鼠肝纤维化可能促进骨髓CD34 β2m-CD90 细胞的增殖;CD34 β 2m-CD90 细胞经HGF EGF SCF诱导分化培养后,在形态和功能上有逐渐向成熟肝细胞转化的趋势.     

Galectin-3诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞

目的探索应用Galectin-3诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的效果,筛选出所涉及的信号通路,并验证Hippo 信号通路。方法对大鼠股骨骨髓间充质干细胞进行提取、分离、传代培养及鉴定。取第3代细胞进行诱导培养,分为SD大鼠 BMSCs（A组）、SD大鼠BMSCs+0.5 μg/mL Gal-3（B组）、SD大鼠BMSCs+20 ng/mL HGF（C组）、SD大鼠BMSCs+0.5 μg/mL Gal-3+20 ng/mL HGF（D组）和大鼠肝细胞（E组）。分别在诱导后7、14、21、28 d进行细胞形态学观察、糖原染色观察,并行实时 定量PCR 以及Western blot 检测,鉴定其分化情况。取B组细胞行基因芯片检测。将BMSCs 与Gal-3、Gal-3+XMU-MP-1 （Hippo信号通路抑制剂）分组进行诱导,Western Blot检测YAP、P-YAP、ALB、AFP、CK-18。结果大鼠股骨骨髓分离出的细胞 符合骨髓间充质干细胞特性。诱导后,B、C、D组BMSCs形态逐渐向肝样细胞转化,D组28 d时细胞形态与肝细胞相对比相似 度最高。糖原染色28 d 时A组无染色,B、C、D组染色较前增多,B、C组间无明显差异（P>0.05）,D组染色率最高（P<0.05）。 Q-PCR检测AFP、ALB、CK-18表达逐渐升高,28 d时B组与C组各指标较接近（P<0.05）。Gal-3与HGF对AFP、ALB的mRNA 表达不存在交互效应（AFP：F=0.236, P=0.640;ALB：F=50.639, P=0.000）,对CK-18 的mRNA表达有协同效应（F=50.639, P= 0.000）。Western blot检测A组几乎不表达AFP、ALB及CK18,B、C、D组AFP、ALB及CK18蛋白表达随时间延长,逐渐增加。 基因芯片检测发现上调基因27个,下调基因62个。涉及TGF-β、PI3K-Akt及Hippo等信号通路。Gal-3及Gal-3+XMU-MP-1诱 导组的YAP表达较空白对照组增加,Gal-3+XMU-MP-1较单独应用Gal-3诱导BMSCs分化的效率高。结论Galectin-3能够单 独诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化,而且联合HGF诱导BMSCs分化的效率更高。诱导过程与TGF-β、PI3K-Akt 及 Hippo等信号通路相关。抑制Hippo信号通路可提高诱导效率。     

胚胎干细胞向肝细胞定向诱导分化的体外实验研究

目的 探讨胚胎干细胞体外定向诱导分化为肝细胞的条件和机制。方法 选用Balb／c小鼠胚胎干细胞,经过拟胚体发育分化5d后开始定向诱导培养,将拟胚体转入白明胶处理的培养板中贴壁生长,在不同时间段分别在细胞培养基中添加酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、肝细胞生长因子(HGF)等细胞生长因子进行肝细胞定向诱导。细胞分化过程的形态学变化用倒置显微镜追踪观察;用放免法对细胞培养上清中抗小鼠甲胎蛋白(AFP)和抗小鼠白蛋白(ALB)进行动态检测,用免疫细胞化学法检测肝细胞分化标记物AFP,ALB,CK8,CK18,并计算其阳性表达率(肝细胞分化率)。结果 胚胎干细胞在重组小鼠白血病抑制因子(LIF)存在的情况下保持未分化生长状态,撤去LIF后很快发育为拟胚体并继续分化。在第8天检测到上清中AFP出现,浓度为3．4n/ml,ALB在第11天开始检测到,浓度为0．2μg／ml,随培养时间延长,AFP和ALB浓度逐渐增加。第8天分化细胞开始出现AFP阳性,第10天出现CK8、CK18阳性,第11天出现ALB阳性,阳性细胞结构符合正常肝细胞结构特点。计算分化细胞中ALB阳性细胞率,得到肝细胞的分化率为30％。结论 胚胎干细胞经过拟胚体发育阶段,在特定培养条件和aFGF、HGF、等生长因子的作用下,可定向分化为肝细胞,这种细胞分化系统有望成为肝细胞替代疗法中的新型肝细胞来源。     

人甘油激酶慢病毒干涉载体的构建和表达

目的构建人甘油激酶(GK)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,获得稳定下调GK表达的慢病毒。方法将具有干涉效果的siRNA序列克隆入慢病毒核心质粒pSicoR中,并转染293T细胞进行病毒包装,用慢病毒感染293T细胞并应用FACS测定病毒滴度。以GK干涉慢病毒感染人肝细胞系L02细胞后,应用Western blotting方法检测GK的表达。结果成功构建GK干涉慢病毒pSicoR-GK载体并获得慢病毒颗粒,病毒滴度检测可达3×107pfu/ml,GK蛋白质表达水平下调至对照的约20%。结论成功构建人GK基因RNAi慢病毒,为后续GK生物学功能研究奠定基础。     

Hepatic differentiation from embryonic stem cells in vitro

Objective To investigate an method for hepatic differentiation from embryonic stem cells (ES cells) in vitro and the resulting differentiation ratio, in order to develop a procedure for producing a new type of hepatocyte for hepatocyte replacement therapy in the treament of liver failure.Methods ES cells from Balb/C mice were cultured and maintained in an undifferentiated state in gelatin-coated dishes using Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) containing 1000 U/ml leukemia inhibitory factor (LIF). Then, LIF was withdrawn from the DMEM to allow the ES cells to develop into embryonic bodies (EBs). EBs were plated onto tissue culture dishes, and growth factors such as acidicfibroblast growth factor (aFGF) and hepatocyte growth factor (HGF) were added to the medium to promote directional differentiation. The course of development and differentiation was observed dynamically using an inversion microscope. The expression of hepatic proteins, such as α-fetoprotein (AFP), albumin (ALB), cytokeratin 8 (CK8), cytokeratin 18 (CK18), in cytoplasm was analyzed by immunocytochemistry (ICC). The concentration of ALB in the medium was determined dynamically by radioimmunoassay (RIA). Results ES cells replicated as clones, without differentiating, in DMEM containing LIF. They developed into EBs in medium without LIF. Our ICC assay showed that differentiating cells did not express hepatic proteins, such as AFP, ALB, CK8, and CK18 until day 7, day 9, day 11, and day 11, respectively (up to 2 days later when growth factors are not present). The concentration of AFP in the medium was first detected on day 8, at a concentration of 3.4 ng/ml, and increased to 22.8 ng/ml by day 15. The concentration of ALB in the medium was 0.2 μg/ml on day 11, and increased to 2.2 μg/ml by day 15. ALB-positive cells under ICC manifest morphological structures were consistent with normal mouse hepatocytes. The differentiation ratio of hepatocytes in the ES cell differentiation system was 30％ on day 15 (significantly lower without the presence of growth factors).Conclusions ES cells can differentiate into mature hepatocytes. Growth factors, such as aFGF and HGF, can enhance this differentiation and produce sufficient numbers of functional hepatocytes. This method may be a reliable new way of differentiating ES cells into hepatocytes for use in replacement therapy in the treament of liver failure.