Neuritin基因在肺癌及正常肺组织中表达的检测

目的:了解neuritin基因在肺癌组织中的表达情况,探讨neuritin基因表达与肺癌发生发展的相关性.方法:收集肺癌、正常肺石蜡及新鲜组织标本,利用免疫组化检测组织中neuritin的表达情况.利用RT-PCR方法检测新鲜肺癌及正常肺组织中neuritin mRNA表达.结果:肺癌组织中neuritin的表达高于正常肺组织,差异有统计学意义(p＜0.05).结论:neuritin在肺癌组织和正常肺组织表达存在显著差异,提示neuritin表达可能与该肿瘤的发生发展相关.     

siRNA表达载体对293T细胞neuritin表达的抑制作用

目的 观察siRNA表达载体对293T细胞神经生长因子neuritin的抑制作用,为进一步研究neuritin基因的功能及作用机制奠定基础.方法 通过RT-PCR技术筛选neuritin高表达细胞株;利用分子克隆技术,采用两步法构建 PBS/U6-neuritin siRNA(1～3)表达载体,脂质体法转染293T细胞,稳定转染后采用Western-blot技术进行干扰效率的筛选鉴定.结果 293T细胞与L-02细胞的RT-PCR产物为500 bp左右可见特异性条带,选择293T细胞作为实验细胞株,测序结果显示经2次构建后PBS/U6-neuritin siRNA表达载体在338 bp处出现发夹结构,说明构建成功.转染72 h后Western-blot技术检测PBS/U6-neuritin siRNA-(1～3)在不同程度上均可使293T细胞内源性Neuritin蛋白表达下调.结论 PBS/U6-neuritin siRNA(1～3)表达可以有效抑制293T细胞系Neuritin蛋白的表达.     

肿瘤相关抗原GCF2高水平表达的肝癌细胞株的筛选

目的 筛选出肿瘤相关抗原GCF2高表达的人肝癌细胞株,为进一步探讨GCF2对肝癌发生发展的可能作用奠定基础.方法 选择4种人肝癌细胞株(BEL-7404、HepG2、SMMC-7721和QGY-7703)及1种成人正常肝细胞株(HL-7702),培养后分别制作细胞爬片及提取蛋白后,采用免疫细胞染色技术和Western blot的方法筛选出GCF2表达量高的细胞株.结果 免疫细胞染色显示,GCF2在5种细胞中的胞核及胞质中均有表达.GCF2蛋白在肝癌细胞BEL-7404、HepG2、SMMC-7721和QGY-7703的表达要强于正常肝细胞HL-7702,其中以BEL-7404的表达量最高.通过Western blot检测,BEL-7404的GCF2相对表达量为0.875±0.134,较其他细胞株高,差异有统计学意义(P<0.05).结论 BEL-7404细胞中GCF2蛋白水平的相对表达量最高,可以作为下一步探讨GCF2在肝癌发生发展的可能作用的实验材料.     

人肝素酶基因正反义荧光真核表达载体的构建及肺癌细胞转染

目的: 构建正义和反义人肝素酶与绿色荧光蛋白真核共表达载体,并分别转染人低转移肺癌细胞株95C及高转移细胞株95D. 方法: 采用基因重组技术,用EcoRⅠ从pcDNA3-Hpa质粒上切下约1.7 kb的人肝素酶全长cDNA片段,然后连入 pIRES2-EGFP质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并用脂质体法将肝素酶正义真核表达载体转入人低转移肺癌细胞株95C、反义真核表达载体转入人高转移肺癌细胞株95D,G418筛选后,荧光倒置显微镜检测转染结果. 结果: 经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成5.3 1.7 kb两条DNA片段,而反义重组质粒为6.5和0.5 kb两条DNA片段,与理论计算值完全一致;转染后肺癌细胞倒置荧光显微下呈绿色荧光. 结论: 成功构建了人肝素酶的正、反义真核表达载体,并成功转染人低、高转移肺癌细胞株,为进一步研究正、反义肝素酶基因转染对肿瘤细胞的影响奠定了基础.     

B16M高低转移株的筛选及其生物学异质性的分析

目的 筛选B16M高低转移株,以探讨B16M的转移异质性及机制.方法 通过B16M自发肺转移模型筛选出转移性能不同的细胞株,并用实验性和自发性肿瘤转移模型验证其在体内生长、转移性. 通过细胞增殖、3H-TdR参入实验、流式细胞技术、细胞侵袭离散实验研究了高、低转移B16M细胞株体外增殖能力、侵袭能力以及对离散因子的反应的差异,Western印迹实验研究细胞c-met表达及活化水平. 结果在所筛选出的3株可疑高转移B16M细胞株中,H3 B16M细胞接种于同系C57BL/6小鼠体内所形成的原发瘤重量、实验和自发性肺转移结节数明显高于其他细胞株;该细胞株增殖能力、侵袭性及对离散因子的反应能力的也明显高于其他细胞株.c-met表达及磷酸化水平也升高.结论成功的筛选出B16M 高、低转移细胞株,两者在细胞增殖、侵袭能力、离散能力等方面有差别.这种差异可能与c-met有关.     

转染外源SEMA3B对非小细胞肺癌细胞生物学行为的影响

目的:构建pcDNA-SEMA3B真核表达载体,研究其对非小细胞肺癌细胞株NCI-H1299细胞生物学行为的影响.方法:利用限制性内切酶酶切和基因重组技术构建重组pcDNA-SEMA3B质粒;导入非小细胞肺癌NCI-H1299细胞、筛选稳定细胞株,Western Blot检测蛋白表达,克隆形成描绘细胞增殖的影响.结果:筛选的稳定表达细胞内SEMA3B蛋白的表达水平增高;SEMA3B高表达的NCI-H1299细胞克隆形成显著减少(p＜0.01).结论:转染外源SEMA3B在NCI-H1299细胞中表达并抑制非小细胞肺癌细胞生长,为深入研究其功能提供了条件.     

人高转移性和低转移性前列腺癌细胞株荧光差异凝胶电泳图像分析

目的:比较人高转移性前列腺癌细胞株(PC-3M) 和人低转移性前列腺癌细胞株(PC-3) 间差异表达的蛋白质,拟发现早期诊断和逆转前列腺癌转移的分子标志物。方法: 应用差异凝胶电泳(DIGE),分离PC-3M和PC-3 细胞株的总蛋白,用图像分析软件比较分析并识别细胞间的差异表达蛋白质。结果: 应用DIGE进行分离后,成功地获得了蛋白质组分辨率高、重复性好的双向凝胶电泳图谱,用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）成功鉴定出11种蛋白质,其中9个蛋白质点仅在PC-3中有表达,2个蛋白质点仅在PC-3M中有表达。结论: 人高、低转移前列腺癌细胞株的蛋白质组表达存在明显差异,这些差异蛋白质有可能为进一步发现前列腺癌转移相关分子和阐明前列腺癌侵袭转移的分子机制提供实验证据。     

四环素调控系统在肿瘤细胞株中的建立和鉴定

目的 建立受四环素及其衍生物强力霉素(doxycycline,DOX) 诱导调控的高表达外源目的 基因的人胰腺癌细胞株.方法 构建高效表达转录激活因子(tTA) 的真核表达载体,利用脂质体转染法导入人胰腺癌细胞株PANC-1,经嘌呤霉素筛选后挑取单克隆扩大培养,利用荧光素酶报告基因系统筛选受强力霉素诱导调控的高表达外源目的 基因的PANC-1 细胞株(Tetoff细胞株),并利用RT-PCR 和免疫荧光细胞化学法检测tTA 在Tet-off 细胞株中的表达.结果 荧光素酶报告基因技术、RTPCR和免疫荧光化学染色法检测均表明成功构建了三株受强力霉素高度调控的高表达低背景的PANC-1 细胞株.结论 成功获得含四环素调控系统的Tet-off 人胰腺癌细胞株,其调控活性好、背景低,为研究外源基因功能提供了一条有效途径.     

索拉菲尼诱导的肝癌耐药细胞株的建立及基因表达分析

目的 建立索拉菲尼诱导的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)耐药细胞株,筛选出耐药细胞株中的高表达基因,进一步探讨肝细胞癌中与索拉菲尼耐药的相关基因.方法: 选取人肝癌细胞株PLC及Huh7,采用药物间歇诱导法分别建立索拉菲尼诱导的耐药细胞株,运用高通量测序技术(RNA-Seq)测定两株耐药细胞株中高表达基因,运用生物信息学数据库分析高表达基因与肝癌临床生物学指标相关性,筛选出肝癌耐药机制中可能参与的基因.结果: 通过基因测序得到两株肝癌耐药细胞株中的高表达基因,在设定的限定条件下进行进一步筛选, 限定条件为两株耐药细胞中共同表达的基因且表达差异倍数大于4倍,差异具有统计学意义(P<0.05),发现两株耐药细胞共同表达前12位基因符合限定条件,进一步运用Ualcan数据库分析12个基因与肝癌组织表达水平,分期,分级及生存的关系,筛选出符合条件的基因CBX4.结论: 成功构建了索拉菲尼诱导的肝癌耐药细胞株,并筛选出与索拉菲尼耐药相关基因CBX4,为进一步耐药机制探讨提供依据.     

索拉菲尼诱导的肝癌耐药细胞株的建立及基因表达分析

目的 建立索拉菲尼诱导的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)耐药细胞株,筛选出耐药细胞株中的高表达基因,进一步探讨肝细胞癌中与索拉菲尼耐药的相关基因.方法: 选取人肝癌细胞株PLC及Huh7,采用药物间歇诱导法分别建立索拉菲尼诱导的耐药细胞株,运用高通量测序技术(RNA-Seq)测定两株耐药细胞株中高表达基因,运用生物信息学数据库分析高表达基因与肝癌临床生物学指标相关性,筛选出肝癌耐药机制中可能参与的基因.结果: 通过基因测序得到两株肝癌耐药细胞株中的高表达基因,在设定的限定条件下进行进一步筛选, 限定条件为两株耐药细胞中共同表达的基因且表达差异倍数大于4倍,差异具有统计学意义(P<0.05),发现两株耐药细胞共同表达前12位基因符合限定条件,进一步运用Ualcan数据库分析12个基因与肝癌组织表达水平,分期,分级及生存的关系,筛选出符合条件的基因CBX4.结论: 成功构建了索拉菲尼诱导的肝癌耐药细胞株,并筛选出与索拉菲尼耐药相关基因CBX4,为进一步耐药机制探讨提供依据.     

早期干预对宫内感染脑损伤仔鼠脑组织neuritin表达的影响

目的:本研究旨在探讨早期干预及康复训练对宫内感染致脑损伤仔鼠脑组织神经突起生长因子neuritin表达的影响。方法:30只Wistar大鼠在受孕后第17天和18天连续2天腹腔注射脂多糖(LPS)420ug/kg.d作为模型组,10只受孕大鼠在相同日龄注射等量无菌生理盐水作为对照组,随机选取模型组仔鼠100只,分为干预组(T)50只,非干预组(NT)50只;随机选取对照组仔鼠50只为NS组。干预组进行早期干预(触摸和丰富环境)和康复训练,非干预组和NS组不给任何干预。在仔鼠出生后24小时内随机选取模型组和对照组各5只行胎盘HE染色,观察胎盘病理变化情况,3组分别在1天、7天、14天、21天、28天随机选取10只取仔鼠脑组织行HE染色观察脑组织病理变化和免疫组化染色观察脑组织neuritin的表达情况。分别于14天、21天、28天行改良BBB评定和悬吊实验测定评分。结果:LPS组较NS组悬吊实验和改良BBB得分及neuritin表达均显著降低(p<0.05),其中T组显著高于NT组(p<0.05)。结论:早期干预后可提高脑neuritin的表达并能改善其运动功能。     

构建人类neuritin真核表达系统

目的：构建人类neuritin基因真核表达载体，并观察其转染的PC12细胞中neuritin的表达。方法：用基因重组技术，将人类Neuritin cDNA的开放阅读框克隆到真核表达载体pcDN A4．0中，经酶切鉴定及测序分析、并以脂质体介导转染PC12细胞，了解其在细胞内的表达。结果：酶切鉴定及测序分析，表明重组pcDNA4．0-neuritin表达质粒克隆成功．neuritin基因在PC12细胞中获得表达。结论：以脂质体介导pcDNA4．0-neuritin质粒转染真核细胞，为基因治疗神经系统退行性病变奠定实验基础。     

人增殖抑制基因(HSG)对肿瘤细胞系化疗敏感性的作用

目的:将人增殖抑制基因(hHSG)用电子穿孔的转基因方式转染到体外培养的人肿瘤细胞系中,观察hHSG 基因对内源性hHSG表达水平不同的肿瘤细胞系的化疗敏感性的影响.方法:首先用免疫组化方法检测不同组织来源的肿瘤细胞系中hHSG的表达水平,然后选择内源性hHSG表达水平较低的肺腺癌(A549)和内源性hHSG表达水平较高的宫颈癌(HeLa S3)细胞系,用电穿孔方法转染含有hHSG的真核表达载体(pEGFP-hHSG)24 h后,加入放线菌酮(CHX),采用细胞计数、MTT法观察hHSG对肿瘤细胞增殖抑制作用及对CHX的化疗敏感性的影响.结果:hHSG在不同组织来源的肿瘤细胞系都有不同程度的表达, pEGFP-hHSG转染到两种内源性hHSG表达水平不同的肿瘤细胞系后,这两种肿瘤细胞的生长增殖都明显受到抑制,同时外源性的hHSG也增强了这些肿瘤细胞系对CHX的敏感性.结论:外源性hHSG可不依赖其内源性表达水平而抑制肿瘤细胞的增殖,与CHX并用可增强肿瘤细胞对CHX的敏感性,具有协同作用.     

应用抑制性消减杂交技术分析涎腺腺样囊性癌转移相关基因

目的：克隆涎腺腺样囊性癌转移相关的基因。方法：应用mRNA抑制性消减杂交技术，研究涎腺腺样囊性癌高、低转移细胞系基因表达上的差异。结果：以高转移细胞ACC-M为测试子，低转移细胞ACC-2为驱赶子，获得高表达的基因序列有7个，均为已知序列同源基因。其中XAGE-1b基因为肿瘤睾丸抗原家族中的一个重要基因。结论：与ACC-2相比ACC-M中部分基因的高表达与涎腺腺样囊性癌高转移特性的获得有关，此结果为进一步探索腺样囊性癌肿瘤转移分子机理以及肿瘤转移控制和基因治疗提供了重要的依据。     

高低转移人大肠癌细胞系基因表达谱差异

目的 用自制肿瘤转移相关基因cDNA微阵列研究人大肠癌高转移细胞系Lovo、SW620及低转移细胞系SW480、LS174T的基因表达谱差异，筛选与大肠癌转移相关的特异基因。方法 分别提取4种大肠癌细胞系及对照的正常大肠上皮组织的mRNA，逆转录成cDNA探针，经cy3和cy5标记后分别与含有399个肿瘤转移相关基因的微阵列杂交．用专用软件分析杂交信号强度。结果 高转移细胞系与低转移细胞系的基因表达谱有显著差异，其中有104个基因的表达值有意义，包括上调基因44个、下调基因60个。结论 大肠癌转移是由其发生过程中多个基因表达的复杂变化决定的，高转移细胞系与低转移细胞系比较存在差异的基因可能与高转移特性有关。     

Neuritin 与HSP60 在大鼠肝损伤组织中的表达及其意义

目的 研究大鼠肝损伤后不同时间Neuritin 和热休克蛋白60（HSP60）的表达,探讨Neuritin 和HSP60 在大鼠肝损伤修复过程中的作用。方法 将126 只SD 大鼠随机分为肝损伤组、骨折组和正常组,分别检测各组术后6 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d 和14 d 7 个时间点的血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）浓度,并取肝组织行苏木精- 伊红和免疫组织化学法染色,观察肝脏病理学改变及Neuritin、HSP60的表达。结果 肝损伤组大鼠血清ALT、AST 浓度在6 h、12 h、1 d 时高于骨折组、正常组（P <0.05）。免疫组织化学法结果表明,肝损伤组大鼠Neuritin 和HSP60 的表达水平在各个时间点（6 h 除外）高于骨折组、正常组（P <0.05）,且两者的表达水平均呈先升高后降低的趋势,骨折组大鼠HSP60 的表达水平在12 h、1 d 时高于正常组（P <0.05）,骨折组大鼠Neuritin 的表达水平与正常组比较,差异无统计学意义（P >0.05）。结论 Neuritin 与HSP60 相互作用,可能是促进肝损伤修复的重要因素。     

Differential p53 protein expression level in human cancer-derived cell lines after estradiol treatment

BACKGROUND: p53 has a remarkable number of biological activities, including a central role in cell cycle checkpoints, apoptosis, senescence, and maintenance of genomic integrity. Its expression is modified by estradiol in some epithelial cancer-derived cell lines from the reproductive tract. The aim of this study was to evaluate the effect of low and high doses of estradiol in p53 gene expression in epithelial cancer-derived cell lines from the reproductive tract. METHODS: p53 gene expression was assessed by Northern and Western blot methods in three human epithelial cancer-derived cell lines after estradiol treatment. RESULTS: These indicated that no changes in p53 mRNA content occurred after estradiol treatment at both low (10 nM) and high (1 micro M) doses of estradiol in HeLa, CaLo, and C-33 cell lines. p53 protein content was nearly constant in HeLa and C-33 cell lines at administration of 10 nM of estradiol. However, when estradiol was administered at a higher dose (1 micro M), an increase in p53 protein was observed over time in HeLa and CaLo cell lines. In contrast, estradiol was without variations in C-33. CONCLUSIONS: Overall results indicate that estradiol induces variations of p53 protein levels in epithelial cancer-derived cell lines from the reproductive tract in vitro and that this effect may be related with status p53 and/or presence of E6/E7 from human papillomavirus.     

Establishment of Stable High Expression Cell Line with Green Fluorescent Protein and Resistance Genes

Mammalian expression systems have an undis-puted long-standing and very successful history forthe generation of recombinant proteins.While re-combinant proteins expressed in the cytoplasm ofbacteria are ofteninsoluble,inactive,soluble,andbioactive proteins can frequently be obtained fromeukaryotic cells.Furthermore,eukaryotic cellshave the capacity to carry out posttranslationalmodification,such as glycosylation,phosphoryla-tion ontyrosine,serine,andthreonine residues,orthe addition of fatty a…