载脂蛋白E基因多态性影响星形胶质细胞损伤后早期NF-κB表达的实验研究

目的探讨载脂蛋白E(apolipoprotein E,APOE)基因多态性与星形胶质细胞损伤后NF-κB表达的相关性。方法通过RT-PCR及定点突变技术扩增人源性APOEε2、ε3、ε4 3种等位基因的CDS区,并构建pEGFP-N1-APOE重组质粒;APOE基因敲除鼠星形胶质细胞的原代培养、鉴定,脂质体法将重组质粒转染入星形胶质细胞,并筛选稳定表达APOE信息的细胞株;利用划痕致伤构建细胞损伤模型,于伤后12、24、48 h,通过RT-PCR测定NF-κB mRNA的转录,通过West-ern blot测定其蛋白的表达。结果伤后12 h,APOEε2、ε3、ε4 3组细胞可检测到NF-κB的表达,但各组间比较差异无统计学意义(P>0.05);伤后24 h,3组细胞NF-κB的表达较伤前增高,且APOEε4组的表达明显高于APOEε2和APOEε3组(P<0.05);伤后48 h,表达进一步增强,APOEε4组的表达依然明显高于APOEε2和APOEε3组(P<0.05)。结论损伤后早期,携带APOEε4等位基因的星形胶质细胞NF-κB的表达水平高于APOEε2和APOEε3型,提示APOEε4携带体可能通...     

人APOEε2及ε4等位基因修饰的神经干细胞的建立

目的构建APOEε2和APOEε4的真核表达载体,转染APOE敲除鼠神经干细胞,分别建立转染APOEε2和ε4的神经干细胞系。方法以前期克隆得到的APOEε3cDNA为基础,通过定点突变技术得到APOEε2和APOEε4cDNA,亚克隆入表达载体pEGFP-N1,构建pEGFP-N1-APOEε2及pEGFP-N1-APOEε4的真核表达载体,经双酶切和测序确定序列及阅读框正确。以脂质体转染法转染APOE敲除鼠神经干细胞,通过G418筛选,建立转染APOEε2和ε4的神经干细胞系。采用RT-PCR、Westernblot及免疫荧光法检测APOE的表达。结果APOE敲除鼠NSCs转染6h后发出绿色荧光,48h达到高峰,荧光显微镜下观察转染率约(40.0±2.3)%,转染pEGFP-N1-APOE的NSCs在筛选至第10天可见细胞克隆形成。经鉴定保持了自我更新、多向分化保持性,其中分化为神经元的比例为(32.15±2.61)%,各组之间无明显差异。结论成功构建了稳定表达源性APOEε2及ε4的神经干细胞克隆,相应等位基因修饰的神经干细胞能高效表达目的基因蛋白并保留其干细胞特性。     

人载脂蛋白Eε3等位基因的克隆及表达

目的:克隆人载脂蛋白E(Apolipoprotein E,APOE)ε3等位基因,测定序列,并构建带有人源性APOEε3等位基因的真核表达载体.方法:通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从人胎儿脑组织中克隆得到APOEε3等位基因,与PMD19-T载体连接,再酶切PMDl9-T-APOE ε3,获得APOEε3基因,然后将其与表达载体pEGFP-N1连接,构建pEGFP-N1-APOEε3真核表达载体.重组质粒转染293T细胞后,在荧光显微镜下观察EGFP的表达,并用Western-Blot的方法检测目的蛋白在293T细胞中的表达.结果:经酶切和DNA测序证明APOEε3基冈序列正确,真核表达载体构建成功.将重组质粒转染293T细胞,在转染后的细胞中检测到目的蛋白的表达.结论:成功构建了pEGFP-N1-APOEε3真核表达载体,该表达载体能在真核细胞中正确表达.     

载脂蛋白E对星形胶质细胞缺氧性损伤的保护作用

目的探讨载脂蛋白E(apolipoprotein E,APOE)在星形胶质细胞缺氧性损伤中的作用及相关机制。方法①原代培养APOE基因敲除鼠、APOE基因野生鼠的星形胶质细胞,并分别予以缺氧6 h,流式细胞仪分别检测两组细胞早期凋亡率情况;②将培养成熟的APOE基因野生鼠的星形胶质细胞分为常氧组、缺氧组和干预组(缺氧+ERK抑制剂),分别予以缺氧组和干预组缺氧6 h,干预组在缺氧之前向培养基中加入ERK信号通路抑制剂U0126,Western blot法分别检测检测3组细胞APOE蛋白表达变化情况。结果①缺氧6 h后,APOE基因敲除鼠组星形胶质细胞早期凋亡率[(5.67±0.35)%]明显高于APOE基因野生鼠组[(2.77±0.24)%](P<0.05);②与常氧组、干预组相比较,缺氧组星形胶质细胞表达的APOE蛋白明显增加(P<0.05)。结论 APOE对星形胶质细胞缺氧性损伤具有保护作用,缺氧后星形胶质细胞APOE蛋白水平上调与ERK信号通路有关。     

APOE多态性在炎症因子诱导的神经毒性反应性星形胶质细胞中的差异作用

目的：探讨载脂蛋白E (APOE)基因多态性在神经毒性反应性星形胶质细胞中的差异作用,为阿尔茨海默病（AD）发病机制的研究提供理论依据。方法：体外分离培养APOE基因敲除小鼠（APOE-/-）原代皮层星形胶质细胞,免疫荧光染色法鉴定细胞纯度。构建人APOE3和APOE4重组过表达质粒,分别转染至原代APOE-/-星形胶质细胞中,以APOE-/-原代细胞为对照,采用Western blotting法检测细胞中APOE和神经胶质酸性蛋白（GFAP）蛋白表达水平,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测细胞培养上清中APOE水平。采用白细胞介素1α (IL-1α)、肿瘤坏死因子（TNF）和补体C1q联合刺激转染APOE3和转染APOE4的原代星形胶质细胞制备炎症模型,分为APOE3+PBS组、APOE4+PBS组、APOE3+IL-1α+TNF+CC1q组和APOE4+IL-1α+TNF+C1q组,采用细胞免疫荧光染色法观察各组细胞形态表现,采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测各组细胞中磷脂酰肌醇蛋白聚糖4 (Gpc4)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖6 (Gpc6)、血小板反应蛋白1(Th...     

APOE基因亚型对创伤性脑损伤后COG1410早期神经保护作用的影响

目的 探讨载脂蛋白E(apolipoprotein E,APOE表示其基因,apoE表示其相应蛋白)基因亚型对创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)后apoE拟肽(COG1410)早期神经保护作用的影响.方法 以APOE转基因鼠(ε3、ε4)及APOE敲除鼠[APOE(-/-)]作为研究对象,各型鼠随机分为TBI+COG1410组(30只)、TBI+生理盐水组(30只)和假手术组(10只),TBI+COG1410组和TBI+生理盐水组又分为3个亚组:1、3、7d,每组10只,采用PSI脑损伤撞击器精确打击制备TBI模型,并于伤后30 min内首次经尾静脉注射COG1410(1 mg/kg)或生理盐水(同容积).早期脑损伤检测指标包括伤后连续7d的神经功能学测试(转棒时间),以及伤后1、3、7d的脑水肿和淀粉样前体蛋白(amyloidprecursor protein,APP)在创伤周围胼胝体区的半定量表达.结果 在不同APOE基因型小鼠中,ε3鼠在伤后前3d的转棒时间明显优于ε4鼠(P＜0.05).而在TBI+ COG1410组和TBI+生理盐水组的对比中,COG1410在ε3鼠中具有增加伤后4～7d的转棒时间(P＜0.05),同时也可减轻伤后3、7d的脑组织含水量(P＜0.05);而在ε4鼠和APOE(-/-)鼠中,COG1410不仅可以增加伤后1～7d的转棒时间(P＜0.05),同时也可改善伤后1、3d及7d的脑组织含水量(P＜0.05);此外,COG1410可以减轻ε3鼠和APOE(-/-)鼠在伤后1、3、7d的APP表达(P＜0.05),却在ε4鼠伤后1、3、7d的APP表达中没有统计学差异(P＞0.05).结论 APOEε4基因作为一种高危基因,在急性颅脑创伤中预示不良的预后;在APOEε3/3和APOEε4/4基因型中,COG1410均具有降低早期脑损伤、改善预后的作用.     

颅脑创伤在载脂蛋白E基因影响脑电活动中的诱发作用

目的探讨颅脑创伤是否在载脂蛋白E基因(apolipoprotein E,APOE)对脑电活动的影响当中起诱发作用。方法收集118例轻-中型创伤性脑损伤患者的临床资料和40例正常成人的相关信息,采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)检测APOE基因型。在伤后1～3 d,对所有创伤性脑损伤患者进行脑电图检测;在清醒、安静、闭目、血糖正常状态下对所有正常成人进行脑电图检测;采集所有研究对象的定量脑电数据。结果40例正常成人中,APOEε2、APOEε3、APOEε4基因型之间定量数据差异均无统计学意义(P=0.097);118例创伤性脑损伤患者中,脑电活动在APOEε2、APOEε3、APOEε4基因型之间差异有统计学意义(P=0.008);与APOEε3携带者比较,APOEε4携带者的慢活动明显增多,而APOEε2携带者的慢活动相对减少。结论携带不同APOE基因的正常成人脑电活动无差异;在颅脑创伤的诱发下,APOE对脑电活动的影响则表现出亚型特异性;APOEε4对颅脑创伤后的脑电活动带来负面影响,APOEε2则对创伤后的脑功能具有保护作用。     

瘦素对缺血缺氧损伤脑星形胶质细胞凋亡的影响

目的 研究瘦素对缺血缺氧/复氧损伤星形胶质细胞凋亡的影响及其作用机制.方法 制作缺血缺氧大鼠脑皮质星形胶质细胞损伤模型,MTT法检测星形胶质细胞活力;采用Annexin V-FITC试剂盒检测星形胶质细胞凋亡;RT-PCR和Western blot方法检测凋亡相关基因bcl-2、bax、caspase-3的表达.结果 与缺血缺氧损伤组比较,瘦素干预组星形胶质细胞存活率升高(P<0.01)、凋亡率下降(P<0.01);抑凋亡基因bcl-2 mRNA和蛋白表达水平上调(P<0.01),促凋亡基因bax、caspase-3 mRNA和蛋白表达水平下调(P<0.01),呈剂量依赖性.结论 瘦素能够使凋亡相关基因bcl-2表达上调、bax和caspase-3表达下调,从而抑制缺血缺氧损伤星形胶质细胞发生凋亡.     

TH基因修饰的中脑星形胶质细胞的建立

目的 体外构建酪氨酸羟化酶(TH)基因修饰的中脑星形胶质细胞,为进行帕金森病(PD)的转基因细胞治疗奠定基础。方法 应用逆转录病毒表达载体将鼠TH基因转入逆转录病毒包装细胞PA317,通过G418抗性筛选,获取高滴度产毒PA317／pN2ATH细胞株,以其产生的病毒上清感染鼠中脑星形胶质细胞,继续培养7～9d后,免疫组化检测细胞TH表达。结果获得了高滴度产毒PA317／pN2ATH细胞,并且转染pN2ATH的中脑星形胶质细胞成功表达TH。结论转染pN2ATH的中脑星形胶质细胞可以有效表达TH,为将其应用于PD基因治疗实验研究提供了基础。     

精神分裂症患者APOE基因多态性及其与糖脂代谢指标的关系

目的 分析精神分裂症患者APOE基因多态性及其与糖脂代谢指标的关系。方法 选取中山市第三人民医院2020年10月至2021年6月住院诊断为精神分裂症的95名患者,采用荧光PCR法检测所有人员的APOE基因型,用全自动生化分析仪检测其血糖血脂水平,根据APOE基因表现型将患者分为E2、E3和E4 3组。结果 患者APOE基因型分布情况为：ε2/ε2型0例(0%)、ε2/ε3型18例(18.95%)、ε3/ε3型57例(60%)、ε2/ε4型4例(4.21%)、ε3/ε4型15例(15.79%)、ε4/ε4型1例(1.05%);表现型E2型18例(18.95%)、E3型61例(64.21%)、E4型16例(16.84%)。3组间低密度脂蛋白(LDL)、载脂蛋白B(APOB)和脂蛋白a(LP(a))差异有统计学意义(P<0.05);甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、载脂蛋白A1(APOA1)和血糖(GLU)差异无统计学意义(P>0.05)。结论 精神分裂症患者APOE基因呈多态性分布,APOE E4型患者部分血脂水平高于APOE E2型患者。     

脊神经节损伤所介导的脊髓背角兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸变化的实验研究

目的研究脊神经节 (DRG)炎性损伤时 ,脊髓背角兴奋性氨基酸 (EAAs)、抑制性氨基酸 (I AAs)含量和脊髓背角谷氨酸 (Glu)、天门冬氨酸 (Asp)免疫组织化学的变化 ,以及与实验动物神经行为异常变化之间的关系。方法健康家兔 5 4只 ,随机分为手术对照组 ( n =2 4) ;炎症损伤组 ( n =2 4)和正常对照组 (n =6)。采用组织氨基酸的含量分析仪测定脊髓背角Glu ,Asp ,GABA ,Tau ,Thr和Ser含量变化。采用免疫组化法观察脊髓背角Glu和Asp分布特点及变化。结果 1.术后 2～ 4周 ,伤侧的Glu ,Asp ,GABA ,Tau ,Ser含量较术前 ,非伤侧显著增高 (P <0 .0 5 )。 2 .术后 2～ 4周 ,其伤侧N 甲基 D 天 (门 )冬氨酸受体 (NMDAR1)免疫阳性纤维在脊髓背角浅层 (Ⅰ ,Ⅱ )和固有层 (Ⅲ ,Ⅳ )的分布密度和染色强度 ,较术前和非伤侧显著降低 (P <0 .0 5 )。结论DRG炎症损伤所介导脊髓背角EAAs释放增加 ,在痛觉过敏的形成和维持中具有重要作用。而IAAs的增加则与机体抗伤害性保护反应相关。DRG炎症损伤初期 ,脊髓背角EAAs/IAAs动态平衡的破坏是伤害性神经细胞兴奋性损伤和伤侧肢体痛觉过敏的主要原因。     

急性脊髓损伤后脑脊液中兴奋性氨基酸含量变化的临床观察

目的；探讨脑脊液中兴奋性氨基酸（ＥＡＡ）含量性急性脊髓损伤的关系。方法；采用氨基酸自动分析仪检测２６例生脊髓损伤患者脑脊髓（ＣＳＦ）中天门冬氨基酸（Ａｓｐ）、谷氨酸（Ｇｌｕ）等ＥＡＡ含量的动态变化。结果；脊髓损伤后２４ｈ内ＣＳＦ中Ａｓｐ、Ｇｌｕ显著升高，其升高幅度与脊髓损伤的程度成正相关，即脊髓损伤越重；Ａｓｐ、Ｇｌｕ升高越显著，且预后就越差；结论；伤后ＣＳＦ中ＥＡＡ含量可作为衡量脊髓损伤程度和预     

百日咳菌液对大鼠培养脑切片兴奋性氨基酸释放的影响

目的：了解百日咳菌液对培养的大鼠脑切片兴奋性氨基酸（ＥＡＡｓ）释放的影响及１１双氢－５Ｈ－二苯（ａ,ｂ）－环庚烯亚胺（ＭＫ－８０１）对脑切片有无保护作用,方法：ＳＤ大鼠随机分成正常脑切片培养组（ＮＣ组）１０％百日咳菌液脑切片培养组（ＰＢＣ组）和ＭＫ－８０１预处理后１０％百日咳菌液脑切片培养组（ＭＰＢＣ组）及乳酸脱相色谱法测脑切片培养上清液中的ＥＡＡｓ释放量,结果：ＰＢＣ组的谷氨酸（Ｇｌｕ）门冬氨酸     

Acupuncture Effects on Levels of Excitatory Amino Acids in Brain of SAM-P/8

Atpresentthepathogenesisofseniledementiaisindefinite.Besidesthecholinergictheorymoreandmoreevidenceindicatedthatexcitatoryneurotoxicityinducedbyexcitatoryaminoacids(EAAs),especiallybyglutamicacid,playedanimportantroleinitsprocessofoccurrenceanddevelopment(').SenescenceacceleratemouseP/8(SAM--P/8)isakindofagingdementiamodelwhichtakesthedisturbanceofmemoryandstudyasitsmaincharcteristicsinbehaviourdisorderandtheatrophyofcerebralcortex,decreaseofhippocampuspyramidcellsandspongioiddegenerationof…     

丙泊酚对大鼠脊髓星形胶质细胞释放兴奋性氨基酸的影响

目的研究被肿瘤坏死因子（TNF-α）刺激的大鼠脊髓星形胶质细胞（AST）在丙泊酚作用下兴奋性氨基酸（EAA）的释放情况。方法体外纯化培养大鼠脊髓星形胶质细胞，分为TNF-α终浓度为1ug／L及丙泊酚终浓度为25umol／L（TP组），TNF-α终浓度为1ug／L（T组），乳剂对照组（Intralipid，0．2ml／L、L组），空白对照组（C组）。用高效液相色谱仪测定各组培养细胞在0、30、60、120min时谷氨酸（Glu），天门冬氨酸（Asp）的释放量。结果与C组相比，L组的Glu、Asp释放量无明显差异（P〉0．05）；T、TP组Glu、Asp释放量随着时间的延长而增加；与T组相比，60、120man时，TP组Glu、Asp释放量明显减少（P〈0．05）。结论TNF-α刺激AST释放EAA，而丙泊酚对此有抑制作用。     

Effects of Nerve Growth Factor on\= Excitatory Amino Acid Content in\= Spinal Cord Neuron after Spinal Cord Injury

ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎＷｅｅｖａｌｕａｔｅｄｔｈｅｅｆｅｃｔｏｆＮＧＦｆｏｌｏｗｉｎｇｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｉｎｊｕｒｙ（ＳＣＩ）ｂｙｄｅｔｅｃｔｉｎｇｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｅｘｃｉｔａｔｏｒｙａｍｉｎｏａｃｉｄｓ（ＥＡＡ）,ａｎｄｔｏｅｘｐｌｏｒ...     

心肺复苏后大剂量糖皮质激素对脑复苏的影响

目的：针对目前国内外学者就大剂量糖皮质激素对脑保护方面的争议,本课题旨在证实大剂量糖皮质激素是否具有脑保护作用，从而为临床合理选择脑复苏药物提供理论依据。方法：建立犬标准室颤－心脏骤停（VF－CA）模型复苏后，应用大剂量糖皮质激素对兴奋性氨基酸类（EAAs）神经毒素－保氨酸（Glu）、天门冬氨酸（Asp）以及单胺类神经递质－五羟色胺（5－HT）、多巴胺（DA）的影响，并观察相应脑组织形态学方面的改变，以评估糖皮质激素在脑复苏中的应用价值。结果：应用大剂量糖皮质激素后脑组织EAAs释放明显减少，表现为外周血中Glu、Asp含量降低；而脑组织中糖皮质激素组中DA、5－HT含量明显降低；显微镜及透射电镜观察脑组织的结果显示了用药组脑水肿程度及各细胞器的损害程度明显减轻。结论：应用大剂量糖皮质激素具有确切有效的脑保护作用。     

细菌性脑膜炎患儿脑脊液中兴奋性氨基酸的变化及临床意义

目的　探讨细菌性脑膜炎患儿脑脊液中谷氨酸和天门冬氨酸的含量及临床意义。方法　根据细菌性脑膜炎的诊断标准选择 40例细菌性脑膜炎患儿作为细菌性脑膜炎组, 另选择 16例非神经系统疾病的患儿作对照组, 均于入院当天做腰穿留取脑脊液置-30℃冰箱保存待测。用高效液相色谱法测定脑脊液中谷氨酸和天门冬氨酸的含量。结果　细菌性脑膜炎患儿脑脊液中谷氨酸和天门冬氨酸的含量与对照组比较, 差别有显著性意义 (P均 <0。 05)。结论　细菌性脑膜炎的病理生理过程中存在着兴奋性氨基酸的兴奋毒性。兴奋性氨基酸的受体拮抗剂的应用有可能成为一种重要的治疗细菌性脑膜炎的新方法。