敲低IKKε抑制人胶质瘤细胞U251增殖和侵袭的体外研究

目的 探究敲低IKKε表达对人胶质瘤细胞系U251生物学特征的影响. 方法 采用脂质体介导的IKKε小干扰RNA(IKKε siRNA)转染U251细胞,同时设转染无义序列组和对照组,RT-PCR鉴定转染后IKKε mRNA的表达;MTT法检测转染后细胞的增殖能力;流式细胞术检测细胞周期分布的改变;Transwell实验检测细胞侵袭能力的变化;Western blotting法检测核增殖抗原(PCNA)、细胞周期素D1 (Cyclin D1)、基质金属蛋白酶-9(MMP9)和NF-κB P65的表达. 结果 与对照组和无义序列组比较,转染IKKε siRNA组细胞IKKε mRNA的表达和细胞增殖率降低,G0/G1期细胞比例增高,穿膜细胞数明显减少,差异均有统计学意义(P＜0.05).Western blotting检测结果显示IKKε siRNA组细胞PCNA、MMP9、Cyclin D1的表达较对照组和无义序列组明显下调,而且NF-κB组分P65从胞浆向胞核的转座减少. 结论 IKKε在胶质瘤细胞增殖和侵袭过程中发挥重要作用,有望成为人脑胶质瘤基因治疗的侯选靶点.     

靶向AKT1和COX-2的RNAi抑制U251胶质瘤细胞侵袭的体外实验

目的应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术敲低恶性胶质瘤细胞系U251中AKT1和COX-2表达后,在体外对细胞侵袭转移的抑制作用,初步探讨其可能的作用机制。方法构建重组腺病毒载体rAd5-A-C同时搭载靶向AKT1和COX-2的shRNA干扰序列,将其转染至恶性胶质瘤细胞系U251细胞。Realtime PCR检测RNAi后目的基因mRNA的表达水平,Western Blot检测目的基因及MMP-2、MMP-9、TIMP-2的表达情况。酶联免疫吸附试验检测转染前后分泌到细胞外的MMP-2和MMP-9的浓度变化。划痕实验和Transwell实验评价肿瘤细胞转染前后的细胞侵袭能力的变化。结果rAd5-A-C转染组AKT1和COX-2的mRNA和蛋白表达均明显抑制;MMP-2、MMP-9表达下调,TIMP-2表达则上调。ELISA检测胞外MMP-2、MMP-9浓度明显减低;划痕实验显示细胞转移运动能力明显减弱,Transwell体外侵袭实验结果显示穿过细胞数明显减低(P0.001)。结论重组腺病毒介导的RNAi技术可以序列特异性地抑制U251细胞AKT1和COX-2的表达,在体外对U251细胞侵袭转移产生明显抑制作用,可能成为恶性胶质瘤治疗的新策略。     

MSP58基因小干扰RNA对胶质瘤细胞系U251增殖的影响

目的观察核微球蛋白58（MSP58）基因特异性siRNA（small interfering RNA）对神经胶质瘤U251细胞的体外增殖的影响。方法体外化学合成针对MSP58基因的siRNA,脂质体法转染神经胶质瘤细胞系U251,荧光显微镜观察转染效率,逆转录酶-多聚酶链反应（RT-PCR）和Western blot分别检测MSP58基因的mRNA和蛋白表达水平,甲基噻唑基四唑法（MTT法）绘制细胞生长曲线,流式细胞仪（FCM）分析细胞周期。结果MSP58基因的特异性siRNA转染U251细胞后,MSP58的mRNA和蛋白表达水平明显降低,细胞增殖受到明显抑制;流式细胞仪检测显示转染后的U251细胞G2/M期细胞明显减少（P〈0.01）,S期细胞略有减少,G1期细胞明显增加（P〈0.01）,G1期发生明显阻滞。结论MSP58基因的特异性siRNA可明显抑制神经胶质瘤细胞U251的增殖,并引起G1期细胞阻滞。     

miR-21调控人脑胶质瘤细胞侵袭能力的体外研究

目的 探讨miR-21调控人脑胶质瘤细胞侵袭能力的体外机制.方法 脂质体介导反义miR-21(AS-miR-21)转染体外常规培养的U251细胞,同时设无义寡脱氧核苷酸(ODN)组和对照组.测定荧光素酶活性验证3组细胞中miR-21的表达,Matrigel基质生长实验检测U251细胞的生长情况,Transwell细胞体外迁移实验检测U251细胞的迁移能力,Western blotting检测细胞侵袭相关蛋白局部粘着斑激酶(FAK)、基质金属蛋白酶9/2(MMP-9/2)、人基质金属蛋白酶抑制因子1(TIMP-1)、微管蛋白α(Tubulin-α)的表达,免疫荧光检测细胞Tubulin-α蛋白的形态. 结果 与对照组和无义ODN组比较,转染AS-miR-21组U251细胞miR-21表达水平降低,Matrigel基质生长实验显示转染AS-miR-21组U251细胞体外培养克隆平均直径较小,Transwell细胞体外迁移实验显示转染AS-miR-21组穿膜细胞数较少,Western blotting结果 显示转染AS-miR-21组U251细胞FAK、MMP-9/2表达较低,TIMP-1表达较高,差异均有统计学意义(P＜0.05).Tubulin-α的表达无明显变化,免疫荧光染色显示转染AS-miR-21组Tubulin-α蛋白形态扭曲. 结论 miR-21高表达可以促进U251胶质瘤细胞侵袭生长,提示miR-21可以作为基因治疗脑胶质瘤的候选靶点.     

RNA干扰PDGF-B基因对胶质瘤U251细胞凋亡和增殖的影响

目的利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术特定沉默胶质瘤U251细胞株的血小板源生长因子-B(PDGF-B)基因,观察其对U251细胞株细胞凋亡和增殖的影响。方法利用脂质体将针对PDGF-B基因的siRNA转染进入U251细胞,利用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(RTPCR)检测PDGF-B基因表达;Western blot检测显示siRNA转染组PDGF-B蛋白表达,采用MTT法检测胶质瘤U251细胞的增殖,应用流式细胞计数观察抑制PDGF-B基因后胶质瘤U251细胞的凋亡情况。结果 RT-PCR检测PDGF-B基因表达明显下降;Western blot检测显示siRNA转染组PDGF-B蛋白表达明显抑制(抑制率60%),MTT结果显示siRNA转染组U251细胞增殖较对照组明显降低;流式细胞学检测提示降低PDGF-B在胶质瘤细胞的表达能抑制胶质瘤细胞的有丝分裂,促进细胞的凋亡。结论构建针对胶质瘤细胞PDGF-B的RNA干扰质粒并转染人胶质瘤U251细胞株后,可明显抑制U251细胞株PDGF的表达,对人胶质瘤U251细胞株有明显的生长抑制和促进凋亡作用。     

RNA干扰敲低Wnt2的表达抑制U251细胞生长的体内外研究

目的 在体内外研究转染靶向Wnt2的siRNA对U251细胞的抑制效果.方法 向U251细胞转染靶向Wnt2的siRNA后,免疫印记检测转染后Wnt2及相关蛋白表达,MTT检测细胞增殖,annexin标记细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞周期分布,鼠尾胶3D生长实验检测细胞侵袭能力的变化.建立裸鼠胶质瘤皮下动物模型,瘤内注射Wnt2 siRNA观察肿瘤生长情况.结果 转染Wnt2siRNA后,U251细胞的Wnt2、frizzled2、磷酸化GSK-3β、β-catenin等表达降低,细胞增殖受抑,凋亡率升高,细胞阻滞于G0/G1期.体内研究发现转染靶向Wnt2的siRNA后,裸鼠皮下肿瘤的生长速度缓慢,相应的蛋白表达降低.结论 转染靶向Wnt2的siRNA可有效敲低该基因在U251细胞内的表达,从而抑制了胶质瘤细胞生长,具有潜在的治疗前景.     

RNA干涉CD44基因抑制脑胶质瘤细胞U251的增殖与侵袭性研究

目的通过合成靶向分化抗原簇44(CD44)基因的siRNA片段,下调CD44在脑胶质瘤细胞U251中的表达,揭示其在胶质瘤增殖、迁移和侵袭中所起的作用。方法根据CD44基因序列设计并合成的siRNA片段转染U251细胞,利用荧光实时定量(qRT-PCR)检测细胞中CD44基因mRNA水平的变化;蛋白印迹实验(Western blot)检测CD44基因蛋白水平的变化;四甲基偶氮唑蓝染色(methyhhiazolyl tetrazolium,MTT)法检测U251细胞增殖;单细胞划痕愈合实验、Transwell小室侵袭实验检测U251细胞的迁移与侵袭能力变化。结果体外合成的CD44-siRNA能有效抑制U251细胞中CD44基因在mRNA水平与蛋白水平的表达(P0.05),并抑制细胞的增殖(P0.05)和迁移侵袭能力(P0.05)。结论 CD44-siRNA能够有效抑制U251脑胶质瘤细胞的增殖及其迁移侵袭力,为以CD44为靶点的肿瘤基因治疗奠定了基础。     

谷氨酸对胶质瘤细胞分泌MMP-2及侵袭性的影响

目的 研究谷氨酸促进胶质瘤侵袭性的机制. 方法 体外常规培养胶质瘤细胞株U251,用100 μmol/L谷氨酸处理24 h后Transwell细胞侵袭试验检测侵袭性;处理2、4、8、12h后应用明胶酶谱实验分析细胞基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)的分泌;处理3、6、9h后应用Western blotting实验检测基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)蛋白的表达. 结果 Transwell细胞侵袭试验显示谷氨酸组穿膜细胞数(37.44±2.31)明显多于对照组穿膜细胞数(25.89±3.00),差异有统计学意义(P＜0.05);明胶酶谱分析实验显示谷氨酸处理8、12h后U251细胞分泌MMP-2增加,较对照组差异有统计学意义(P＜0.05);Western blotting检测显示谷氨酸处理U251细胞3、6、9h后EMMPRIN蛋白的表达无变化,较对照组差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 谷氨酸可能通过促进胶质瘤细胞分泌MMP-2增强胶质瘤细胞的侵袭性.MMP-9和EMMPRIN未参与谷氨酸增强胶质瘤细胞侵袭性的过程.     

隔蛋白7对胶质瘤细胞系U251细胞周期的影响

目的 检测SEVT7对胶质瘤细胞系U251的细胞周期、增殖、侵袭以及凋亡的影响.方法 流式细胞术分析转染SEPT7对细胞周期的影响,Western blot检测细胞周期因子表达变化,MTT法和Annexin V法评价SEFT7对U251细胞的增殖活性和凋亡的影响,Martrigel三维立体培养分析转染SEPT7后U251细胞侵袭能力的变化.结果 SEPT7使U251细胞G0/G1期阻滞,S期细胞比例(SPF)降低,增殖活性和侵袭能力明显受到抑制,并可诱发细胞凋亡.结论 SEPT7抑制U251细胞侵袭、增殖,促进凋亡.结果 提示,SEPT7是对胶质瘤具有抑制作用的基因.     

microRNA134对胶质瘤U87细胞增殖及侵袭的影响

目的研究微小RNA-134(miRNA-134)对人脑胶质瘤细胞系U87在侵袭、迁移方面的作用并探讨可能的作用机制。方法通过人工合成miR-134 mimic瞬时转染脑胶质瘤细胞系U87,实时定量荧光聚合酶链式反应(PCR)检测细胞miR-134的表达水平;并通过四唑盐比色法(MTT)检测U87细胞增殖情况;Transwell小室法检测各组U87细胞株迁移和侵袭能力;实时定量荧光PCR及蛋白质印迹法(Western blot)检测各组基质金属蛋白酶3(MMP-3)的表达水平。统计学数据处理釆用SPSS 19.0软件处理,组间比较采用单因素方差分析,P0.05有统计学意思。结果荧光显微镜下观察转染效率90%以上,实时定量荧光PCR结果显示与未处理的空白对照组(control)及空白转染组(Mock)比较,miR-134转染组的miR-134表达水平明显上调,可达到对照组的5~6倍(P0.05);MTT实验结果表明miR-134转染组细胞增殖能力明显下降(P0.05),同时Transwell实验也显示miR-134转染组细胞的迁移能力明显降低(P0.05);实时定量荧光PCR及Western blot分析MMP-3表达情况发现,过表达miR-134可以明显减少MMP-3基因及蛋白的表达水平(P0.05)。结论本研究表明miR-134能够抑制胶质瘤U87细胞的增殖及侵袭迁移能力,其机制可能与抑制MMP-3的表达有关,提示miR-134可能成为胶质瘤治疗的新靶点。     

miR-203靶向抑制survivin影响胶质瘤细胞的生长和增殖

目的 探讨miR - 203靶向抑制survivin对人胶质瘤细胞株U251生长和增殖的影响.方法 利用生物信息学预测miR -203靶基因;通过脂质体将miR - 203模拟物或表达质粒转染至U251细胞,使用Real - time PCR和Western blot检测靶基因survivin的mRNA和蛋白水平,采用双荧光素酶报告基因系统进行功能验证,应用细胞生长曲线、MTT实验、流式细胞术评价细胞生长、增殖和凋亡的变化及对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)和塞来昔布的敏感性.结果 TargetScan预测发现survivin是miR - 203的靶基因;转染miR - 203模拟物或表达质粒后,Real - time PCR与Western blot结果分别提示survivin的mRNA和蛋白水平下调(P＜0.05);双荧光素酶报告分析技术证实抗凋亡基因survivin为miR - 203的直接靶点;细胞生长曲线结果显示miR - 203组的生长速度明显受抑(P＜0.05);MTT实验表明miR - 203组的增殖能力减弱(P＜0.05)及药物敏感性增加;流式细胞术结果示miR -203组的凋亡比例明显升高(P＜0.01).结论 miR - 203在胶质瘤细胞中能靶向抑制survivin的表达,是一个抗增殖、促凋亡的miRNA,有可能作为今后胶质瘤干预治疗的新靶点.     

siRNA靶向沉默组织蛋白酶D对胶质瘤细胞生物学行为的影响

目的 探讨小分子干扰RNA(siRNA)靶向沉默胶质瘤细胞系U87中组织蛋白酶D(CD)对胶质瘤细胞生物学行为的影响. 方法 采用脂质体介导的CD siRNA、scramble siRNA、空白对照siRNA转染体外常规培养的胶质瘤细胞株U87,RT-PCR、Western blotting分别检测转染后U87细胞CD mRNA和蛋白的表达;MTT法检测转染CD siRNA、scramble siRNA 1～5 d后U87细胞的增殖;细胞侵袭实验检测转染CD siRNA、scramble siRNA 48 h后细胞侵袭能力的变化. 结果 转染48 h后CD siRNA组细胞CD mRNA、蛋白的表达明显低于转染scramble siRNA和空白对照siRNA组,差异有统计学意义(P＜0.05);转染后2、3、4、5d转染CD siRNA组U87细胞吸光度(A)值低于转染scramble siRNA组,差异有统计学意义(P＜0.05);细胞侵袭实验结果表明转染CDsiRNA组滤膜细胞数低于转染scramble siRNA组,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 CD可能是具有广泛应用前景的胶质瘤分子生物治疗的靶点.     

miR-92b对神经胶质瘤细胞U251增殖及迁移侵袭的 影响

目的 探究miR-92b对神经胶质瘤细胞U251增殖及迁移侵袭的影响以及其可能机制.方法 利用miRNA芯片筛选出在神经胶质瘤细胞U251和人脑正常胶质细胞HEB中差异表达的miRNA;化学合成法制备miR-92b抑制剂,转染后用real-time PCR技术验证表达变化;CCK-8实验检测转染后细胞的增殖能力;划痕实验和Transewll实验检测转染后细胞的迁移和侵袭能力;Western blot检测细胞中胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)、β-catenin和E-cadherin的表达;荧光酶素实验验证IGFBP-3是否为miR-92b的靶基因.结果 基因芯片结果显示miR-92b在神经胶质瘤细胞中表达水平高于人脑正常胶质细胞(P<0.05);CCK-8实验结果显示转染miR-92b抑制剂后,U251细胞增殖能力降低(P<0.05);划痕实验和Transwell实验结果显示转染miR-92b抑制剂后,U251细胞迁移和侵袭能力降低(P<0.05);Western blot结果显示抑制miR-92b后,IGFBP-3和E-cadherin蛋白表达增加(P<0.05),β-catenin表达减少(P<0.05);荧光素酶实验结果显示,miR-92b能直接靶向调控IGFBP-3.结论 miR-92b在神经胶质瘤中表达显著增加,其可能通过抑制IGFBP-3蛋白表达,从而促进肿瘤细胞的增殖及迁移侵袭.     

FAK siRNA重组质粒的构建及其对胶质瘤U251细胞 增殖及侵袭能力的抑制作用

目的 探讨应用RNA干扰技术沉默黏着斑激酶（FAK）基因表达对人脑胶质瘤U251细胞增殖和侵袭能力的影响。方法 将构建成功的FAK siRNA重组质粒转染至U251细胞,合成与FAK基因序列无关的siRNA作为阴性对照,以野生型U251细胞作为空白对照组。运用PCR和免疫印迹法观察FAK mRNA和蛋白表达情况,实时细胞分析仪检测观察细胞增殖情况,Transwell小室侵袭模型研究细胞侵袭能力。结果 重组质粒pBSilence1.1-FAK构建成功;与空白对照组和阴性对照组相比,干扰组细胞增殖减慢（P <0.05）;Transwell小室体外侵袭结果 显示,干扰组穿膜细胞数仅为（17.1±1.0）,明显低于空白对照组（68.2±4.5;P <0.05）和阴性对照组（67.0±2.3;P <0.05）。结论 沉默FAK基因表达可有效抑制人胶质瘤U251细胞的增殖和侵袭能力。     

lncRNA SNHG16对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和迁移的影响

目的 探讨沉默长链非编码RNA核内小RNA宿主基因16（SNHG16）对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法 实时荧光定量PCR检测正常胶质细胞HEB、NHA和胶质瘤细胞A172、U251、U87、SHG-4中SNHG16的表达。用siRNA沉默U251细胞SNHG16的表达，分为NC-siRNA组和SNHG16-siRNA组，CCK-8法检测细胞增殖，Transwell实验检测细胞侵袭，划痕实验检测细胞迁移。结果 与正常胶质细胞HEB和NHA比较，胶质瘤细胞A172、U251、U87和SHG-4的SNHG16表达水平明显升高（P<0.05）。与NC-siRNA组比较，SNHG16-siRNA组细胞增殖能力、细胞侵袭能力和细胞迁移能力均明显降低（P<0.05）。结论 SNHG16在胶质瘤细胞中高表达，特异性沉默SNHG16基因可以抑制胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力。     

RhoE表达上调抑制U87细胞增殖与侵袭

目的探讨RhoE在胶质瘤发生发展过程中的作用。方法将包含RhoE基因的质粒转染U87细胞后,采用四唑盐（MTr）法检测细胞增殖能力的变化;Transwell侵袭试验检测细胞侵袭能力的改变;Westernblot分析细胞基质金属蛋白酶（MMP）-2和-9的表达变化。结果RhoE蛋白在U87和U251细胞系中表达明显低于正常人脑胶质细胞;上调RhoE表达,U87细胞增殖和侵袭能力明显下降（P〈0．05）;Westernbolt检测显示上调RhoE表达能够降低U87细胞MMP-2和MMP-9蛋白表达水平（P〈0．05）。结论上调RhoE的表达能够抑制胶质瘤U87细胞的增殖和侵袭能力。     

miR-137调控人脑胶质瘤细胞增殖侵袭能力的体内外研究

目的探讨miR-137调控人脑胶质瘤细胞的增殖侵袭性生长能力及其机制。方法采用实时PCR分析miR-137在不同品系胶质瘤细胞及不同级别胶质瘤样本中的表达;脂质体介导miR-137模拟物转染胶质瘤细胞,实时PCR检测转染后miR-137的表达;应用MTT法、流式细胞术评价细胞生长和增殖的生物学特征变化;划痕实验、transwell细胞体外迁移实验检测肿瘤细胞迁移、侵袭能力;动物实验评价体内条件下肿瘤生长能力变化;Western blot、免疫组织化学染色检测肿瘤细胞Ki-67、MMP9表达水平。结果实时PCR分析显示：miR-137在胶质瘤中低表达。miR-137模拟物转染LN229和U87细胞后,实时PCR显示：miR-137表达上调;MTT法及流式细胞术显示细胞生长受抑,出现G0/G1期阻滞;划痕实验及transwell实验证实：细胞迁移侵袭能力下降;进一步Western blot、免疫组织化学染色显示：增殖侵袭相关蛋白Ki-67、MMP9表达降低;动物实验反映：肿瘤细胞生长受抑制。结论 miR-137高表达可抑制胶质瘤细胞生长和侵袭能力,提示miR-137可作为基因治疗脑胶质瘤的候选靶点。     

miR-29c对脑胶质瘤U251细胞生物学活性的影响

目的 探讨miR-29c对脑胶质瘤U251细胞生物学活性的影响及可能机制.方法 体外培养胶质瘤U251细胞,实验组将miR-29c mimics转染至细胞,miR mimcs转染作为对照组.应用实时荧光定量PCR检测转染后miR-29c表达量的改变,MTT实验测定细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡情况,体外侵袭实验分析miR-29c转染后细胞的体外侵袭能力,Western blot检测转染后转录因子YY1蛋白的表达.结果 荧光定量PCR结果显示:实验组miR-29c表达量为(106.65±15.51),较对照组显著上调(P＜0.01).与对照组比较,实验组U251细胞的增殖能力明显降低(P＜0.01),凋亡率增加(P＜0.05),体外侵袭能力明显减弱(P＜0.01),YY1蛋白表达下调(P＜0.01).结论 miR-29c可能通过调控YY1蛋白的表达抑制胶质瘤细胞的生物活性.     

靶向乙酰肝素酶的小干扰RNA对胶质瘤细胞恶性生物学行为的影响

目的探讨靶向乙酰肝素酶（HPSE）的小于扰RNA（siRNA）对人脑胶质瘤细胞株U251恶性生物学行为的影响。方法针对HPSEmRNA序列设计并合成3条siRNA．利用脂质体Lipofectemine2000作为载体将siRNA转染U251细胞，采用反转录聚合酶链反应（RT-PCRl和免疫细胞化学方法分别检测转染前后U251细胞中HPSE基因mRNA及蛋白的表达水平，同时利用MTT法和Mitragel法检测细胞增殖率和侵袭力的变化。结果转染靶向HPSE基因siRNA后的U251细胞HPSE基因mRNA及蛋白表达水平降低，同时细胞增殖率和侵袭力均受到抑制。结论靶向HPSE基因的siRNA能通过抑制U251细胞中HPSE基因的表达降低U251细胞恶性生物学行为。     

白藜芦醇通过下调CD44表达抑制胶质瘤U251细胞增殖和侵袭

目的 探讨白藜芦醇对脑胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响及可能的分子调控机制。方法 体外培养胶质瘤U251细胞,分别用浓度为0 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L白藜芦醇继续培养48 h,参考Lipofectamine2000TM说明书将pcDNA3.1/CD44（CD44过表达）、pcDNA3.1（过表达对照）等质粒转染胶质瘤U251细胞并培养24 h进行后续实验。利用CCK-8法检测细胞增殖,利用Transwell实验检测细胞侵袭;RT-PCR和免疫印迹法检测细胞CD44、CyclinD1、CDK4、MMP2和MMP9的mRNA和蛋白表达。结果 白藜芦醇明显抑制U251细胞的增殖和侵袭能力（P<0.05）,而且呈浓度依赖性（P<0.05）;所以,用150 μmol/L白藜芦醇进行CD44干预实验。白藜芦醇明显抑制U251细胞CD44、CyclinD1、CDK4、MMP2和MMP9的mRNA和蛋白表达（P<0.05）,而且呈浓度依赖性（P<0.05）。CD44过表达明显抑制白藜芦醇对胶质瘤U251细胞增殖和侵袭的抑制作用（P<0.05。结论 白藜芦醇抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭,其机制与下调CD44的表达有关。