胎儿骨髓来源的Flk1+CD34-细胞的血液血管干细胞特性

目的研究骨髓基质中是否具有血液血管干细胞的特征。方法分离并培养人胎儿骨髓基质细胞(hfMSCs),FACS检测细胞的免疫表型。将此细胞接种在基底膜胶中,由血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导,免疫组化和透射电镜检测血管和造血的分化形成。结果此细胞群体的典型特征是CD34阴性的成纤维样细胞99%表达Flk1(即血管内皮细胞生长因子受体2),并能形成血管样结构,而在管样结构形成的过程中诱导出CD34阳性的圆形细胞。结论Flk1 CD34-的hfMSC能向血管内皮细胞和造血细胞分化,提示其具有血液血管干细胞的特征表型。     

成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞血液血管干细胞特性观察

目的:检测脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞是否具有血液血管干细胞的特性.方法:将脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞分别于血管内皮及造血细胞诱导培养体系中培养,采用RT-PCR、免疫组织化学方法检测分析其生物学特性.结果:脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞在内皮细胞诱导体系中可分化为CD31 /vWF 细胞,在基底膜胶中可形成血管样结构;在造血诱导培养体系中可定向分化为表达GATA-1、GATA-2、β及γ珠蛋白的细胞,在甲基纤维素造血培养基中,这类造血细胞可定向分化为红系集落单位.结论:脂肪源Flk1 CD31-CD34-细胞在体外可同时向血管内皮细胞和造血细胞分化,具有血液血管干细胞的特性.     

体内外诱导CD34^34＋细胞生成血管内皮细胞的方法及其组织工程学运用

目的：本实验设计从骨髓中提取CD34^34 细胞作为血管内皮细胞干细胞,经诱导生成血管内皮应用于组织工程学器官重建术。方法：利用免疫磁珠法从骨髓中提纯的CD34^34 细胞在体外经血管内皮细胞生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（bFGF)诱导;在动物实验中,CD34^34 细胞经Dil标记后于Matrigel混合涂于裸鼠背部皮肤缺损处,表面 胸膜组织。结果：细胞经诱导可转化生成血管内皮细胞,Ⅷ：Ag,CD31^ 染色阳性,并可在重组基底膜（Matrigel)中形成三维毛细血管网状结构,体内实验结果可见CD34^34 细胞参与并加速胸膜下毛细血管网形成,短时期内重建血供系统确保胸膜组织存活。对照组（单纯覆Matrigel与胸膜）胸膜缺血坏死。结论：可利用CD34^34 细胞替代毛细管内皮细胞重建正常组织毛细血管网,与器官实质细胞共同组织成复合组织,运用于组织工程化器官重建术,为解决组织工程器官替代品血供问题提供新思路。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞定向血管内皮细胞分化

目的研究人骨髓间充质干细胞(BDMSC)向血管内皮细胞的诱导分化,为复杂器官组织工程血管化及细胞移植修复损伤组织提供理想的细胞来源.方法以血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子对种植于纤维蛋白凝胶及基底膜基质中的BDMSC进行三维立体诱导培养,在培养后不同时间分别进行形态观察、组织切片和CD34、CD31、血管内皮生长因子受体-1(VEGFR-1,Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1)、vWF的免疫组织化学荧光染色.结果诱导后的人BDMSC阳性表达血管内皮细胞特有表面标志CD34、CD31、Flt-1、Flk-1、vWF,并生成内皮样细胞,形成血管样结构.结论血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及诱导后表达的Flt-1、Flk-1等表面分子可能在BDMSC向血管内皮细胞分化、并形成血管样结构的过程中提供适宜的微环境并起重要作用,这为间充质干细胞在组织工程血管化及细胞移植修复损伤中的应用提供了理论与技术上的支持.     

人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞诱导分化的实验研究

目的：探讨人骨髓间充质干细胞（hMSCs）向血管内皮细胞（ECs）诱导分化的可行性。方法：用贴壁法从成人骨髓中分离出间充质干细胞,培养扩增后,加入10ng／ml的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和人血管内皮生长因子（hVEGF）向ECs诱导分化,分别于0、24d流式细胞术检测细胞表型及荧光染色鉴定细胞。结果：hMSCs向ECs诱导分化24d,细胞CD34、KDR转为阳性,CD54、CD106、vWF表达增加。可摄取ac—LDL,并可结合UEA。结论：hMSCs经bFGF和VEGF作用,分化为具有ECs的表型和部分功能的细胞。     

体外定向诱导人胎盘源间充质干细胞向内皮细胞分化

目的：探讨人胎盘源间充质干细胞（HPMSCS）在特定环境诱导下向内皮细胞分化的潜能，为其促进创伤愈合提供理论依据。方法：在患者知情同意的情况下，从足月分娩产妇娩出的胎盘组织中分离培养HPMSCS，通过倒置显微镜观察其生物学形态，利用流式细胞术检测其表面标志，并通过成骨诱导鉴定及成脂肪诱导鉴定确定其多向分化潜能。对鉴定后的HPMSCS在体外通过内皮细胞诱导液使之向内皮细胞分化，并对诱导后细胞进行细胞化学荧光染色，检测内皮细胞特异性Ⅷ因子（vWF）的表达；采用流式细胞术检测诱导后细胞表面标志，观察是否具有内皮细胞表型。结果：HPMSCS在培养基中持续培养后,形态由成纤维细胞样转变为类似内皮细胞的铺路石样结构。成熟内皮细胞特异的表面标志vWF为阳性表达。流式细胞术检测结果显示：CD31及CD34均有表达。结论：本诱导方案能够诱导HPMSCS出现内皮细胞表型,提示HPMSCS在体外特定条件下具有定向分化为内皮细胞的潜能。     

小鼠骨髓间充质干细胞定向诱导分化血管内皮细胞的实验研究

目的探讨体外小鼠骨髓间充质干细胞(mBMMSCs)的分离培养对其定向诱导分化为血管内皮细胞(VECs)的可行性。方法采用全骨髓贴壁法,分离骨髓间充质干细胞(MSCs)体外纯化培养并传代,倒置显微镜观察原代细胞形态变化,采用生长曲线法及3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法观察传代细胞生长特性。采用第3代mBMMSCs在内皮细胞生长培养基(EBM-2)中以血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)进行定向诱导,观察细胞形态学变化;流式细胞仪分析比较第3代mBMMSCs及诱导后细胞DNA周期、细胞免疫表型的变化;免疫细胞荧光技术分别检测CD31、vWF和CD34表达及摄取Di-lac-LDL结合FITC-UEA-1的功能特点;体外血管形成实验检测血管内皮细胞的功能。结果 mBMMSCs原代培养呈长梭形、漩涡状排列生长,P1、P2、P3细胞生长曲线及MTT法显示呈潜伏期、对数生长期及平台期生长。诱导后的部分细胞形态可见类似血管内皮样改变,呈多角形、短梭形、铺路石样排列生长;细胞周期分析显示,第3代mBMMSCs G0/G1期为86%,诱导分化后的细胞G0/G1期为92%,细胞DNA周期无明显差异;第3代mBMMSCs免疫表型结果显示为CD105、CD90、CD73、CD44阳性表达,而CD34、CD45、VEGF(CD309)、CD14阴性表达;诱导分化后的细胞VEGF(CD309)、CD34弱阳性表达,而CD105、CD90、CD73、CD44、CD45、CD14阴性表达;细胞免疫荧光技术检测第3代mBMMSCs表面CD31、vWF和CD34阴性表达,不具有摄取Dil-ac-LDL、结合FITC-UEA-1的功能特点及形成血管管腔样结构;诱导后的细胞表达VECs特异性表面标志CD31、vWF和CD34,具有摄取Di-lac-LDL、结合FITC-UEA-1的功能特点及体外可形成血管管腔样结构。结论采用全骨髓贴壁法培养的mBMMSCs在体外具有定向诱导分化为VECs的潜能,成为血管组织工程理想的细胞来源。     

体内外诱导CD34~ 细胞生成血管内皮细胞的方法及其组织工程学运用

目的　本实验设计从骨髓中提取CD34 细胞作为血管内皮细胞干细胞 ,经诱导生成血管内皮细胞应用于组织工程学器官重建术。方法　利用免疫磁珠法从骨髓中提纯的CD34 细胞在体外经血管内皮细胞生长因子 (VEGF)、成纤维细胞生长因子 (bFGF)诱导 ;在动物实验中 ,CD34 细胞经Dil标记后于Matrigel混合涂于裸鼠背部皮肤缺损处 ,表面覆盖人胸膜组织。结果　细胞经诱导可转化生成血管内皮细胞 ,Ⅷ∶Ag、CD31 染色阳性 ,并可在重组基底膜 (Matrigel)中形成三维毛细血管网状结构。体内实验结果可见CD34 细胞参与并加速胸膜下毛细血管网形成 ,短时期内重建血供系统确保胸膜组织存活。对照组 (单纯覆盖Matrigel与胸膜 )胸膜缺血坏死。结论　可利用CD34 细胞替代毛细血管内皮细胞重建正常组织毛细血管网 ,与器官实质细胞共同组成复合组织 ,运用于组织工程化器官重建术 ,为解决组织工程器官替代品血供问题提供新思路     

体外诱导成人外周血干细胞向血管内皮细胞分化

目的研究人外周血干细胞(PBSC)向血管内皮细胞分化。方法以血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对经重组人粒细胞集落刺激因子刺激后采集的PBSC进行诱导培养,观察细胞形态的变化,运用流式细胞术检测诱导后的细胞表达CD31和vWF情况,并用透射电镜观察细胞的超微结构。结果经VEGF和bF-GF诱导后的细胞形态上表现内皮细胞特征,经流式细胞仪测定表达血管内皮细胞特有表面标志CD31和vWF,透射电镜细胞胞浆内可见特征性Weible-Palade小体。结论外周血干细胞在VEGF和bFGF诱导下,可分化为内皮细胞。     

骨髓基质干细胞来源的血管内皮细胞Angiogenin1，Angiogenin2基因的表达

目的：研究骨髓基质干细胞来源的血管内皮细胞表达成熟血管内皮细胞特异性基因,探讨为组织工程血管化提供种子细胞的可行性．方法：从SD大鼠后肢获取骨髓基质干细胞,进行体外扩增培养,取生长良好的第3代细胞体外诱导培养14d．细胞分诱导组（含内皮诱导因子VEGF和bFGF的完全血管内皮细胞条件培养基）和对照组（含M199普通培养基）．MTT法检测两组细胞增殖活性．免疫细胞化学法检测CD31,CD34蛋白的表达;RT—PCR检测细胞血管生成素1（Ang1）、血管生成素2（angiogenin2,Ang2）mRNA的表达．结果：MTT法检测发现,诱导组与对照组在1,2,3,4,5d5个时间点内,其细胞增殖活性无显著性差异（P1d=0．855,P2d=0．053,P3d=0．249,P4d=0．059,P5d=0．174）．免疫细胞化学检测结果CD34,CD31呈阳性表达．RT—PCR结果显示,诱导的血管内皮细胞表达成熟内皮细胞特异性基因Ang1,Ang2．结论：骨髓基质干细胞在一定诱导条件下可以表达血管内皮细胞特异性标志,可作为组织工程血管化理想的种子细胞．     

体内外诱导CD34+细胞生成血管内皮细胞的方法及其组织工程学运用

目的本实验设计从骨髓中提取CD34＋细胞作为血管内皮细胞干细胞,经诱导生成血管内皮细胞应用于组织工程学器官重建术。方法利用免疫磁珠法从骨髓中提纯的CD34＋细胞在体外经血管内皮细胞生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导;在动物实验中,CD34＋细胞经Dil标记后于Matrigel混合涂于裸鼠背部皮肤缺损处,表面覆盖人胸膜组织。结果细胞经诱导可转化生成血管内皮细胞,ⅧAg、CD31＋染色阳性,并可在重组基底膜(Matrigel)中形成三维毛细血管网状结构。体内实验结果可见CD34＋细胞参与并加速胸膜下毛细血管网形成,短时期内重建血供系统确保胸膜组织存活。对照组(单纯覆盖Matrigel与胸膜)胸膜缺血坏死。结论可利用CD34＋细胞替代毛细血管内皮细胞重建正常组织毛细血管网,与器官实质细胞共同组成复合组织,运用于组织工程化器官重建术,为解决组织工程器官替代品血供问题提供新思路。     

间充质干细胞定向诱导为内皮细胞的体外研究

目的:为寻找心血管组织工程新的种子细胞来源,探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养方法和向血管内皮细胞分化的能力.方法:利用淋巴细胞分离液分离出MSCs,并体外扩增,激光共聚焦显微镜检测表面抗原表达,以含血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)的诱导分化培养液定向诱导传代使其向血管内皮细胞方向分化,观察细胞形态的变化,检测内皮细胞特异性标志物的表达.结果:MSCs在体外传代扩增后激光共聚焦显微镜检测结果显示CD44、CD90表达阳性,CD31、CD45为阴性,分化后细胞具有内皮细胞的形态学特征,并表达内皮细胞特异性标志物CD31.结论:骨髓间充质干细胞可在体外诱导向内皮细胞方向分化.     

血液血管干细胞研究进展

血液血管干细胞是造血干细胞和成血管干细胞的前体细胞．它可分化为造血细胞和内皮细胞．具有促进造血和新生血管形成的双重作用。目前，对血液血管干细胞分化发育有较为清楚的认识（图1）。在胚胎，中胚层前体细胞——血液吡管干细胞产生血液细胞和生成新生血管。在成人，同样研究发现存在血液血管干细胞，造血干细胞（hematopoietic stem cell，     

浅谈皮肤间充质干细胞的培养与鉴定

目的：从人皮肤组织中成功分离培养出皮肤间充质干细胞（SMSCs）,并将其诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞及血管内皮细胞。体外长期传代培养SMSCs仍保持良好的干细胞特性,这为SMSCs的深入研究与心血管系统细胞移植提供了新的细胞来源。方法：分离、培养SMSCs,传至第5代用流式细胞仪进行表面标志鉴定;取第5代细胞分别向脂肪、成骨细胞、软骨细胞及血管内皮细胞诱导分化。结果：倒置相差显微镜下细胞呈成纤维细胞状形态,细胞表面标记物CD29、CD44、CD73、CD90、CD105呈高表达,而CD34、CD45和HLA-DR表达阴性。经诱导分化后,细胞均可分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和血管内皮细胞。结论：从人体皮肤组织中可成功分离、培养出SMSCs并能成功定向诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和血管内皮细胞,为细胞移植治疗心血管疾病提供新的原料来源。     

人循环成纤维细胞的体外培养和初步鉴定

自1994年Bucala等\[1\]首次确认了外周血中循环成纤维细胞这一白细胞亚群的存在后,其便逐渐成为了创伤及纤维化病变领域的研究热点。循环成纤维细胞以同时表达部分造血来源细胞（CD34、CD45RO、CD11等）和间质细胞分子（CollagenⅠ、Ⅲ等）标记为特征,可继续分化为肌成纤维细胞。此外,循环成纤维细胞还能够提呈抗原,启动炎症反应;分泌转化生长因子（TGF）-β等纤维形成因子,促进定植于组织中的成纤维细胞增殖、转化及迁移\[2-3\];分泌基质金属蛋白酶（MMPs）和血管内皮生长因子（VEGF）等血管形成因子,促进内皮细胞增殖、迁移,加快新生血管的形成\[4\]。通过以上多种作用参与创伤修复、脏器纤维化及血栓形成等病理过程。目前国内尚鲜有此方面研究。     

脐血CD34＋细胞向内皮细胞诱导分化的体外研究

目的：探讨从脐血中分离CD34＋细胞,并诱导、鉴定其分化为内皮细胞的方法。方法：羟乙基淀粉沉降、密度梯度离心两步法制备脐血单个核细胞,免疫磁珠分选法（MACS）获得CD34＋细胞,在含有细胞因子的M199培养基中诱导。观察细胞形态变化,摄取Dit标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil—AcLDL）的情况,流式鉴定细胞表面标志。结果：分选CD34＋细胞纯度在91％以上,培养3d有明显集落形成及部分细胞贴壁,14d贴壁细胞呈条索状,逐渐增多后呈铺路石样改变。流式检测贴壁细胞表达血管内皮细胞特异性标志物CD144、vWF、CD31、CD34,而白细胞共同抗原CD45为阴性表达,与成熟的脐静脉内皮细胞表达率相近。免疫荧光发现贴壁细胞呈现红色荧光,提示细胞摄取Dil—AcLDL,证明CD34＋细胞分化为有功能的内皮细胞。结论：脐血中存在CD34＋细胞且用两步法和MACS可获得高纯度CD34＋细胞,在特定条件下可分化为内皮细胞。     

肝样细胞的诱导分化及处理胆红素的能力

目的：利用肝细胞生长因子（HGF）、表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子-4（FGF-4）诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）向肝细胞分化,为肝组织工程提供新的细胞来源。方法：取志愿者骨髓,使用密度梯度离心法联合贴壁筛选法获取MSCs,用含有HGF、EGF、FGF的培养基进行培养。用流式细胞仪、免疫细胞化学法鉴定细胞表型,检测诱导后细胞胆红素处理能力。结果：骨髓MSCs生长良好,表型为CD29阳性,CD34阴性。诱导后细胞可在21～28 d时形成肝样细胞。诱导7 d后细胞检测到AFP的表达,第14天时CK18呈阳性表达,随着诱导时间的延长,阳性率增加,并能显著降低胆红素浓度。结论：HGF、EGF、FGF联合能诱导骨髓MSCs分化为具有处理胆红素能力的肝样细胞。     

GM-CSF诱导人脐血CD34+造血干细胞上CXCR3的表达

目的：研究GM-CSF诱导人脐血CD34^ 造血干细胞上CXCR3的表达。方法：采用流式细胞仪，实时定量逆转录PCR（RT-PCR）分析，及其配体γIP-10和Mig诱导的趋化和粘附作用分析。结果：CXCR3也表达在受GM-CSF刺激后的CD34^ 造血干细胞上，但它在新鲜分离的CD34^ 造血干细胞上不表达。应用实时定量逆转录PCR技术检测新鲜分离的CD34^ 造血干细胞有较低水平的CXCR3 mRNA表达，而GM-CSF能上调CXCR3的表达。用抗CXCR3单克隆抗体（mAb)能阻断γIP-10和Mig诱导的造血干细胞趋化作用，证实γIP-10和Mig是通过CXCR3而发挥作用的。γIP-10和Mig通过CXCR3不仅可诱导趋化作用而且还可诱导GM-CSF刺激后的CD34^ 造血干细胞粘附和聚集作用，而抗CXCR3 mAb能阻断γIP-10和Mig这些功能，但不能阻断SDF-1α的作用。γIP-10和Mig能提高整合素（CD49a和CD49b)的表达，这在GM-CSF刺激后CD34^ 造血干细胞的粘附作用中发挥重要作用。结论：在细胞因子/趋化因子微环境中，CXCR3-γIP-10和-Mig受体配体复合物及GM-CSF对CD34^ 造血干细胞分化成淋巴干细胞和髓系干细胞以及后来的免疫/炎症细胞的生理和病理过程起特别重要作用。这些过程包括CD34^ 造血干细胞的迁移、再定位、分化和成熟。     

单克隆抗体CD133在内皮祖细胞表达的实验研究

目的 研究CD133在内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）表面表达，为内皮祖细胞的鉴定提供依据。方法 取兔髂骨骨髓，经密度梯度离心法分离并培养骨髓间充质干细胞（mensenchymal stem cell，MSC），在血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子等诱导条件下定向向内皮祖细胞分化，流式细胞仪检测不同时间内皮祖细胞CD133表达。结果 定向诱导分化细胞形态学呈现“鹅卵石”样或“铺路石”样外观，流式细胞仪检测发现细胞表达CD133，并随时间推移表达逐渐下降。结论 内皮祖细胞高表达CD133与培养时间密切相关。     

脐带源间充质干细胞的分离和生物学性状

目的建立从脐带分离间充质干细胞的方法,并研究其生物学性状。方法脐带经酶消化后于DMEMLG/F12培养基中培养,倒置显微镜及电镜观察细胞形态学,细胞计数绘制细胞生长曲线,计数成纤维细胞集落形成单位(CFUF),流式细胞仪测定细胞周期及细胞免疫表型,免疫组织化学染色及RTPCR检测其体外诱导成脂肪和成骨分化的能力,RTPCR检测其细胞因子的分泌,与脐血来源CD34+细胞共同培养检测其支持造血的能力。结果经酶消化后,每cm脐带可得到中位数为1.01×106的有核细胞,CFUF产率为1/1609有核细胞,经贴壁传代可分离出成纤维样细胞,细胞倍增时间为(28.02±10.53)h。流式细胞仪分析细胞周期显示,>80%的细胞处于G0/G1期,S+G2+M期的细胞仅占(13.04±4.31)%。免疫表型分析显示,CD13、CD29、CD44、CD105(SH2)、CD73(SH3)、CD166和MHCI阳性,CD45、CD34、CD38、CD31和MHCⅡ阴性。体外诱导实验证实,该细胞具有成脂肪和成骨分化的能力。RTPCR显示,该细胞表达干细胞因子、血小板生成素,酪氨酸激酶受体配基、白细胞介素6、巨噬细胞集落刺激因子、白血病抑制因子、基质细胞衍生因子和血管内皮细胞生长因子,不表达白细胞介素3。与脐血来源CD34+细胞共同培养2周可见鹅卵石形成区,共培养8周证实其支持长期造血能力。结论建立从脐带中分离间充质干细胞的方法,脐带是间充质干细胞的新的来源。