调节性T细胞获得及其免疫抑制作用的实验研究

目的:制备诱导性调节性T淋巴细胞（iTreg）,探讨iTreg的免疫抑制功能及其作用机制研究。方法:免疫磁珠分选获取CD4⁺CD25^-T淋巴细胞,TGF-β诱导法获取iTreg,流式细胞术和实时定量PCR方法检测iTreg的得率及其叉头状/翅膀状螺旋转录因子（Foxp3）mRNA水平,活性染料羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）染色和流式细胞术方法观察Treg细胞对CD4⁺T淋巴细胞体外增殖能力的影响。利用ELISA和流式细胞术方法分别检测iTreg的白细胞介素-10（IL-10）、TGF-β分泌,以及胞内因子IL-2、IL-4、IL-17、干扰素-g（IFN-g）水平。结果:TGF-β诱导法iTreg得率可达42.10% ,TGF-β诱导后获得的iTreg Foxp3 mRNA水平明显升高。获得的iTreg可以抑制自体CD4⁺T淋巴细胞增殖,IL-10和TGF-β分泌水平较原始CD4⁺ T细胞上升（P<0.05）,但几乎不分泌IL-2、IL-4、IL-17、IFN-g。结论:利用TGF-β诱导法制备获得的iTreg具有明显的免疫抑制功能,其发挥免疫抑制功能过程可能均有IL-10和TGF-β的参与。     

外周血Th17与Treg细胞失衡与儿童EB病毒感染的相关性

【摘要】目的 探讨外周血辅助性T细胞（Th17）与调节性T细胞（Treg）失衡与儿童EB病毒（EBV）感染的相关性。方法 选取2019年12月～2020年5月秦皇岛市第一医院儿科收治的EBV感染患儿58例为EBV感染组,另选择同期本院健康体检儿童50例为对照组。采集空腹静脉血,检测并比较两组外周血Th17、Treg细胞表达率、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA相对表达水平及细胞相关特征性细胞因子白介素17（IL-17）、转化生长因子-β1（TGF-β1）水平。结果 EBV感染组患儿外周血Th17细胞表达率明显高于对照组,Treg细胞表达率和Treg/Th17细胞比率明显低于对照组（P＜0.05）;EBV感染组患儿RORγt mRNA表达率明显高于对照组,Foxp3 mRNA表达率明显低于对照组（P＜0.05）;EBV感染组患儿IL-17水平明显高于对照组,TGF-β1水平明显低于对照组（P＜0.05）。结论 EBV感染患儿的发病与Th17、Treg细胞失衡及其相关特征性细胞因子水平的变化密切相关。     

参苓白术散对胃癌Ⅳ期患者外周血CD4+CD25+Tregs的影响

目的 探讨参苓白术散对胃癌Ⅳ期患者外周血CD4+CD25+Tregs、Foxp3 mRNA及血清细胞因子IL-10、TGF-[β1的影响.方法 将40例胃癌Ⅳ期患者随机分为观察组、对照组各20例.对照组予对症支持治疗,观察组对症支持治疗同时予参苓白术散治疗,治疗4 w后观察两组患者外周血CD4+CD25+Tregs、单核细胞Foxp3 mRNA及血清IL-10、TGF-β1浓度的变化.结果 治疗后观察组患者外周血CD4+CD25+Tregs、单核细胞Foxp3 mRNA及血清IL-10、TGF-β1浓度均显著降低(P＜0.05),对照组治疗后各项指标无明显变化(P＞0.05),两组治疗后比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 参苓白术散能降低胃癌Ⅳ期患者外周血CD4+CD25+Tregs和单核细胞Foxp3 mRNA的表达,降低抑制性细胞因子IL-10、TGF-[β1浓度,具有免疫调节作用.     

细粒棘球蚴感染患者中负性分子Tim-3与TGF-β/Smads的表达特点

目的研究细粒棘球蚴感染患者中T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(Tim-3)与转化生长因子-β(TGF-β)/Smads通路相关分子mRNA表达的变化特点,初步探讨其与Eg发生、发展的关系。方法用实时荧光定量PCR检测36例Eg感染患者(CE组)和40例健康对照者(HC组)外周血中Tim-3、TGF-β、Smad3、Smad7、Foxp3 mRNA的表达,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测CE组和HC组血清中白细胞介素-10(IL-10)的水平。结果与HC组相比,CE组Tim-3、Foxp3 mRNA水平显著升高,血清IL-10水平显著升高,差异均有统计学意义(P0.05)。CE组TGF-β、Smad3 mRNA水平显著升高(P0.05),而Smad7 mRNA水平却显著降低(P0.05)。相关分析显示Tim-3与Foxp3、IL-10、Smad3均呈正相关(r=0.539、0.361、0.677,P=0.001、0.030、0.000),与Smad7呈负相关(r=-0.446,P=0.006)。结论 Eg感染过程中Tim-3诱导负性调控机制可能与TGF-β/Smads通路共同影响Treg细胞转录因子Foxp3和IL-10的产生而发挥作用。     

复方参鹿颗粒调节相对低危骨髓增生异常综合征患者TGF-β1介导的Treg/Th17细胞变化的临床研究

目的探讨复方参鹿颗粒对相对低危MDS患者治疗前后外周血TGF-β1、IL-2、IL-6、Treg细胞、Th17细胞、相关转录因子及比值的影响。方法将40例相对低危MDS患者随机分成中药组和对照组，中药组予复方参鹿颗粒联合西药治疗，对照组单用西药治疗。2组均6个月为1个疗程，共治疗1个疗程，观察外周血TGF-β1、IL-2、IL-6、Treg细胞、Th17细胞、相关转录因子及比值变化。结果治疗后中药组TGF-β1、IL-2表达上升，IL-6表达下降；TGF-β1、IL-2/IL-6比率均高于对照组，IL-6表达低于对照组，均有明显差异（P<0.05）。Treg细胞表达、Treg/Th17比值均高于对照组，具有统计学意义（P<0.05）。治疗后中药组Foxp3mRNA表达、Foxp3/RoRγt比值检测均高于对照组，有明显差异（P<0.05）。结论复方参鹿颗粒可以改善相对低危MDS患者TGF-β1、IL-6、IL-2/IL-6比率、Treg细胞、Treg/Th17比率。提示复方参鹿颗粒改善相对低危MDS患者的造血功能可能通过调整TGF-β1、IL-2/IL-6来调控Treg/Th17比率，进一步改善T细胞免疫功能有关。     

从Th17和CD4+CD25+Foxp3+T细胞功能变化探讨肺结核的耐药机制

目的 分析耐药肺结核患者外周血Th17细胞与CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例及细胞因子的变化,从免疫学角度探讨其耐药机制。 方法 分别选取33例耐药肺结核(耐药组)、49例普通肺结核(普通组)及51例健康志愿者(对照组)展开对比研究。检测Th17细胞与CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例;采用RT-PCR检测其特异性转录因子RORγt与Foxp3的mRNA表达水平;采用ELISA实验检测IL-17A、IL-17F、TGF-β1及IL-10的血清水平。 结果 普通组Th17细胞比例和RORγt mRNA表达水平低于对照组,耐药组低于普通组;普通组CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例和Foxp3 mRNA表达水平高于对照组,耐药组高于普通组;普通组Th17/CD4+CD25+Foxp3+T和RORγt/Foxp3低于对照组,耐药组低于普通组(P＜0.05)。普通组IL-17A、IL-17F水平低于对照组,耐药组低于普通组;普通组TGF-β1、IL-10水平高于对照组,耐药组高于普通组;其组间差异均有统计学意义(P＜0.05)。 结论 Th17/CD4+CD25+Foxp3+T平衡向CD4+CD25+Foxp3+T偏移、免疫系统功能抑制,可能是结核病慢性化和产生耐药的重要机制之一。      

CD4+ CD25+调节性T细胞在铜绿假单胞菌慢性肺部感染中的变化及其意义

目的 探讨CD4 CD25 调节性T细胞(CD4 CD25 Treg细胞)在铜绿假单胞菌(PA)慢性肺部感染中的变化及意义.方法 60只雄性SD大鼠随机分为PA感染组和空白对照组.将PA包被的硅胶管置人大鼠一侧主支气管建立慢性肺部感染模型,对照组置入无菌硅胶管.28 d后,荧光激活细胞分类(FACS)检测外周血CD4 CD25 Treg细胞数量,ELISA检测血清白细胞介素-10(IL-10)和转化生长因子-β(TGF-β)水平,RT-PCR检测脾脏Foxp3 mRNA表达,肺组织行HE染色观察组织病理学变化.结果 PA感染组Treg/CD4 T淋巴细胞的百分比明显高于对照组[(19.79±6.45)%比(5.15±0.47)%,P＜0.05].PA感染组血清IL-10和TGF-β水平均显著高于对照组[IL-10:(231.52±54.48)pg/mL比(35.43±23.56)pg/mL,P＜0.05;TGF-β:(121.05±7.98)pg/mL比(36.02±8.94)pg/mL,P＜0.05].PA感染组Foxp3 mRNA相对含量较对照组显著升高[(0.80±0.044)比(0.25±0.054),P＜0.05].HE染色见PA感染组肺组织有大量淋巴细胞聚集,纤维增生明显,脓肿形成.结论 CD4 CD25 Treg细胞在PA慢性肺部感染时数量增多、功能增强,对感染慢性化形成有重要影响.     

细胞衰老诱导的抑制性细胞因子累积对DLBCL细胞功能的影响

目的 探讨细胞衰老在弥漫大B细胞淋巴瘤(DL-BCL)细胞抵抗化疗中的作用及机制.方法 将入组的DL-BCL患者分为初诊(ND)组、完全缓解(CR)组、复发/难治(r/r)组.分别应用HE染色和β-半乳糖苷酶染色法检测淋巴结反应性增生患者、r/r DLBCL患者淋巴结组织衰老情况;用β-半乳糖苷酶染色法检测ND、r/r组DLBCL患者外周血中的衰老情况;用10、20、40 nmol/L的阿霉素(DOX)反复诱导DLBCL细胞株LY8衰老,构建衰老模型;CCK-8法检测衰老模型细胞增殖情况;流式细胞术检测衰老模型细胞凋亡情况;ELISA法检测DLBCL患者血清和衰老模型上清液中细胞因子表达.结果 r/r组DLBCL患者淋巴结组织及外周血中的衰老细胞明显增多且血清中白细胞介素(IL)-6、IL-8、IL-10、IL-35、转化生长因子-β1(TGF-β1)等促炎性和免疫抑制性细胞因子分泌增加;使用40 nmol/L DOX成功诱导LY8细胞衰老,衰老细胞比例24.77％.对对照组及DOX诱导组进行功能检测,结果提示衰老组细胞增殖率低于对照组但高于10 nmol/L和20 nmol/L DOX组(P＜0.05);凋亡率高于对照组但低于10 nmol/L和20 nmol/L DOX组(P＜0.05).同时,各组IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、TGF-β1分泌量差异有统计学意义(P＜0.05),与对照组比较,衰老组细胞上清液中IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-35、TGF-β1等各种促炎和免疫抑制性细胞因子分泌增加.结论 细胞衰老通过诱导抑制性细胞因子累积促进DLBCL细胞凋亡抵抗.     

耐受型DC/TGF-β联合诱导的iTreg细胞能有效抑制自身免疫性关节炎

目的 初步探讨通过成熟耐受型DC(mtDC)与转化生长因子-β(TGF-β)联合诱导的诱导型调节性T细胞(iTreg细胞)对自身免疫性关节炎的抑制作用.方法 在体外,对CD4+CD25-T细胞进行TGF-β诱导和mtDC细胞扩增,获得iTregmtDC细胞.通过流式细胞术、细胞计数、CBA等方法检测iTregmtDC细胞的表型、对CD4+T效应细胞增殖的抑制作用.在体内实验中,iTregmtDC细胞以1×106个细胞/ml的剂量过继性输注入胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠体内,并通过关节病变评分、病理组织病变评分、血清中细胞因子、总anti-CⅡIgG的分泌情况来评价iTregmtDC细胞对CIA的抑制作用.结果 在体外,通过TGF-β 和mtDC细胞两轮诱导/扩增后,TregmtDC细胞得以大量扩增,并能持续表达高水平的Foxp3.在体外,与iTreg细胞相比,TregmtDC细胞有更强的抑制效应T细胞增殖的能力.在体内,与iTreg细胞相比,TregmtDC细胞的过继性输注能更有效地减少发病关节处的炎性浸润,进一步改善CIA的症状;对CIA小鼠体内细胞因子的分泌有更强的调节能力,能更显著地减少炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-17(IL-17)的分泌,并促进大量TGF-β产生;更明显地降低总anti-CⅡIgG的分泌量;进而更有效地抑制CIA病程的发展.结论 与iTreg相比,iTregmtDC细胞能通过调节体内细胞因子和抗CⅡIgG的分泌更有效地抑制CIA病程发展.     

吡格列酮对肾小管上皮细胞转分化及CTGF表达的影响

目的 探讨吡格列酮能否负性调节转化生长因子β(TGF-β)诱导的肾小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞(TEMT),以及抑制TGF-β下游介质结缔组织生长因子(CTGF)表达,以阐明吡格列酮抗肾纤维化的作用及机制.方法 将体外培养的正常大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)分为空白对照组、TGF-β3 ng/mL诱导组、TGF-β3 ng/mL+DMSO组、不同剂量吡格列酮阻断组.应用倒置相差显微镜观察细胞形态,免疫组织化学、RT-PCR方法 定性及定量检测肌成纤维细胞特异性标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA);RT-PCR方法 定量检测CTGFmRNA的表达;ELISA法测定培养细胞上清液中Ⅲ型胶原的含量.结果 ①TGF-β诱导组细胞从原来典型的上皮细胞形态转变为长梭形肌成纤维细胞形态;免疫组织化学染色见大量α-SMA阳性细胞,与对照组相比,α-SMAmRNA表达量增加(P＜0.05);CTGF mRNA表达量增加(P＜0.05);细胞培养上清液中Ⅲ型胶原的含量增加(P＜0.05).②吡格列酮阻断组明显抑制TGF-β诱导的NRK52E细胞形态学改变;各剂量组均能抑制TGF-β诱导的α-SMA mRNA、CTGF mRNA表达及Ⅲ型胶原分泌(P＜0.05),且呈剂量依赖(P＜0.05);③相关分析显示,CTGF mRNA与α-SMA mRNA、Ⅲ型胶原的分泌呈正相关(r=0.975,0.988,P均＜0.01).α-SMA mRNA与Ⅲ型胶原的分泌呈正相关(r=0.952,P＜0.01).结论 吡格列酮能够抑制TGF-β诱导的TEMT及Ⅲ型胶原的分泌,对肾间质纤维化具有负性调节作用;吡格列酮抑制TGF-β诱导的CTGF表达可能是其负性调节TEMT的机制之一.     

前列腺素E2对CD4+CD25+调节性T细胞免疫功能影响的实验研究

目的 探讨前列腺素E2对CD4+CD25+调节性T细胞免疫功能的影响。 方法 分离正常BALB/c小鼠脾脏CD4+CD25+ Treg,利用固相包被抗CD3和加入可溶性CD28辅助活化,予以PGE2刺激。根据刺激剂量不同,分成对照组、A (7 μmol/L)、B (14 μmol/L)、C (28 μmol/L)组,观察PGE2对Treg的增殖、IL-10、IL-2分泌和Foxp3表达的影响。 结果 PGE2刺激12 h,3组细胞较对照组增殖反应差异均无统计学意义(P＞0.05);B、C组IL-2表达显著降低(P＜0.05),而Foxp3表达明显升高(P＜0.05);C组IL-10分泌升高(P＜0.05);刺激24 h,B、C组细胞增殖反应较对照组显著增强(P＜0.05);A、B、C组IL-2分泌均下降(P＜0.05),而Foxp3表达均升高(P＜0.05);C组IL-10分泌升高(P＜0.05);刺激72 h,3组增殖反应、IL-10以及Foxp3表达均显著升高(P＜0.05),而IL-2分泌下降(P＜0.05)。 结论 PGE2能直接增强CD4+CD25+ Treg的免疫抑制功能,从而可能进一步对效应T细胞免疫功能产生影响。      

TGF-β1对肾小管上皮细胞炎症相关趋化因子表达的影响

目的 观察转化生长因子β1(TGF-β1)对肾小管上皮细胞炎症相关趋化因子表达的影响,探讨其在肾间质炎症进展中的作用.方法 体外培养人近端肾小管上皮细胞系(HK-2),用不同浓度(0～10 ng/mL)TGF-β1刺激24 h或用5 ng/mL TGF-β1刺激不同时间(0～48 h),荧光定量PCR技术和ELISA方法分别检测趋化因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白介素-8(IL-8)、正常T细胞活化后表达和分泌调节蛋白(RANTES)的mRNA和蛋白表达的变化.结果 TGF-β1能诱导HK-2细胞MCP-1、IL-8、RANTES的表达上调,且呈剂量和时间依赖效应.2 ng/mL TGF-β1作用24 h即可诱导MCP-1和IL-8 mRNA明显升高,5 ng/mLTGF-β1作用时达高峰.MCP-1和IL-8蛋白分泌分别于刺激后36 h和24 h达高峰.2 ng/mL和5 ng/mL TGF-β1均可诱导RANTES mRNA明显升高,2 h时RANTES mRNA表达开始升高,24 h达高峰;RANTES蛋白基础分泌水平极低,TGF-β1作用24 h时RANTES蛋白分泌开始升高,36 h达高峰.结论 TGF-β1诱导能明显上调趋化因子MCP-1、IL-8和RANTES的mRNA表达和蛋白分泌.因此,有效干预TGF-β1诱导的趋化因子的表达可能成为减轻肾间质炎症的途径之一.     

黄芪对腹膜间皮细胞致纤维化细胞生长因子分泌与表达的影响

目的：了解黄芪注射液对体外培养的人腹膜间皮细胞转化生长因子-β1（TGF-β1）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）分泌及其mRNA表达的影响.方法：取择期手术患者的网膜间皮细胞进行体外培养传代,第三代细胞用于实验,待细胞同步后分为五组（对照组、腹膜透析组、黄芪1组、2组和3组）观察.单四唑（MTI）法检测各组间皮细胞的增殖活性.用ELISA法检测细胞上清液中TGF-β1和bFGF的含量,并进行比较.采用逆转录多聚酶链式反应（RT-PCR）法检测两种细胞因子mRNA表达情况并进行比较.结果：腹膜间皮细胞在PDS干预下还原能力明显下降,A值显著低于对照组和黄芪组（P＜0.05）;分泌TGF-β1和bFGF明显增加,与对照组比较,P＜0.05.腹膜间皮细胞经含不同浓度黄芪注射液的PDS干预后,TGF-β1和bFGF分泌与PDS组比较显著下降（P＜0.05）,黄芪2组和3组显著低于黄芪1组（P＜0.05）,黄芪3组和2组间比较无显著差异（P＞0.05）.腹膜间皮细胞在PDS干预下TGF-β1和bFGF mRNA表达明显升高,分别比对照组上升62.43%和37.68%.黄芪组TGF-β1和bFGF mRNA表达显著低于PDS组（P＜0.05）;黄芪2组和3组表达显著低于黄芪1组（P＜0.05）,黄芪3组和2组间比较无显著差异.结论：黄芪注射液具有抑制PDS导致的腹膜间皮细胞TGF-β1和bFGF过度分泌和表达的作用.     

动脉粥样硬化患者NLRP3炎性体分子表达及临床意义

目的研究动脉粥样硬化患者含热蛋白结构域3的核苷酸结合寡聚化样受体（NLRP3）炎性体相关分子表达与疾病之间的关系。方法采用酶联免疫吸附（ELISA）法测定40例动脉粥样硬化患者（实验组）和40例健康志愿者（对照组）血浆中IL-1β、IL-18和IL-37的含量,采用定量聚合酶链反应（PCR）检测两组单核细胞来源的巨噬细胞（MDM）表达NLPR3、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和IL-1βmRNA水平,采用ELISA技术检测胆固醇结晶诱导MDM分泌IL-1β和TNF-琢的水平。结果动脉粥样硬化患者血浆中的IL-1β和IL-18含量均显著高于对照组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）;IL-37高于对照组,但无统计学差异（P＞0.05）;动脉粥样硬化患者MDM中NLPR3、ASC和IL-1βmRNA表达均显著高于对照组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）;且经胆固醇结晶刺激后IL-1β、TNF-琢的分泌水平显著高于对照组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论NLRP3炎性体活化可能参与动脉粥样硬化的炎症反应过程。     

悬浮红细胞对CD4+CD25+Treg细胞分化的影响

目的 体外观察悬浮红细胞对异体T淋巴细胞向CD4+ CD25+ Treg细胞分化的影响.方法 采用Ficoll密度梯度离心法和免疫磁珠法从人外周血中分离纯化出CD3+T淋巴细胞,给予CD3/CD28抗体刺激,并分别与异体非去白悬浮红细胞或去白悬浮红细胞混合培养72 h.采用流式细胞仪检测各组培养体系中CD4+ CD25+Treg细胞的比例.采用实时荧光定量PCR检测各组Foxp3 mRNA的表达情况.采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测各组细胞上清中促炎细胞因子[白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)和干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)]和抗炎细胞因子[白细胞介素10(interleukin-10,IL-40)和转化生长因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)]的水平.结果 与阴性对照组(细胞培养液组)比较,非去白悬浮红细胞和去白悬浮红细胞组CD4+ CD25+ Treg细胞比例明显增加,功能基因Foxp3 mRNA表达也明显增高;1L-2和IFN-γ促炎细胞因子分泌减少,IL-10和TGF-β抗炎细胞因子分泌增多(P＜0.01).而与去白悬浮红细胞比较,非去白悬浮红细胞作用更加明显(P＜0.05).结论 悬浮红细胞可能通过调节促炎/抗炎细胞因子平衡诱导异体T淋巴细胞向CD4+ CD25+ Treg分化,而悬浮红细胞内残留的白细胞可能在其中起了关键作用.     

泼尼松对白细胞介素-17/白细胞介素-23炎症轴调节作用的分子机制

目的 探讨泼尼松对IL-23/IL-17炎症轴的影响.方法 分离昆明小鼠脾脏淋巴细胞制成单细胞悬液,MTT法检测不同浓度(0、0.001、0.01、0.1、1、10、100、1 000 μm)泼尼松对小鼠脾淋巴细胞增殖功能的影响.另取小鼠脾淋巴细胞分为4组,A组用空白完全培养液培养、B组用含0.001 μm泼尼松的培养液培养24 h后用含有转化生长因子-β1 (TGF-β1)、白介素-6(IL-6)、白介素-23(IL-23)培养液继续培养48 h;C、D组用含TGF-β1、IL-6、IL-23培养液培养48 h后,C组改用含0.001 μm泼尼松的培养液、D组改用空白培养液继续培养24h.收集各组细胞培养上清液,采用酶联免疫吸附法检测IL-17a含量;采用实时荧光定量反转录PCR检测IL-17 mRNA、IL-23 mRNA的表达水平.结果 0.001 μm泼尼松对小鼠脾淋巴细胞的增殖即有抑制作用(P＜0.05).B组IL-17含量低于A、C、D组(P＜0.05),C组IL-17含量低于A组、D组(P＜0.05).A、B两组IL-23 mRNA表达量比较,差异无统计学差异意义(P＞0.05),C组IL-23 mRNA表达量低于D组(P＜0.05).结论 泼尼松能够抑制淋巴细胞的增殖,当机体免疫系统失衡促炎因子高表达时,泼尼松能够抑制IL-17分泌,抑制IL-17 mRNA、IL-23 mRNA的表达而发挥免疫抑制作用.     

SLE患者CD4+CD25-T细胞来源的体外诱导型Treg细胞IL-10表达特征的初步研究

目的：探讨白细胞介素（interleukin,IL-10）在系统性红斑狼疮（systemic lupus ergthematosu,SLE）患者体外诱导型调节性T细胞 （induced regulatory T cell,iTreg）中表达的变化。方法：分离健康对照和SLE患者外周血单个核细胞,并进一步分离出CD4+CD25-T细胞,将其在体外以TGF-β诱导转化;用流式细胞术分析诱导转化后T细胞中CD25+和CD25-、Foxp3+和Foxp3-细胞亚群胞内IL-10（introcellular IL-10,iIL-10）和细胞膜表面IL-10（membrane IL-10,mIL-10）的表达。结果：①SLE患者和正常人经诱导转化的CD4+亚群细胞内CD25+T细胞表达iIL-10均明显增高,且患者显著高于正常人;②同样,患者和正常人诱导后CD4+亚群细胞内CD25+T细胞表达mIL-10均明显增高,但患者与正常人表达水平相似;③SLE患者和正常人经诱导转化形成的CD4+CD25+亚群细胞内Foxp3+T细胞表达iIL-10亦均明显增高,且患者显著高于正常人;④SLE患者和正常人经诱导转化形成的CD4+CD25+亚群细胞内Foxp3+T细胞表达mIL-10也明显增高,但患者和正常人类似;⑤SLE患者以上各项改变均与SLE疾病活动性指数无相关性。结论：正常人经诱导转化形成的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞与IL-10表达密切相关。SLE患者诱导转化后形成的iTreg细胞以及未转化的CD4+CD25-T细胞内表达iIL-10的水平均显著高于正常人;但是细胞膜上的mIL-10表达与正常人没有差异。     

TGF-β1对肾小管上皮细胞炎症相关趋化因子表达的影响

目的观察转化生长因子β1(TGF-β1)对肾小管上皮细胞炎症相关趋化因子表达的影响,探讨其在肾间质炎症进展中的作用。方法体外培养人近端肾小管上皮细胞系(HK-2),用不同浓度(0~10 ng/mL)TGF-β1刺激24 h或用5 ng/mL TGF-β1刺激不同时间(0~48 h),荧光定量PCR技术和ELISA方法分别检测趋化因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白介素-8(IL-8)、正常T细胞活化后表达和分泌调节蛋白(RANTES)的mRNA和蛋白表达的变化。结果TGF-β1能诱导HK-2细胞MCP-1、IL-8、RANTES的表达上调,且呈剂量和时间依赖效应。2 ng/mL TGF-β1作用24 h即可诱导MCP-1和IL-8 mRNA明显升高,5 ng/mLTGF-β1作用时达高峰。MCP-1和IL-8蛋白分泌分别于刺激后36 h和24 h达高峰。2 ng/mL和5 ng/mL TGF-β1均可诱导RANTES mRNA明显升高,2 h时RANTES mRNA表达开始升高,24 h达高峰;RANTES蛋白基础分泌水平极低,TGF-β1作用24 h时RANTES蛋白分泌开始升高,36 h达高峰。结论TGF-β1诱导能明显上调趋化因子MCP-1、IL-8和RANTES的mRNA表达和蛋白分泌。因此,有效干预TGF-β1诱导的趋化因子的表达可能成为减轻肾间质炎症的途径之一。     

阻断Kupffer细胞TIM-4诱导iTreg细胞的产生影响小鼠肝移植免疫耐受

目的 探讨阻断Kupffer细胞(Kupffer cells,KCs)T细胞免疫球蛋白黏蛋白4(T-cell immunoglobulin and mucin-domain-containing molecule 4,TIM-4)诱导小鼠原位肝移植术后iTreg细胞的产生及其相关机制.方法 建立小鼠原位肝移植急性排斥反应模型,分为sham组、control mAb组、TIM-4 mAb组.流式细胞仪检测KCs活化,Western blot检测肝脏TIM-4表达,TUNEL检测肝细胞凋亡指数(apoptotic index,AI).提取KCs,激光共聚焦检测KCs TIM-4表达,将KCs和提取的初始CD4+T细胞进行共培养,激光共聚焦检测Kupffer细胞TIM-4表达,分为control组、control mAb组以及TIM-4 mAb组;CFSE检测CD4+T细胞增殖,流式细胞仪检测CD4+ CD25+ Foxp3+T细胞,ELISA检测IL-4、IL-6、IL-13水平,Western blot检测STAT6表达.建立小鼠移植模型,分为3组:iTreg组移植模型注入iTreg细胞(预先用TIM-4 mAb处理的TIM-4+ KCs与初始CD4+T细胞共培养所诱导),sham组和单纯肝移植组(LT)注入相应的PBS作为对照,检测各组AST、ALT、TBIL水平,HE染色评价肝组织排斥活动指数(rejective activity index,RAI),观察小鼠生存率.结果 肝移植术后24、48、72 h KCs的活化分别为15.9％、21.6％、28.3％,术后1、3、7 dTIM-4蛋白表达水平明显高于sham组(P＜0.05);control mAb组AI值(29.23 ±2.56)明显高于sham组和TIM-4 mAb组[(0.40±0.49),(11.04 ±2.28),P＜0.05].KCs与CD4+T细胞共培养后,control、control mAb以及TIM-4 mAb组CD4+T细胞的增殖率分另别为32.5％、31.6％、17.2％,CD4+ CD25+ Foxp3+T细胞分化分别为12.4％、13.9％、28.1％,共培养上清液TIM-4 mAb组IL-4、IL-6、IL-13分泌水平明显低于control mAb (P＜0.05),且加入TIM-4 mAb明显降低了与TIM-4+ KCs共培养的CD4+T细胞p-STAT6蛋白表达(P＜0.05),外源性加入IL-4可明显增高CD4+T细胞p-STAT6蛋白的表达(P＜0.05).移植模型注入iTreg细胞,iTregz组肝功指标明显好转,与LT组比较差异有统计学意义(P＜0.05).肝组织病理学检查,iTreg组RAI平均得分为(3.97±0.67),明显低于LT组[(8.47±0.90),P＜0.05],且iTreg组小鼠平均存活时间延长.结论 阻断KCs TIM-4能够抑制初始CD4+T细胞IL-4/STAT6信号通路的激活,从而诱导更多iTreg细胞的生成,致使宿主对移植物产生免疫耐受.