鹿茸多肽对兔骨髓间质干细胞体外软骨表型诱导分化的影响

目的:通过对体外培养的兔骨髓间质干细胞(MSCs)在特定培养液作用下向软骨细胞表型分化的研究,探讨鹿茸多肽对其软骨分化的影响。方法:将第3代兔MSCs随机分为A组(空白对照组)、B组(诱导组)、C组(鹿茸多肽组),并取兔的关节软骨作为D组(关节软骨组)。A、B、C 3组分别采用普通培养液、诱导培养液、含10 ug/m l鹿茸多肽的诱导培养液于离心管内进行培养,分别于1、2、3周后取材,通过组织学、生物化学和RT-PCR技术,对离心管内构建的软骨组织进行形态学和细胞功能状态的观察。结果:A组培养2周后,细胞团块逐渐崩解,无法进行HE染色。B、C组细胞团块除有轻度收缩外,呈白色半透明状,HE染色发现细胞为圆形或卵圆形,表层细胞密度大。B、C组糖胺多糖(GAG)含量及Ⅱ型胶原mRNA表达随培养时间延长而增多,并以C组为著;各时间点B、C组与A组相比明显增多,且差异有显著性统计学意义(P<0.01),C组与B组相比较多,差异有显著性统计学意义(P<0.01),C组与D组相比较少,差异有显著性统计学意义(P<0.01)。结论:MSCs在特定培养条件下能向软骨细胞表型分化,且鹿茸多肽对其定向软骨分化有明显促进作用。虽然在体外可以构建出软骨组织,但其与关节软骨质量相比仍有很大差距。     

TGF-β2体外诱导骨髓间充质干细胞表达软骨细胞表型的观察

目的：观察骨髓间充质干细胞（MSCs）在TGF-β2诱导下向软骨细胞表型转化的能力,探讨其作为软骨组织工程种子细胞的可能性。方法：抽取兔髂骨骨髓液3-4ml,进行原代和传代培养,传代后实验组以高糖DMEM无血清特定培养液诱导f含TGF-β2 10ng／ml、地塞米松10^-7M、维生素C50μmol／L）,对照组以高糖DMEM无血清培养液培养,相差显微镜下观察细胞形态变化,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达。结果：诱导后细胞体外扩增能力显著降低,细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形或类圆形转变,诱导21天后细胞形态变化最为显著,Ⅱ型胶原免疫组化染色深而均匀。结论：TGF-β2可有效诱导MSCs向软骨细胞表型转化,分泌软骨细胞特异性基质,有可能成为软骨组织工程较理想的种子细胞来源。     

不同浓度转化生长因子-β1对人骨髓间充质干细胞/海藻酸钠复合物体外软骨形成能力的影响

目的探讨人骨髓间充质干细胞（MSCS）体外定向分化为软骨样组织的可行性以及不同浓度TGF-β1对人MSCs／海藻酸钠复合物体外软骨形成能力的影响。方法将体外培养扩增的人骨髓间充质干细胞与海藻酸钠结合，制成MSCs／海藻酸钠复合物，诱导培养液中添加不同浓度TGF-β1，在培养的不同时间进行Ⅱ型胶原的免疫组织化学，原位杂交，蛋白多糖的特殊染色，以及蛋白多糖的定量检测。结果细胞在海藻酸钠中生长良好，可见细胞分裂增殖，形成同源细胞团。10μg／L诱导组Ⅱ型胶原表达阳性，基质中有红染的黏多糖物质的堆积，蛋白多糖定量检测均高于其他实验组（P〈0.05）。结论TGF-β1浓度过低不能诱导软骨形成，而浓度过高则不利于软骨形成，10μg／L是体外诱导软骨形成的适宜浓度。海藻酸钠是运载MSCs的理想载体和支架。     

细胞因子对关节软骨细胞增殖的实验研究

目的探讨细胞因子对关节软骨细胞增殖的影响。方法应用关节软骨细胞体外培养，分别加入IL-1β，TNF-α，TGF-β1，IL-1β和TGF-β1，TNF-β和TGF-β1，采用MTT法观察软骨细胞增殖情况，瑞氏染色观察细胞形态及分裂指数测定。结果细胞因子作用软骨细胞24h，与对照组比较，1ng／ml、10ng／ml TGF-1组，10ng／ml IL-1β和1ng／ml TGF-β1组，高于对照组。细胞因子作用软骨细胞48h，与对照组比较，20ng／ml IL-1β组，1ng／ml、10ng／ml TNF-α组，0．1、1、10ng／ml TGF-β1，10ng／ml IL-1β和1ng／ml TGF-β1组，1ng／ml TNF-α和1ng／ml TGF-β1组，高于对照组。IL-1β，TNF-α作用软骨细胞24h，形态发生改变。培养48h，分裂指数测定10ng／ml TGF-β1组显著高于对照组。结论TGF-岛对体外培养关节软骨细胞有明显促进细胞分裂与增殖作用，IL-1β，TNF-α，作用软骨细胞48h也有促进细胞增殖作用。     

TGF-β1基因转染对间充质干细胞生物学行为的影响

目的 探讨转化生长因子β1(TGF-β1)基因转染对间充质干细胞(MSCs)增殖、向成软骨方向定向分化等生物学行为的调控作用及其机制。方法 体外将具有促进MSCs增殖分化及抑制多种炎性介质活性等多重生物学效应的TGF-β1基因以不同剂量转入MSCs，通过免疫组化、R3T-PCR、水貂肺上皮细胞生长抑制法、^3H-TdR、Na2^35SO4掺入法、流式细胞仪Ⅱ型胶原原位杂交及透射电镜等系列方法检测TGF-β1基因转染的瞬时和稳定表达情况，分析TGF-β1基因转染对MSCs增殖和向成软骨方向定向分化的调控及其作用机制.结果 TGF-β1基因转人MSCs能获得瞬时及稳定表述．表达产物具有生物活性；3μl脂质体介导1μg TGF-β1基因转染能获得最佳促MSCs增殖及蛋白多糖，Ⅱ型胶原合成效应；TGF-β1基因转染能显著抑制IL-1对羟脯氨酸合成的降解作用，结论 MSCs能作为基因治疗的受体细胞并可稳定高效表达具有生物学活性的TGF-β1；通过增强增殖细胞核抗原表达来提高S期细胞DNA含量，促进软骨特异性细胞外基质合成,从而促进MSCs增殖并调控其向成软骨方向定向分化、抑制多种炎性介质生物学活性以保护关节软骨．使提高关节软骨缺损的修复质量成为可能．     

一氧化氮诱导腰椎软骨终板退变的实验研究

目的探讨一氧化氮（nitricoxide，NO）诱导腰椎软骨终板退变的机制。方法取长枫杂种猪腰椎间盘软骨终板细胞，于含20％胎牛血清的DMEM中培养，建立体外软骨终板细胞培养模型，以光镜及苏木精-伊红染色观察其生物学表现，Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色对软骨终板细胞进行鉴定，以外源性NO-硝普钠（sodium nitroprusside，SNP）2mmol／l处理软骨终板细胞、^35S掺入法和^3H-脯氨酸掺入法检测蛋白多糖及胶原的合成，放射性免疫测定法测炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的生成，碘化丙啶荧光染色及DNA片段电泳观察软骨终板细胞凋亡。结果原代细胞生物学性状最接近体内细胞，多次传代后细胞呈现衰老现象，经免疫细胞化学染色证实此细胞具有Ⅱ型胶原表达。施加SNP后，软骨终板细胞蛋白多糖及胶原合成明显减少（P〈0．01），炎性细胞因子含量明显升高（P〈0．01），细胞凋亡率显著增高（P〈0．01）。结论NO抑制软骨终板细胞蛋白多糖及胶原合成，促进炎性细胞因子及细胞凋亡增加，从而促进软骨终板退变。     

转化生长因子-β1和血清对人骨髓基质干细胞增殖及向软骨细胞诱导分化的影响

目的探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)和不同浓度胎牛血清对体外培养人骨髓基质干细胞(BMSCs)增殖及向软骨细胞诱导分化的作用,为软骨组织工程提供有用的种子细胞。方法分别采集3例志愿者骨髓各6mL,用Percoll细胞分离液分离,收集单个核细胞,在含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液中培养扩增。将第3代细胞分为3组:A组为对照组,B组为含5%胎牛血清的诱导培养基组,C组为含10%胎牛血清的诱导培养基组。倒置显微镜下观察细胞生长状况,免疫组化检测Ⅱ型胶原分泌,原位杂交检测Ⅱ型胶原mRNA表达,3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入实验检测细胞的增殖情况。结果经密度梯度离心后,活细胞比例在96%以上。贴壁后的细胞形态均一,由梭形向多角形转变。B组细胞在诱导培养7d后Ⅱ型胶原免疫组化均为阳性,原位杂交可检测到Ⅱ型胶原mRNA的表达,而A、C两组分别为阴性和弱阳性。三组细胞3H-TdR摄入量的大小顺序为C>B>A。结论密度梯度离心法是一种高效、可大量获取人BMSCs的方法,细胞在体外生长稳定;低浓度的胎牛血清和10ng/mL的TGF-β1联合作用既可促进人BMSCs的增殖,又可诱导其向软骨细胞方向分化,而高浓度胎牛血清仅对细胞的增殖有促进作用。     

血管内皮生长因子对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的影响

[目的]探讨外源性血管内皮生长因子（VEGF）对人骨髓来源间充质干细胞（MSCs）增殖、向成软骨方向定向分化等生物学行为的影响及其机理，为MSCs构建组织工程化软骨奠定基础．[方法]取人骨髓来源间充质干细胞体外培养，将传代后的细胞分别置于含有800ng／ml和1600ng／ml VEGF的诱导培养基中进行培养，将具有促进细胞增殖分化及抑制多种炎性介质活性等多重生物学效应的TGF-β1以10ng／ml浓度配置无血清培养基诱导同组MSCs作阳性对照，观察细胞的增殖，分化。用Ⅱ型胶原免疫组化染色评价不同诱导因素下的软骨基质合成情况。[结果]所有细胞显示了良好的增殖能力，暴露于外源性血管内皮生长因子下的MSCs保持了良好的生长活性，并开始向软骨表型分化，与未添加诱导因子组细胞相比差异有显著性意义，不同浓度VEGF组的细胞合成软骨基质的能力无差异，但均不如阳性对照组。[结论]外源性VEGF具有诱导体外培养的人MSCs向软骨表型分化的能力，但与TGF-β1的诱导能力相比有差距。提示VEGF在MSCs来源的软骨修复过程中充当诱导信息提供者的角色。     

转IL-1Ra和TGF-β1基因治疗兔骨性关节炎的体外实验研究

目的 探讨重组人IL-1Ra和TGF-β1双基因在体外对兔骨性关节炎软骨退变的治疗效果.方法 取新西兰大白兔关节软骨,经消化分离,软骨细胞以1.5×105/ml浓度培养于6孔培养板.软骨细胞分为5组,转染IL-1Ra组、转染TGF-β1组、转染IL-1Ra＋TGF-β1双基因组、未转染组、空白组.上述转染组均以LipofectamineTM 2000 Reagent脂质体为转染媒介.各组加入软骨块,除空白组外,其余各组均加入20 ng IL-1β.于第6天后每组各取4孔1.5 ml培养基,ELISA法检测TGF-β1和IL-1Ra的含量,RIA法检测IL-1β和TNF-α的含量.收集软骨块做HE染色、阿尔新蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化检测等组织学观察.结果 转染组IL-1Ra或TGF-β1有较高的表达水平;转染组IL-1β和TNF-α的表达水平降低,在双基因组降低最明显,与单基因组之间有显著性差异（P〈0.05）.转基因组基质染色均比未转染组着色较深.在双基因组软骨细胞排列尚整齐,细胞数量多,基质深染.结论 联合基因治疗效果优于单基因,为体外骨性关节炎的基因治疗提供实验基础.     

转化生长因子-β2体外诱导骨髓间充质干细胞表达软骨细胞表型的观察

目的观察骨髓间充质干细胞(MSCs)在转化生长因子(TGF-β2)诱导下向软骨细胞表型转化的能力,探讨其作为软骨组织工程种子细胞的可能性。方法抽取兔髂骨骨髓液3～4ml,进行原代和传代培养,传代后实验组以高糖DMEM无血清特定培养液诱导,培养液含TGF-β210ng/ml、地塞米松10-7mol/L、维生素C50μmol/L;对照组以高糖DMEM无血清培养液培养,相差显微镜下观察细胞形态变化,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达。结果诱导后细胞体外扩增能力显著降低,细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形或类圆形转变,诱导21d后细胞形态变化最为显著,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色深而均匀。结论TGF-β2可有效诱导MSCs向软骨细胞表型转化,分泌软骨细胞特异性基质,有可能成为软骨组织工程较理想的种子细胞来源。     

兔自体细胞-载体复合物修复关节软骨缺损的实验研究

目的 研究兔MSCs向软骨细胞方向诱导后复合自体双相骨基质明胶(bone matrix gelatin,BMG)对膝关节软骨缺损的修复作用.方法 健康成年新西兰大白兔24只,雌雄不限,体重2～3 kg,随机分为A、B、C组,每组8只.取A组骨髓行原代培养,胰酶消化按12比例传至第5代,倒置相差显微镜观察细胞形态.取1、3、5代细胞绘制生长曲线.于第3代MSCs生长密集时加入TGF-a1 10 ng/mL、IGF-1 10 ng/mL、维生素C 50 ng/mL诱导8 d后倒置相差显微镜下观察,爬片行免疫组织化学及Mallory染色.取A组髂骨按Urist方法 制备双相BMG,将第3代经诱导8 d得到的种子细胞以5 X 106/mL密度接种于自体BMG制备细胞.载体复合物,体外培养3 d后扫描电镜观察.制作膝关节软骨直径3 mm,深3 mm的缺损模型,A组植入自体细胞.载体复合物,B组植入自体BMG,C组不作处理,第8、12周取材行大体观察、HE染色、免疫组织化学染色观察,Wakitani法组织学评分.结果 倒置相差显微镜观察MSCs原代细胞呈短梭形;传代细胞呈长梭形.传代细胞1～3 d增殖缓慢,3 d后增殖旺盛,7～8 d进入平台期,第3代增殖最为旺盛.诱导后MSCs细胞呈椭圆形,Ⅱ型胶原、S-100免疫组织化学染色阳性,Mallory染色胞浆蓝染.细胞-载体复合物扫描电镜观察BMG结构符合细胞载体要求,细胞种植于BMG后生长良好.动物实验大体观察A组术后8、12周缺损处均由透明软骨样组织修复,8周较12周表面稍凹陷;B、C组术后8、12周均为纤维样组织修复,表面凹凸不平.组织学观察HE染色A组术后8、12周修复组织与周围软骨组织结合良好,以圆形、椭圆形透明软骨样细胞为主,12周较8周细胞数多且大B、C组均为纤维样组织修复,12周较8周纤维样组织增厚.Ⅱ型胶原免疫组织化学染色A组术后8周呈阳性、12周呈强阳性;B、C组均无表达.Wakitani评分术后8周A、B、C组分别为(3.50±1.51)、(10.00±1.41)、(12.00±0.93)分,术后12周分别为(1.13±0.99)、(8.38±1.30)、(10.13±1.64)分,A组优于B、C组,B组优于C组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 自体MSCs向软骨细胞方向诱导后,复合自体BMG对关节软骨缺损有较好的修复作用.     

Interleukin-1 beta stimulates human mesangial cells to synthesize and release interleukins-6 and -8.

Interleukin-1 beta (IL-1 beta) and tumor necrosis factor (TNF) have been reported to stimulate human mesangial cells (HMC) to proliferate and synthesize eicosanoids. We have examined whether they also induce HMC to release cytokines. In this study we show that both IL-1 and TNF stimulate HMC to release IL-6 and IL-8. Cycling and quiescent HMC were stimulated with various concentrations of either recombinant IL-1 beta or TNF for 1 to 24 hours. IL-1 beta at doses as low as 6 pg/ml stimulated mesangial cells to synthesize mRNA for both IL-6 and IL-8 as assessed by Northern analysis; mRNA for tubulin remained constant, which demonstrated a specific increase in mRNA. Secretion of IL-6 and IL-8 into the culture medium increased (4.5 to 18 ng/ml and 4 to 40 ng/ml, respectively) measured by ELISAs. TNF had similar effects but only in high concentrations (greater than 100 ng/ml). IL-1 beta did not stimulate cells to proliferate, as measured by 3H thymidine incorporation. TNF caused proliferation but only in concentrations over 100 ng/ml. We conclude that IL-1 beta is a potent stimulator of human mesangial cell production of IL-6 and IL-8, both of which may influence injury in nephritis. TNF also stimulates mesangial cells but only in pharmacological doses.     

骨髓基质细胞与关节软骨细胞生物学特性的比较研究

目的观察兔骨髓基质细胞(MSCs)诱导和基因修饰后的主要生物学特性,并与关节软骨细胞进行比较. 方法抽取成年雄性新西兰大白兔髂骨骨髓,密度梯度离心获得骨髓基质细胞,培养传至第5代,按处理方法分为常规培养液组(A组)、条件培养液组(B组)及重组缺陷型腺病毒携带肝细胞生长因子cDNA转染组(C组).条件培养液为常规培养液中含转化生长因子-β1(10 ng/ml)、碱性成纤维细胞生长因子(25 ng/ml)和地塞米松(10-7 mol/L).切取兔膝关节软骨,3 mg/ml Ⅱ型胶原酶消化传代培养至第3代(D组).观察原代MSCs及第5代MSCs(体外培养8～10周后)细胞形态,对第5代MSCs及第3代软骨细胞进行Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,MTT法检测细胞增殖情况.阿利新蓝法检测细胞培养上清液中糖胺多糖(GAG)含量.提取各组培养细胞总RNA,RT-PCR检测Ⅰ、Ⅱ型胶原表达. 结果原代MSCs为短梭形、簇状生长,传代细胞呈长梭形、旋涡样生长.A组细胞爬片Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阴性,GAG含量低,与D组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).B组细胞爬片Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性,GAG含量升高,与D组比较差异无统计学意义(P＞0.05);C组转染后第4天增殖率降低,与A组比较差异有统计学意义(P＜0.05),其余时间点各组间无统计学意义(P＞0.05).RT-PCR表明A、B、C组均表达Ⅰ型胶原,B、D组可表达Ⅱ型胶原,C组有较弱的Ⅱ型胶原表达. 结论 MSCs体外培养过程中自然转归趋向于成骨.传代后经向成软骨方向诱导,具有向软骨分化的能力;体外传代培养的MSCs具有干细胞自我增殖和定向分化的特性,可作为靶细胞接受外源目的基因转染并能有效表达.     

重组人骨形成蛋白2与骨诱导剂对大鼠骨髓间充质干细胞增殖分化的影响

目的观察重组人骨形成蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein2,rhBMP-2)与骨诱导剂对SD大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的增殖与成骨作用。方法体外培养大鼠MSCs,分为实验组与对照组。对照组:不加rhBMP-2与骨诱导剂。实验组:骨诱导剂单独作用于SD大鼠MSCs(A组);rhBMP-2分别以浓度为10(B组)、50(C组)、100(D组)、200μg/L(E组)单独作用于SD大鼠MSCs;rhBMP-2分别以浓度为10(F组)、50(G组)、100(H组)、200μg/L(I组)联合骨诱导剂作用于SD大鼠MSCs。测定第3、6、9、12天的增殖状况(MTT法)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性和骨钙素(osteocalcin,OC)水平。结果倒置相差显微镜观察SD大鼠MSCs原代培养时,细胞接种12h后即可贴壁;48h细胞成梭形,形似成纤维细胞;4d时细胞为多角形、纺锤形;6d时,成纤维细胞散在分布,少量呈集落样生长,为漩涡状、放射状排列;10d左右,细胞基本铺满瓶底,融合成片。传代细胞5~7d即可长满瓶底。各时间点A~I组均能显著促进MSCs成骨活性(ALP和OC)的表达。B~E组同时具有促进MSCs增殖作用,并呈浓度依赖性;F~I组增殖及ALP、OC含量均高于A~E组,比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论rhBMP-2与骨诱导剂联合作用可在促进MSCs增殖的同时提高其成骨活性。     

增强型绿色荧光蛋白标记技术对骨折后骨髓间充质干细胞的迁移示踪

目的采用增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)标记技术,对外源性骨髓间充质干细胞(marrowmesenchymalstemcells,MSCs)迁移至骨折区域进行示踪,为骨修复中干细胞作用机制的研究创造条件。方法EGFP标记日本大耳白兔MSCs,部分标记细胞经成骨诱导培养后检测其细胞表型。另取日本大耳白兔18只制成双侧尺骨骨折模型,随机分为实验组与对照组,每组9只,分别于术前24h、术后1和24h,将扩增的标记MSCs和未标记MSCs以1×107个/kg剂量分别注入实验组和对照组的耳缘静脉;术后48h处死动物,取左侧尺骨断端组织行冰冻切片、荧光显微镜观察,右侧样本组织固定后行石蜡切片、HE染色、光镜观察。结果MSCs培养后分化及表型良好,标记MSCs仍具有较快的增殖能力,经成骨诱导培养后,可表达碱性磷酸酶,并具有钙结节形成能力;兔体内实验术后48h动物均存活,HE染色见骨折断端为血肿组织。术前24h、术后1和24h静脉注入标记细胞后均可在骨断端组织中观察到EGFP阳性细胞,而对照组则未见EGFP阳性细胞。结论兔MSCs经EGFP标记后仍然具有成骨细胞诱导能力;EGFP示踪技术提示,静脉途径给予标记的MSCs可以迁移聚集到骨折区域的血肿组织内。     

白细胞介素—1对培养的星形胶质细胞表达神经生长因子的影响

目的；研究星形胶质细胞对神经生长因子（NGF）的表达及白细胞介素－1a(IL-1a)与白细胞介素－1β（IL-1β）对星形胶质细胞表达NGF的影响。方法：取新生SD大鼠大脑皮质，纯化培养星形胶质细胞，设空白组，对照组和实验组三组，实验组中分别加入25，50和100U/ml的IL－1a或IL－1β，分别培养24，48及72小时，取培养上清液，用间接酶联免疫吸附法测定星形胶质细胞培养上清液中的NGF分泌量。结果：传代培养的星形胶质细胞能够分泌NGF，不同浓度的IL－1a及IL－1β作用不同时间后均不同程度地促进星形胶质细胞分泌NGF，其效应IL－1β较IL－1α为强，且单位时间内的效应以50U/ml组作用24小时最强，结论：星形胶质细胞自身能够表达NGF，而IL－1α及IL－1β可不同程度地促进星形胶质细胞对NGF的表达。     

骨髓间质干细胞向软骨细胞表型定向诱导分化的实验研究

目的 研究体外培养的猪骨髓间质干细胞（Bone Marrow Stem Cells,MSCs)在特定培养液作用下向软骨细胞表型转化，探讨其作为组织工程化软骨的种子细胞的可行性。方法 取成年崇明长枫杂交猪髂骨骨髓5ml，在低糖DMEM完全培养液培养2周，传代后以高糖DMEM无血清特定培养液诱导（含胰岛素2mg/L、转铁蛋白3mg/L、丙酮酸100mg/L、地塞米松10^-7mol/L、TGF－β1 10ng/ml)，在相关显微镜和电镜下进行观察，免疫组化检测Ⅱ型胶原分泌，原位杂交检测Ⅱ型胶原mRNA表达。结果 细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形转变，透视电镜观察见大量扩张粗面内质网、高尔基体、线粒体。诱导培养后第7，14dⅡ型胶原免疫组化阳性，同时原位杂交检测Ⅱ型胶原mRNA表达呈阳性。结论 MSCs在特定培养液诱导下能向软骨细胞表型转化，并能分泌软膏特异性基质，有可能成为软骨组织工程较理想的种子细胞来源的应用前景。     

Effect of parathyroid hormone-related protein in an in vitro hypertrophy model for mesenchymal stem cell chondrogenesis

Purpose

Mesenchymal stem cells (MSCs) express markers of hypertrophic chondrocytes during chondrogenic differentiation. We tested the suitability of parathyroid hormone-related protein (PTHrP), a regulator of chondrocyte hypertrophy in embryonic cartilage development, for the suppression of hypertrophy in an in vitro hypertrophy model of chondrifying MSCs.

Methods

Chondrogenesis was induced in human MSCs in pellet culture for two weeks and for an additional two weeks cultures were either maintained in standard chondrogenic medium or transferred to a hypertrophy-enhancing medium. PTHrP(1–40) was added to the medium throughout the culture period at concentrations from 1 to 1,000 pM. Pellets were harvested on days one, 14 and 28 for biochemical and histological analysis.

Results

Hypertrophic medium clearly enhanced the hypertrophic phenotype, with increased cell size, and strong alkaline phosphatase (ALP) and type X collagen staining. In chondrogenic medium, 1–100 pM PTHrP(1–40) did not inhibit chondrogenic differentiation, whereas 1,000 pM PTHrP(1–40) significantly reduced chondrogenesis. ALP activity was dose-dependently reduced by PTHrP(1–40) at 10–1,000 pM in chondrogenic conditions. Under hypertrophy-enhancing conditions, PTHrP(1–40) did not inhibit the induction of the hypertrophy. At the highest concentration (1,000 pM) in the hypertrophic group, aggregates were partially dedifferentiated and differentiated areas of these aggregates maintained their hypertrophic appearance.

Conclusions

PTHrP(1–40) treatment dose-dependently reduced ALP expression in MSC pellets cultured under standard chondrogenic conditions and is thus beneficial for the maintenance of the chondrogenic phenotype in this medium condition. When cultured under hypertrophy-enhancing conditions, PTHrP(1–40) could not diminish the induced enhancement of hypertrophy in the MSC pellets.