伤寒沙门菌fljB∷lacZ变异株的制备

目的：为研究伤寒沙门菌z66鞭毛抗原编码基因fliB的表达调节机制，建立该fljB基因的β-半乳糖苷酶基因（1acZ）插入变异株。方法：采用自杀质粒介导的同源重组方法进行制备。设计加接茚nI和SalI的特异性引物，用PCR扩增获得舻基因的上、下游同源性DNA片段，并与用Kpn I和Sal I酶切pSV-β-半乳糖苷酶载体（pSV-β-galactosidase vector）的片段定向连接，将连接片段克隆至自杀质粒pGMBl51，再通过电击法将重组质粒转入伤寒沙门菌，在含X-Gal的蔗糖平板上筛选获得同源重组的变异株。结果：经筛选获得阳性克隆，经PCR及序列分析证实,fljB基因中的763bp被3550bp的lacZ片段替代。结论：成功构建伤寒沙门菌flj∷lacZ突变株，为进一步研究fljB基因表达调节机制奠定了基础。     

伤寒沙门菌fljB::lacZ变异株的制备

目的：为研究伤寒沙门菌z66鞭毛抗原编码基因fliB的表达调节机制，建立该fljB基因的β-半乳糖苷酶基因（1acZ）插入变异株。方法：采用自杀质粒介导的同源重组方法进行制备。设计加接茚nI和SalI的特异性引物，用PCR扩增获得舻基因的上、下游同源性DNA片段，并与用Kpn I和Sal I酶切pSV-β-半乳糖苷酶载体（pSV-β-galactosidase vector）的片段定向连接，将连接片段克隆至自杀质粒pGMBl51，再通过电击法将重组质粒转入伤寒沙门菌，在含X-Gal的蔗糖平板上筛选获得同源重组的变异株。结果：经筛选获得阳性克隆，经PCR及序列分析证实,fljB基因中的763bp被3550bp的lacZ片段替代。结论：成功构建伤寒沙门菌flj∷lacZ突变株，为进一步研究fljB基因表达调节机制奠定了基础。     

伤寒沙门菌fljA样基因缺陷变异株的制备

目的：为探讨z66鞭毛抗原阳性伤寒沙门菌的fljA样基因的功能,制备沙门菌fljA样基因缺陷变异株。方法：根据伤寒沙门菌fljA样基因序列,设计PCR特异性引物并在5末端加接酶BglII位点,扩增fljA样基因上、下游片段,用BglII消化后,定向连接成fljA样基因的缺损性同源性核苷酸片段,先克隆至pGEM—T质粒,再经BnmHI酶切后导入自杀质粒pGMB151,电转化入伤寒沙门菌(GIFU 10007),进行同源重组。用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为fljA样基因的缺陷变异株,并通过相应的核苷酸序列分析加以确定。结果：PCR及序列分析证实,缺陷变异株的fljA样基因缺失231个碱基。结论：成功构建伤寒沙门菌flja样基因缺陷变异株,为进一步研究其在伤寒沙门菌鞭毛抗原表达的调控作用奠定了基础。     

伤寒沙门菌phoP基因缺陷变异株的制备

目的:为深入研究伤寒沙门菌调节因子phoP的功能,制备伤寒沙门菌phoP基因缺陷变异株.方法:根据伤寒沙门菌phoP基因序列,设计PCR特异性引物,并在5′末端加接酶Bgl Ⅱ位点,PCR扩增phoP基因上、下游片段后,用Bgl Ⅱ消化,再定向连接成phoP基因的缺损性同源性核苷酸片段.将此片段胶回收后并导入自杀质粒pGMB151的BamH Ⅰ位点,将阳性质粒用电转化导入伤寒沙门菌野生株,进行同源重组.用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为phoP基因的缺陷变异株,并通过相应的核苷酸序列分析加以确定.结果:PCR及序列分析证实,缺陷变异株的phoP基因缺失297个碱基.结论:成功构建伤寒沙门菌phoP基因缺陷变异株,为进一步研究其在伤寒沙门菌中的功能奠定了基础.     

鼠伤寒沙门菌spvC基因缺陷变异株的制备

目的: 为进一步研究鼠伤寒沙门菌毒力基因spvC的功能,制备鼠伤寒沙门菌spvC基因缺陷变异株。方法: 根据鼠伤寒沙门菌spvC基因序列,设计PCR特异性引物,制备spvC基因缺陷性同源性核苷酸片段,导入自杀质粒pCVD442后再导入鼠伤寒沙门菌野生株,进行同源重组,用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为spvC基因的缺陷变异株,并通过核苷酸序列分析加以确定。结果： PCR及序列分析证实,缺陷变异株的spvC基因缺失711个碱基。结论： 成功构建鼠伤寒沙门菌spvC基因缺陷变异株,为进一步研究其在鼠伤寒沙门菌中的功能奠定了基础。     

德氏乳杆菌保加利亚亚种β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的非融合表达

目的在大肠杆菌中非融合表达德氏乳杆菌保加利亚亚种β-半乳糖苷酶,为构建能高效表达β-半乳糖苷酶的食品级益生菌株奠定基础。方法选择德氏乳杆菌保加利亚亚种(1.1480和wch9901)β-半乳糖苷酶基因(lacZ)起始密码ATG上游-18bp到ATG下游1bp的一段包含SD位点和ATGA位点的序列为上游引物,PCR扩增lacZ,插入表达质粒pMG36e构建重组表达质粒。转化大肠杆菌,筛选阳性克隆,提取重组质粒进行酶切鉴定和测序,并测定转化菌β-半乳糖苷酶活性。结果重组质粒酶切鉴定合格;其中插入的外源片段序列与德氏乳杆菌保加利亚亚种lacZ标准序列符合率达99%以上;携带重组质粒pMG36e-lacZ1.1480的大肠杆菌DH5α酶活性为3.074U/mL,酶比活性为6.939U/mgpro;携带重组质粒pMG36e-lacZwch9901的大肠杆菌DH5α酶活性为4.755U/mL,酶比活性为8.537U/mgpro。结论成功在大肠杆菌中非融合表达了德氏乳杆菌保加利亚亚种β-半乳糖苷酶;本研究选择的SD位点和ATGA位点能在大肠杆菌中有效地引导蛋白的非融合表达。     

伤寒沙门菌rpoE基因缺陷变异株的制备及其生存能力

目的为深入研究rpoE基因在伤寒沙门菌侵袭致病中的作用,制备rpoE基因缺陷变异株;观察rpoE基因缺陷变异株在应激条件下的生存能力。方法根据伤寒沙门菌rpoE基因序列,设计PCR特异性引物,制备rpoE基因缺陷性同源性核苷酸片段导入自杀质粒PGMB151后再导入伤寒沙门菌野生株,进行同源重组,用PCR观察重组现象;绘制生长曲线,对比rpoE基因缺陷变异株与野生株在应激条件下的生存情况。结果PCR及序列分析证实,缺陷变异株的rpoE基因缺失288个碱基;生长曲线提示rpoE基因缺陷变异株在氧、酸、高渗应激条件下生存能力明显低于野生株,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论成功构建了伤寒沙门菌rpoE基因缺陷株,并发现在氧、酸、高渗应激条件下其生存能力明显降低,为进一步研究其在伤寒沙门菌中的功能奠定了基础。     

SsrB对伤寒沙门菌氧应激早期基因表达的调节

目的:研究伤寒沙门菌ssrB基因在氧应激早期对其他基因表达的调节.方法:通过同源重组的方法利用自杀质粒制备伤寒沙门菌ssrB基因缺陷变异株;采用伤寒沙门菌全基因组芯片比较野生株和ssrB基因缺陷变异株在氧应激早期的基因表达差异,并对其中部分表达差异基因进行实时定量PCR验证;利用HeLa细胞进行细菌侵袭实验,研究ssr...     

Hfq对伤寒沙门菌高渗应激早期基因表达的调节

目的：探查伤寒沙门菌hfq基因在高渗应激早期对其他基因表达的影响。方法：用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株;利用伤寒沙门菌全基因组芯片技术,比较伤寒沙门菌野生株和咆向基因缺陷变异株在高渗应激早期的基因表达谱差异,并选择部分表达差异基因进行实时定量PCR验证。结果：伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株制备成功;基因表达谱比较分析结果表明伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株在高渗应激早期有62个基因表达上调,有32个基因表达下调。实时定量PCR结果与芯片分析一致。结论：Hfq作为一个调节因子在伤寒沙门菌高渗应激早期对基因表达起重要调节作用。     

OsmY缺失对伤寒沙门菌在高渗应激早期基因表达的影响

目的:研究伤寒沙门菌OsmY在高渗应激早期对其他基因表达的调节。方法:通过同源重组的方法利用自杀质粒制备伤寒沙门菌osmY基因缺陷变异株;采用伤寒沙门菌全基因组芯片比较野生株和osmY基因缺陷变异株在高渗应激早期的基因表达差异,并对其中部分表达差异基因进行实时定量PCR验证。结果:成功制备伤寒沙门菌osmY基因缺陷变异株;基因芯片结果显示,在高渗应激早期,与野生株相比,伤寒沙门菌osmY基因缺陷变异株有128个基因表达下调,有27个基因表达上调。实时定量PCR与芯片结果一致。结论:OsmY可作为一调节因子在伤寒沙门菌高渗应激早期对基因表达起重要调节作用。     

弓形虫依钙蛋白激酶Calpain—like基因的克隆及表达

目的克隆弓形虫RH株Calpain-like基因片段,构建原核表达载体,诱导表达Calpain-like基因重组蛋白。方法收集、纯化弓形虫RH株速殖子,提取总RNA,在设计合成的引物中引入SalⅠ和EcoRⅠ酶切位点。应用RT-PCR扩增弓形虫RH株Calpain-like基因片段,插入pGEM-T载体,提取重组质粒,双酶切获得目的基因,亚克隆到原核表达质粒pET32a,重组子经双酶切、PCR和DNA序列分析鉴定,转化大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达。结果从弓形虫RH株速殖子cDNA中扩增出316bp的Calpain-like基因片段;含pET32a/Calpain-like的重组质粒在宿主菌经诱导后,获得与预期分子量相符的表达产物。结论成功地克隆和表达弓形虫RH株Calpain-like基因,弓形虫Calpain-like基因的克隆表达为进一步筛选弓形虫疫苗候选分子和治疗药物的靶位提供了研究基础。     

PmrA对伤寒沙门菌高渗应激后期基因表达调节初探

目的:探讨伤寒沙门菌调节因子PmrA在高渗应激后期对基因表达调节的影响.方法:应用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株;利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术,比较伤寒沙门菌野生株和pmrA基因缺陷变异株在高渗应激后期的基因表达谱差异,并选择部分差异表达基因进行RT-RCR验证.结果:经PCR及序列分析证实,伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株制备成功;基因表达谱比较分析结果表明伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株在高渗应激后期有81个基因表达上调,有22 个基因表达下调.结论:PmrA在伤寒沙门菌高渗应激后期的基因表达调节中发挥重要作用.     

Fis对伤寒沙门菌基因表达的系统调节作用

目的：探讨伤寒沙门菌调节因子fis对基因表达的系统调节作用。方法：用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌fis基因缺陷变异株,用脉冲场凝胶电泳分析fis缺陷变异株的基因组结构。利用伤寒沙门菌全基因组DNA芯片分析技术,比较伤寒沙门菌野生株和fis基因缺陷变异株的基因表达谱差异。用重组载体pBADfis回补fis缺陷变异株,选择部分差异表达基因进行qRT—PCR验证,用半固体平板培养观察野生株、fis缺陷变异株和回补株的动力。结果：fis基因缺陷变异株含有二相鞭毛素编码基因的线性质粒缺失,且动力消失;基因表达谱比较分析结果表明,伤寒沙门菌fis基因缺陷变异株在对数生长期94个基因出现表达差异;qRT—PCR分析所选基因表达的结果与芯片分析结果相符;fis缺陷变异株在回补fis基因后,动力及差异表达基因都获得明显恢复。结论：Fis在伤寒沙门菌中对动力、侵袭及多种代谢相关基因的表达发挥重要调节作用。     

登革2型病毒全长NS1基因真核表达载体的构建及序列分析

目的克隆登革2型病毒(DEN2)全长NS1基因，构建NS1基因的真核表达重组质粒。方法用RT—PCR技术扩增DEN2(NGC株)全长的NSl基因序列，并定向克隆入pPICZαB的KpnⅠ／XbalⅠ位点，构建真核表达载体pPICZαB—NS1，转化E.coli DH5a菌。阳性重组质粒用PCR、酶切及序列测定等方法鉴定。结果阳性质粒经PCR及KpnⅠ／XbaⅠ双酶切获得了一个核苷酸长度为1134bp的基因；序列测定证实该基因与DEN2(NGC株AF038403)NS1基因序列有99％同源。结论成功构建了含有DEN2全长NS1基因的真核表达载体DPICZαB—NS1，为NS1的进一步酵母表达奠定了良好的基础。     

H:z66抗体应激后伤寒沙门菌fliG基因缺陷株与野生株基因表达的差异

目的:观察伤寒沙门菌鞭毛转子蛋白基因fliG在H:z66抗体应激后对其他基因表达的影响。方法:利用自杀质粒介导的同源重组法制备伤寒沙门菌fliG基因缺陷变异株;利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术,比较伤寒沙门菌野生株和fliG基因缺陷变异株在H:z66抗体应激后的基因表达谱差异,并选择部分表达有差异的基因进行实时定量PCR验证。结果:经PCR验证及序列比对,伤寒沙门菌fliG基因缺陷变异株制备成功;基因表达谱比较结果表明,与野生株相比,伤寒沙门菌fliG基因缺陷变异株在H:z66抗体应激后有21个基因表达上调,7个基因表达下调;实时定量PCR结果与芯片结果一致。结论:fliG基因在伤寒沙门菌受到H:z66抗体刺激后的基因表达调控中发挥一定作用。     

伤寒沙门菌核糖核酸酶 G对胞内非编码RNA T3956水平的影响

目的: 研究伤寒沙门菌核糖核酸酶G（RNase G）对非编码RNA（ncRNA）T3956胞内水平的影响。方法: 利用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌RNase G基因（rng）缺陷变异株;利用重组质粒pBAD将rng导入rng缺陷变异株,构建rng缺陷回补株;通过实时定量PCR分别比较伤寒沙门菌野生株、rng缺陷变异株、回补株等在不同生长时期的ncRNA T3956水平。结果: 成功制备伤寒沙门菌rng缺陷变异株、rng缺陷回补株和空质粒对照株; 实时定量PCR结果表明,rng缺陷株中T3956的胞内水平较野生株有所升高,并且在对数中期和稳态期升高得更加明显,而回补株胞内T3956的水平又得到恢复。结论: 伤寒沙门菌RNase G能够参与对胞内ncRNA T3956水平的调控,并且在细菌对数生长中期和稳态期作用更为明显。     

应用AdEasy-1腺病毒系统构建含人nm23-H1基因的重组腺病毒质粒

目的应用AdEasy-1腺病毒载体系统制备含人nm23-H1基因的重组腺病毒载体。方法设计带有限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ双酶切位点的引物,利用PCR法从质粒pMD18-T-nm23-H1上克隆出nm23-H1 cDNA并定向连接至穿梭载体pShuttle-CMV上,行KpnⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定和测序。将pAdEasy-1腺病毒骨架载体电转化B J5183感受态细菌,Pm eⅠ酶线性化并去磷酸化处理重组质粒pShuttle-CMV-nm23-H1,并电转化含pAdEasy-1的B J5183感受态细菌,利用卡那霉素筛选,PacⅠ酶切鉴定,重组腺病毒质粒在XLGold-10感受态细菌中大量扩增,产物行PCR鉴定。结果经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切pShuttle-CMV-nm23质粒得到460bp的片段,该片段经测序与nm23-H1基因序列一致,重组腺病毒质粒pAdEasy-nm23-H1经PacⅠ酶切后可以得到3.0kb和4.5kb的片段,大量扩增重组腺病毒质粒后行PCR仍然得到460bp的片段。结论利用AdEasy-1腺病毒系统成功构建含人nm23-H1基因重组腺病毒质粒。     

人survivin基因重组腺病毒载体的构建及其在DCs中的表达

目的构建含有人survivin基因的重组腺病毒载体,为转染树突状细胞构建DC疫苗和基因治疗奠定基础.方法自行设计一对分别含有Kpn Ⅰ和Xhol Ⅰ酶切位点的survivin基因上下游引物,以质粒pCITE/survivin为模板,通过PCR扩增获得survivin基因全部序列.片段回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,获得重组质粒pAdTrack-CMV-survivin.通过Kpn Ⅰ和Xhol Ⅰ双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体pAdTrack-survivin转化包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183菌.同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒.同时将病毒上清转染树突状细胞,通过观察绿色荧光蛋白的表达以及Western blot分析观察survivin蛋白表达.结果成功构建了含有人survivin基因的重组腺病毒,病毒滴度为1.65×108PFU/ml.在19×103频段附近可见survivin蛋白表达为16.5×103.结论该重组腺病毒载体的构建及成功转染到树突状细胞内表达,为下一步研究人survivin作为靶抗原及基因治疗奠定了基础.     

mig-14对伤寒沙门菌在高渗应激早期基因表达的调节

目的:探查伤寒沙门菌mig-14在高渗应激下对若干基因表达的调节作用.方法:用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌mig-14基因缺陷变异株,用基因芯片分析高渗应激早期野生株和mig-14缺陷株基因表达差异,并对部分结果采用实时荧光定量PCR进行验证.结果:成功制备伤寒沙门菌mig-14缺陷株,高渗应激早期mig-14变异株与野生株相比有77个基因表达下调和72个基因表达上调. 结论:mig-14可能是一种调节基因,主要参与调节细菌的物质和能量代谢.