H:z66抗体应激后伤寒沙门菌fliG基因缺陷株与野生株基因表达的差异

目的:观察伤寒沙门菌鞭毛转子蛋白基因fliG在H:z66抗体应激后对其他基因表达的影响。方法:利用自杀质粒介导的同源重组法制备伤寒沙门菌fliG基因缺陷变异株;利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术,比较伤寒沙门菌野生株和fliG基因缺陷变异株在H:z66抗体应激后的基因表达谱差异,并选择部分表达有差异的基因进行实时定量PCR验证。结果:经PCR验证及序列比对,伤寒沙门菌fliG基因缺陷变异株制备成功;基因表达谱比较结果表明,与野生株相比,伤寒沙门菌fliG基因缺陷变异株在H:z66抗体应激后有21个基因表达上调,7个基因表达下调;实时定量PCR结果与芯片结果一致。结论:fliG基因在伤寒沙门菌受到H:z66抗体刺激后的基因表达调控中发挥一定作用。     

伤寒沙门菌OmpR缺陷变异株制备与分泌蛋白初析

目的观察伤寒沙门菌调节蛋白OmpR的调节作用，制备伤寒沙门菌OmpR缺陷变异株，并比较分析野生株和OmpR缺陷变异株在不同渗透压环境培养下的分泌蛋白。方法用自杀质粒pGMB151介导同源性重组方法制备伤寒沙门菌OmpR缺陷变异株，用PCR方法观察重组现象，变异株经测序和外膜蛋白的SDS—PAG电泳鉴定，用SDS—PAG电泳结合Western blot比较分析野生株和OmpR缺陷变异株在高、低渗透压环境培养下的SipC等分泌蛋白。结果成功制备伤寒沙门菌OmpR缺陷变异株，并发现变异株中，包括SipC、鞭毛素蛋白在内的多种蛋白的表达分泌有明显差异。结论伤寒沙门菌OmpR在不同的渗透压下分别影响SipC、鞭毛素蛋白等多种蛋白的表达分泌。     

葡萄糖脱氢酶连续监测法的研究

目的建立葡萄糖脱氢酶连续监测法,优化其检测条件。方法按酶连续监测法测定要求,对克隆的枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶表达酶液进行测定,确定反应体系的底物浓度、最适pH、反应温度、延滞时间、测定时间、检测范围等。结果以葡萄糖和NAD 为底物时,用连续监测法检测葡萄糖脱氢酶是可行的。当葡萄糖、NAD 的终浓度分别为100mmol/L和2mmol/L时,在反应pH74,37℃,延滞时间30s,测定时间60s等条件下,检测上限可达10000U/L。结论连续监测法能用于测定葡萄糖脱氢酶,快速简便,结果可靠。     

抗H：z66抗体诱导z66~＋伤寒沙门菌鞭毛相变换特点的探讨

目的探讨抗H∶z66抗体诱导z66＋伤寒沙门菌鞭毛相变换的特点。方法利用含抗H∶z66抗体的半固体培养基诱导z66＋伤寒沙门菌鞭毛发生相变换,通过提取z66＋伤寒沙门菌和其相变株的线性质粒,利用脉冲场凝胶电泳和核酸内切酶分析比较z66＋伤寒沙门菌鞭毛相变换前后线性质粒的结构,最后通过测定相变株的线性质粒全序列和Southern blot进一步揭示抗H∶z66抗体诱导z66＋伤寒沙门菌鞭毛相变换的特点。结果 z66＋伤寒沙门菌在抗H∶z66抗体的诱导下成功发生了鞭毛的单向相变换;这种单向相变换是由于伤寒沙门菌在抗体诱导下线性质粒缺失了含fljBA的2.6 kb末端区域所致,同时首次发现在鞭毛相变换后线性质粒结构反而变大,提示线性质粒可能形成了非共价结合的二聚体。结论该研究揭示了z66＋伤寒沙门菌鞭毛的相变换特点,为更深入地研究z66＋伤寒沙门菌奠定了基础。     

伤寒沙门菌基因组DNA芯片基因表达谱分析技术的建立与优化

目的: 建立和优化基于伤寒沙门菌全基因组DNA芯片的基因表达谱分析技术.方法: 提取伤寒沙门菌野生z66阳性菌株总RNA,以6,9核苷酸随机引物(N6、N9)和(或)基因组特异引物(GDP)反转录合成cDNA,用荧光素Cy5或Cy3直接掺入标记后,与包括伤寒沙门菌4201个蛋白编码基因的伤寒沙门菌全基因组芯片杂交,用芯片扫描仪扫描后获得表达谱分析结果,经过数据标准化处理后进行分析.结果: 采用N9+GDP混合引物,直接掺入法标记时,既能获得较好标记效果,又能节约试剂成本,同时可减少繁琐步骤所引起的不必要失误.结论: 建立的基于伤寒沙门菌基因组DNA芯片的基因表达谱分析技术,为细菌的基因表达调控及功能基因组学研究提供了平台.     

SsrB对伤寒沙门菌氧应激早期基因表达的调节

目的:研究伤寒沙门菌ssrB基因在氧应激早期对其他基因表达的调节.方法:通过同源重组的方法利用自杀质粒制备伤寒沙门菌ssrB基因缺陷变异株;采用伤寒沙门菌全基因组芯片比较野生株和ssrB基因缺陷变异株在氧应激早期的基因表达差异,并对其中部分表达差异基因进行实时定量PCR验证;利用HeLa细胞进行细菌侵袭实验,研究ssr...     

伤寒沙门菌fljB∶∶lacZ变异株的制备

目的:为研究伤寒沙门菌z66鞭毛抗原编码基因fljB的表达调节机制,建立该fljB基因的β-半乳糖苷酶基因(lacZ)插入变异株。方法:采用自杀质粒介导的同源重组方法进行制备。设计加接KpnⅠ和SalⅠ的特异性引物,用PCR扩增获得fljB基因的上、下游同源性DNA片段,并与用KpnⅠ和SalⅠ酶切pSV-β-半乳糖苷酶载体(pSV-β-galactosidase vector)的片段定向连接,将连接片段克隆至自杀质粒pGMB151,再通过电击法将重组质粒转入伤寒沙门菌,在含X-Gal的蔗糖平板上筛选获得同源重组的变异株。结果:经筛选获得阳性克隆,经PCR及序列分析证实,fljB基因中的763 bp被3550 bp的lacZ片段替代。结论:成功构建伤寒沙门菌flj∶∶lacZ突变株,为进一步研究fljB基因表达调节机制奠定了基础。     

临床生物化学与病例相结合的教学实践

对医学检验专业临床生物化学试验课教学进行改革,并组织实施了临床生物化学试验与病例讨论相结合的教学实践,激发了学生的学习兴趣,促进了其对试验内容的学习,提高临床思维能力和综合素质,表现出可持续发展的强大后劲.     

检测EV71和EV-U的TaqMan-LNA探针多重荧光RT-PCR的建立

目的 建立一种针对手足口病病原体的快速准确检测方法。 方法 利用TaqMan-LNA探针建立多重荧光定量RT-PCR方法,同时检测肠道病毒71型(EV71)和肠道病毒通用型(EV-U),用含有目的序列RNA的标准品制备标准曲线,对病毒进行准确定量,同时对该方法的特异性、灵敏度、重复性进行评估。结果 用TaqMan-LNA探针多重荧光RT-PCR法检测CoxA16、CoxB2、EV71病毒和其他人类病毒RNA,证实其特异性为100%;对EV71和EV-U的检测灵敏度均达到10^{2拷贝/μl;将EV71和EV-U的RNA标准品进行重复性实验,其批内、批间变异系数分别为0.97%～2.02%和0.89%～2.13%。 结论 本方法灵敏度较高,特异性强,重复性好,适用于手足口病的临床检测。}     

z66抗体诱导伤寒沙门菌鞭毛抗原表达转变后染色体结构分析

目的 分析z66抗体诱导z66抗原阳性伤寒沙门菌鞭毛抗原表达改变后染色体结构。方法 利用脉冲凝胶电泳（PFGE）结合XbaI消化，对伤寒沙门菌标准菌株Ty2，z66抗原阳性株GIFU10007及z66抗体诱变j抗原阳性株GIFU10007-j的染色体DNA进行比较分析。结果 GIFU10007-j染色体DNA有两个XbaI片段与GIFU10007不同，总体染色体减少约250kb；与Ty2相比，GIFU10007染色体DNA有13个相同及7个不同的XbaI片段，总体染色体大小接近。结论 z66抗体诱导伤寒沙门菌鞭毛抗原表达转变后的染色体DNA发生了局部结构缺损；伤寒沙门菌z66鞭毛抗原阳性及诱变阴性株与单相标准菌株Ty2间在染色体DNA结构上有明显差异。