沉默A549细胞中的CD46和DSG2可抑制人3型和7型腺病毒的侵入及IL-8的释放

目的 探讨沉默受体CD46、桥粒芯蛋白（DSG2）对人3型腺病毒（HAdV-3）和7型腺病毒（HAdV-7）的侵入及炎症因子释放的影响。方法 通过RNA干扰技术沉默A549细胞中CD46、DSG2的表达。实验分为HAdV-3组、HAdV-3+siRNA-NC组（siRNA无关序列对照组）、HAdV-3+siRNA-CD46组（转染siRNA-CD46）、HAdV-3+siRNA-DSG2组（转染siRNA-DSG2）;HAdV-7组、HAdV-7+siRNA-NC组（siRNA无关序列对照组）、HAdV-7+siRNA-CD46组（转染siRNA-CD46）、HAdV-7+siRNA-DSG2组（转染siRNA-DSG2）。HAdV-3、7感染A549细胞后0.5、2 h,通过激光共聚焦显微镜观察两种腺病毒与受体CD46、DSG2结合水平;体外转染siRNA-CD46、siRNA-DSG2后不同时间点,qRT-PCR技术检测HAdV-3、7拷贝数,ELISA检测转染后IL-8表达情况。结果 腺病毒感染A549细胞后0.5、2 h,HAdV-3、7与其受体CD46、DSG2结合共定位;腺病毒入胞后,随时间延长,病毒拷贝数增加,转染 siRNA-CD46 后 2、6、12、24 h,HAdV+siRNA-CD46 组的病毒拷贝数较 HAdV 组降低（HAdV-3+siRNA-CD46 vs HAdV-3：6 h,P<0.05;12、24 h,P<0.0001;2 h,降低趋势无统计学差异;HAdV-7+siRNA-CD46 vs HAdV-7：2 h, P<0.01;6 h,P<0.001;12、24 h,P<0.0001）。转染siRNA-DSG2后2、6、12、24 h,同样明显降低了病毒载量（HAdV-3+siRNA-DSG2 vs HAdV-3,HAdV-7+siRNA-DSG2 vs HAdV-7,P<0.0001）。HAdV-3、7 感染 A549 细胞后,炎症因子 IL-8 释放增多（P<0.0001）,沉默CD46和DSG2的表达后2、6 h,炎症因子IL-8水平降低（P<0.0001）。结论 HAdV-3、7与其受体CD46、DSG2结合后入胞,病毒拷贝数随时间延长而增加,沉默CD46、DSG2后,抑制HAdV-3、7型腺病毒的侵入及IL-8释放。     

呼肠孤病毒导致白血病细胞凋亡的分子机制研究

  目的  初步探讨溶瘤病毒呼肠孤病毒3型(Reovirus 3,Reo3)致白血病HL60细胞凋亡的分子机制。  方法  用不同感染复数(MOI)的Reo3感染HL60细胞, 设未感染的HL60细胞为对照组,病毒感染48 h后,通过CCK8法检测不同MOI的病毒对HL60细胞活性的影响;利用流式细胞术检测HL60细胞凋亡率;Western blot检测HL60细胞中双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)活化水平和凋亡相关蛋白表达情况。用PKR特异性抑制剂2-氨基嘌呤(2-AP)作用HL60细胞24 h后,Reo3感染HL60细胞48 h,检测细胞凋亡水平和凋亡相关蛋白表达水平。  结果  MOI为1的Reo3作用于HL60细胞48 h后对细胞的抑制作用明显,细胞存活率为(24.333±3.396)%,细胞凋亡率为(29.96±2.06)%,与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。Western blot结果显示:与对照组比较,感染Reo3的HL60细胞PKR、p-PKR、Bax、Caspase3、cleaved Caspase3蛋白表达均升高(P＜0.05),而Bcl-2蛋白表达水平下降(P＜0.05)。与未加抑制剂组比较,采用2-AP预处理的HL60细胞感染Reo3后细胞凋亡率下降(P＜0.05),PKR磷酸化水平和凋亡相关蛋白表达水平亦下降(P＜0.05)。  结论  溶瘤病毒Reo3作用HL60细胞可以引起PKR的活化,导致HL60细胞的凋亡。     

UBE2C基因沉默表达对人胃癌AGS细胞增殖和迁移的影响

  目的  探讨UBE2C基因沉默对人胃癌AGS细胞增殖和迁移能力的影响。  方法  将用RNA 干扰技术构建的UBE2C-shRNA表达载体转染到293T细胞，用含有病毒颗粒的上清感染人胃癌AGS细胞，经puromycin筛选获得稳定表达的AGS细胞株。实验分为UBE2C表达沉默人胃癌AGS细胞组（干扰组）和对照组。采用qRT-PCR验证人胃癌AGS细胞中UBE2C的mRNA 表达水平，随后利用实时无标记细胞分析仪（RTCA）检测UBE2C沉默对人胃癌AGS细胞的增殖和迁移情况；同时应用CCK-8 细胞增殖检测试剂盒进一步印证UBE2C表达水平对人胃癌AGS细胞增殖能力影响。  结果  干扰组中UBE2C mRNA 表达 水平与对照组相比明显降低，AGS细胞增殖和迁移能力显著下降（P < 0.01）。  结论  靶向沉默UBE2C基因表达能抑制人胃癌AGS细胞恶性生物学行为。     

安宁地区住院患儿呼吸道病原体七联检阳性检测结果分析

  目的  分析安宁地区住院患儿呼吸道感染病毒病原体阳性检测结果。  方法  选择2019年9月至2022年2月安宁地区住院患儿1 766例为研究对象,根据年龄分为 < 6月龄组、6月龄～4岁组、4～14岁组;根据新冠疫情防控,2019年9月至2020年2月前为公众防护前,2020年2月后公众防护后;采集所有患儿鼻咽拭子标本,采用直接免疫荧光法测定甲型流感病毒抗原、乙型流感病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、腺病毒抗原、副流感病毒Ⅰ型抗原、副流感病毒Ⅱ型抗原、副流感病毒Ⅲ型抗原7种呼吸道病原体,统计分析患儿呼吸道病原体检出情况。  结果  1 766例患儿呼吸道感染病毒病原学检出阳性584例,阳性率为33.07%,呼吸道病毒病原体中检出主要以呼吸道合胞病毒（316例/17.89%）、腺病毒（90例/5.10%）、副流感病毒Ⅲ型（82例/4.64%）为主;患儿呼吸道感染病毒病原体阳性主要集中在 < 6月龄组、6月龄～4岁组,检出阳性率分别为111例（34.69%）、327例（34.31%）,不同年龄段呼吸道感染病原体检测阳性率,差异有统计学意义（χ2 = 8.392,P = 0.031）;公众防护后甲型流感病毒检出阳性率0.29%低于公众防护前5.94%,差异有统计学意义（P < 0.05）;公众防护前后乙型流感病毒抗原、腺病毒抗原、副流感病毒Ⅰ型、副流感病毒Ⅱ型、副流感病毒Ⅱ型检出率差异无统计学意义（P > 0.05）。  结论  安宁地区住院患儿呼吸道感染病毒病原学检出率较高,呼吸道合胞病毒是主要病原体,公众防护后甲型流感病毒检出阳性率明显下降,故继续做好公众防护对防范甲型流感亦有重要意义。     

金黄色葡萄球菌诱导小肠上皮细胞炎性反应及凋亡作用的观察

目的观察研究小肠上皮细胞Caco-2细胞对金黄色葡萄球菌感染的反应。方法采用细胞内菌落技术法推算Caco-2细胞内吞金黄色葡萄球菌的能力,采用Realtime-PCR法检测Caco-2细胞NOD2基因在金黄色葡萄球菌感染时的表达情况,采用ELISA、流式细胞术等方法观察Caco-2细胞在金黄色葡萄球菌感染时细胞因子分泌水平,核转录因子(nuclear factorκB,NF-κB)活化水平和细胞凋亡发生率。结果 Caco-2细胞能够内吞金黄色葡萄球菌,金黄色葡萄球菌感染可引起Caco-2细胞内NOD2表达增高,NF-κB活化水平增高,分泌细胞因子水平升高,Caco-2细胞发生凋亡,且凋亡率随感染后时间延长增高。结论金黄色葡萄球菌能够激活Caco-2细胞的免疫反应,细胞内模式识别受体NOD2在识别细胞内细菌、信号传导、核转录因子激活中发挥关键作用。     

miR-373通过P2X7R影响抑郁症小鼠行为的作用机制

  目的  探讨miR-373对抑郁症小鼠模型抑郁样行为，小胶质细胞激活和焦亡的影响。  方法  采用慢性不可预知应激构建抑郁症小鼠模型。蔗糖偏好，强迫游泳，尾部悬挂和社会实验评估小鼠的抑郁样行为。免疫荧光双染小胶质细胞标志物Iba-1和小胶质细胞活化标志物OX-42以评估小鼠海马层中小胶质细胞增殖和活化状态。TUNEL试剂盒检测小胶质细胞的凋亡。荧光定量PCR检测miR-373的表达水平。蛋白质印记检测P2X7R和细胞焦亡相关蛋白的表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证miR-373和P2X7R的靶向关系。  结果  慢性不可预知应激处理的小鼠，蔗糖偏好度和社交时间显著下调，并且强迫游泳和尾部悬挂不动时间显著增加（P < 0.05）。miR-373在抑郁症模型小鼠中异常高表达，且能够缓解小鼠的抑郁样行为（P < 0.05）。miR-373靶向负调控小鼠海马层小胶质细胞中P2X7R的表达水平（P < 0.01）。miR-373抑制小鼠海马层中小胶质细胞增殖和激活（P < 0.01）。miR-373抑制小胶质细胞中Caspase-1，C-caspase-1，NLRP3，IL-1β和IL-18表达，并抑制小胶质细胞凋亡（P < 0.05）。  结论  miR-373通过靶向抑制P2X7R的表达，从而缓解抑郁症小鼠模型的抑郁样行为，并抑制其海马层中小胶质细胞活化和焦亡。     

2-脱氧-D-葡萄糖联合羟基喜树碱协同诱导乳腺癌细胞凋亡的作用

  目的  探究2-脱氧-D-葡萄糖(2-deoxy-D-glucose, 2-DG)联合羟基喜树碱(hydroxycamptothecin, HCPT)对乳腺癌细胞抗肿瘤活性的影响及其机制。  方法  采用2-DG(0、1.25、2.5、5、10、20 mmol/L)、HCPT(0、5、10、20、40 μmol/L)单独作用以及5 mmol/L 2-DG与各浓度HCPT联合作用于乳腺癌细胞MDA-MB-231与MCF-7,使用MTT法检测细胞增殖;溴化丙啶(propidium iodide,PI)检测5 mmol/L 2-DG、10 μmol/L HCPT单独作用以及联合作用对MDA-MB-231细胞的凋亡作用;不同浓度2-DG作用于MDA-MB-231细胞6 h后,测定细胞内ATP含量变化;Western blot检测MDA-MB-231细胞Akt、P-Akt、Bcl-2/Bax、PARP、Caspase-8和Caspase-3蛋白的表达。  结果  5 mmol/L 2-DG与HCPT联合具有协同作用,处理48 h结合指数(CI < 1),合用组凋亡率均高于单用组(P < 0.05), 同时两者合用抑制Akt蛋白的磷酸化以及增加了Caspase-3蛋白的活化,增加了对PARP蛋白的剪切。  结论  2-DG联合HCPT可以协同诱导乳腺癌细胞凋亡,其机制可能是抑制肿瘤细胞能量生成以及抑制Akt蛋白的磷酸化和增强Caspase-3蛋白的活性。     

肠道病毒71型对人神经胶质瘤U251细胞线粒体动力学的影响

  目的  探讨肠道病毒71型（EV71）对人神经胶质瘤U251细胞线粒体动力学的影响。  方法  采用非洲绿猴肾细胞Vero对EV71进行增殖,用Reed-Muench公式计算病毒液的50%细胞感染剂量（50% tissue culture infective dose,TCID₅₀);将EV71接种于U251细胞,光学显微镜下观察细胞形态,激光共聚焦显微镜下观察线粒体形态,透射电镜观察线粒体超微结构的改变;Western blot检测线粒体分裂蛋白Drp1、p-Drp1(S637)和融合蛋白Opa1的表达水平;ATP试剂盒检测线粒体ATP水平;MitoSOX染色检测线粒体超氧化物水平。  结果  EV71的TCID₅₀为10－5.4/ 0.1 mL; EV71感染U251细胞24 h、48 h后细胞明显出现皱缩、变圆或死亡。激光共聚焦显微镜和透射电镜结果显示,EV71感染后细胞线粒体明显延长,线粒体嵴模糊不清;Western bolt结果显示,EV71感染U251细胞24 h和48 h后,Drp1、Opa1表达降低,而p-Drp1（S637）在48 h表达升高,且差异有统计学意义（P<0.05）。EV71感染48 h后,与未感染EV71的U251细胞相比,线粒体ATP生成减少,线粒体超氧化物水平升高（P<0.05）。  结论  EV71感染U251细胞后,能引起线粒体形态及动力学改变,进而导致线粒体功能的变化,这可能是其引起神经系统功能紊乱的机制之一。     

沉默FMOD对H322细胞的增殖和迁移的影响及其作用机制探讨

  目的  研究纤调蛋白(fibromodulin,FMOD)对非小细胞肺癌H322细胞增殖、黏附和迁移的影响,并探讨其作用机制。  方法  H322细胞随机分为对照组、小干扰RNA(siRNA) 沉默FMOD（FMOD siRNA）组和对照siRNA（Con siRNA）组。FMOD siRNA和Con siRNA转染H322细胞,CCK-8法检测各组细胞的细胞活性,荧光素双醋酸酯（FDA）荧光染色检测细胞的黏附能力,Transwell法检测细胞的迁移能力;Real time-PCR法检测Con siRNA组和FMOD siRNA组细胞中Cyclin D1、细胞间黏附分子-1（ICAM-1)、钙黏附蛋白-E（E-cadherin）、FMOD、转化生长因子-β1（TGF-β1）、Smad2、Smad3、Smad4及Smad7的mRNA表达,蛋白印迹法检测细胞中Cyclin D1、ICAM-1、E-cadherin、FMOD、TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3、Smad4及Smad7的蛋白表达。  结果  与Con siRNA组相比,FMOD siRNA组细胞的细胞活性降低,细胞黏附及迁移能力减弱,差异均有统计学意义（P<0.01）,对照组和Con siRNA组差异无统计学意义。Real time-PCR和蛋白印迹法检测结果显示:与Con siRNA组相比,FMOD siRNA组细胞Cyclin D1、ICAM-1、TGF-β1、Smad2、Smad3及Smad4的mRNA和蛋白表达水平降低,E-cadherin及Smad7的mRNA和蛋白表达水平升高。  结论  沉默FMOD基因,可抑制H322细胞的增殖、黏附和迁移,其作用可能通过抑制TGF-β/Smad信号通路实现。     

纳米二氧化硅通过PI3K/AKt信号通路影响肺泡巨噬细胞凋亡的研究

  目的  探讨磷脂酰肌醇激酶-3/蛋白激酶B（phosphatidyl inositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKt）信号通路对纳米二氧化硅（nano silica,NS）粉尘诱导肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages,AM）凋亡发生的影响。  方法  通过不同质量浓度的NS粉尘染毒AM细胞后,CCK-8法检测细胞存活率;荧光显微镜观察细胞形态;流式细胞术检测PI3K抑制剂LY294002预处理前后细胞的凋亡率与线粒体膜电位;Western blot法检测PI3K抑制剂LY294002预处理前后细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2以及磷酸化（p）-PI3K、p-AKt的表达水平。  结果  NS可降低AM细胞的存活率,部分细胞出现凋亡形态学改变;LY294002预处理AM后,线粒体膜电位水平的下降程度增加,并下调Bcl-2、p-PI3K、p-AKt蛋白的表达,同时上调Bax蛋白的表达,增加细胞凋亡率。  结论  PI3K/AKt信号通路可能参与了NS诱导AM细胞的凋亡过程。     

基于黑猩猩腺病毒6型的新型溶瘤病毒抑瘤研究

目的 以6型黑猩猩腺病毒(AdC6)为载体,构建一组新型溶瘤腺病毒,使之获得瘤内特异性复制能力.在体内外检测其抑瘤效果,并探讨其溶瘤机制.方法 以AdC6载体为基础,以人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动该腺病毒的复制相关基因E1A表达,获得重组溶瘤病毒AdC6-htertE1A-ΔE3,同源构建表达粒细胞-巨噬细...     

AY358935基因抗水疱口炎病毒的作用及其机制探讨

  目的  初步探讨本课题组前期克隆的AY358935基因对水疱口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)的作用及机制。  方法  将构建完整的pcDNA3.1-AY358935质粒及pcDNA3.1空载体分别稳定转染HEK293细胞,并以VSV感染已转染上述基因或空白的HEK293细胞,感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.001。蚀斑分析法检测以上3组细胞上清液中不同时间点的病毒滴度,感染VSV 24 h后用台盼蓝排斥试验检测各组细胞死亡率;对稳定转染目的基因的细胞提取总RNA,进行全基因组cDNA芯片分析。  结果  ① 病毒滴度:感染VSV 12 h后,pcDNA3.1-AY358935组细胞上清病毒滴度较pcDNA3.1组和空白组低。18 h时3组病毒滴度分别为(7.16±2.33)×105 PFU/mL、(6.25±2.05)×106 PFU/mL、(7.75±2.54)×106 PFU/mL,pcDNA3.1-AY358935组细胞上清病毒滴度与其余两组的差异接近10倍(P < 0.01);②细胞死亡率:病毒感染24 h后,pcDNA3.1-AY358935组、pcDNA3.1组和空白组的细胞死亡率分别为(35.00±6.68)%、(78.33±15.03)%和(83.34±14.98)%,pcDNA3.1-AY358935组的细胞死亡率较其余两组降低(P < 0.01);③基因芯片分析结果:与pcDNA3.1空载体组比较,稳定转染pcDNA3.1-AY358935的细胞有30个基因表达上调在3倍以上,其中,干扰素激活基因、干扰素效应基因、细胞因子与趋化因子所占比例分别为27%、17%、20%。  结论  AY358935基因具有抗VSV作用,其机制可能涉及干扰素相关的天然免疫应答。     

人巨细胞病毒负荷量对细胞病变的影响

目的探讨感染后人巨细胞病毒负荷量与细胞病变的关系。方法采用不同滴定度的人巨细胞病毒感染传代培养的人胚肺成纤维细胞,建立人巨细胞病毒梯度感染细胞模型,荧光定量PCR法测定感染细胞内及其维持液病毒DNA量,光镜观察致细胞病变作用,电镜检查其超微结构的改变。结果人巨细胞病毒感染后,细胞内与其维持液病毒DNA量成正相关(r=0.83,P<0.01)。当细胞内病毒DNA量>105GE/106HEL时,病毒开始自细胞内释放;当维持液病毒DNA量>103GE/ml时,细胞出现病变。结论人巨细胞病毒感染后,受染细胞排放病毒致细胞外,且细胞内外病毒负荷量成正相关。细胞病变的发生情况与细胞内及其周围环境的病毒负荷量均密切相关。     

小檗碱通过激活自噬诱导caspase依赖性凋亡发挥抗结直肠癌作用

  目的  探究小檗碱通过自噬依赖性凋亡发挥抗结直肠功效的潜在作用机制。  方法  使用HCT116细胞和移植瘤模型小鼠进行小檗碱抗肿瘤药效和可能作用机制的研究。体外研究中, 通过利用CCK8实验评价小檗碱对结直肠癌细胞活力的影响, 使用细胞克隆实验评价小檗碱对结直肠癌细胞增殖的影响, 同时借助流式细胞术和TUNEL染色法对小檗碱诱导结直肠癌细胞凋亡作用进行研究。透射电镜和mCherry-GFP-LC3B腺病毒转染细胞用于检测细胞内自噬流变化。通过对小鼠组织进行HE染色、免疫组化染色和TUNEL染色, 评价小檗碱体内抗结直肠癌作用。  结果  体外研究结果表明, 小檗碱能够抑制结直肠癌细胞活力, 诱导细胞凋亡, 同时提高细胞内LC3B水平。使用自噬抑制剂3-MA、CQ和BafA1进行干预, 自噬抑制剂能够促进HCT116细胞生长, 抵消小檗碱诱导的结直肠癌细胞凋亡作用。雷帕霉素增强小檗碱上调HCT116细胞中LC3B水平的作用, 同时Z-VAD-FMK或ATG siRNA能够废除小檗碱诱导结直肠癌细胞凋亡的作用。在体研究结果表明, 小檗碱能够降低肿瘤体积和重量, 引起肿瘤组织发生凋亡。进一步的体内作用机制研究结果表明, 小檗碱显著抑制p-mTOR表达, 同时显著上调ATG5、ATG7、cleaved-caspase3和cleaved-caspase8表达。  结论  小檗碱能够通过诱导结直肠癌细胞发生自噬, 促进其发生caspase依赖性凋亡, 进而抑制结直肠癌细胞增殖。      

昆明地区艾滋初治病例感染、免疫及耐药情况调查

目的 研究针对昆明地区艾滋初治病例感染、免疫及耐药情况进行调查研究,将临床特征及病毒学特征进行联合分析,为艾滋病治疗难易程度的判定及抗病毒精准医疗个体化方案的制定提供依据.方法 选取初治HIV病例200例,于治疗前采集血液,进行HIV病毒载量、HCV病毒载量、HBV病毒载量、CD4+T淋巴细胞计数,血清白蛋白、ALT、...     

HBV前S1抗原下调肝细胞表面MHC-Ⅰ并促进肝癌产生

目的 探讨慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染诱发肝癌所涉及的内在机制.方法 对稳定过表达HBV前S1抗原(preS1)的L02、HepG2和Huh7细胞进行流式细胞术、实时荧光定量和裸鼠成瘤等实验来评估preS1在HBV相关性肝癌发生中的作用.结果 preS1诱导细胞肿瘤干细胞(CSCs)相关因子和表面标志分子的表达上调,...