全反式维甲酸增强HSV-TK/GCV对BIU-87细胞旁观者效应的观察

目的体外观察全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)对BIU-87细胞缝隙连接细胞间通讯(gap junction intercellular communication,GJIC)及旁观者效应的影响.方法用染料划痕标记技术观察ATRA对BIU-87细胞GJIC功能的影响,MTT法观察ATRA处理后HSV-TK/GCV对BIU-87细胞旁观者效应的变化.结果ATRA显著改善BIU-87细胞GJIC功能,并提高HSV-TK/GCV的旁观者杀伤作用.结论ATRA可以改善BIU-87细胞间通讯功能,可能是ATRA增强HSV-TK/GCV旁观者效应的重要原因之一.     

单纯疱疹胸苷激酶/更昔洛韦系统杀伤前列腺癌细胞的"旁观者效应"及其调控

目的评价单纯疱疹胸苷激酶/更昔洛韦（HSV-TK/GCV）系统杀伤前列腺癌细胞PC-3m的“旁观者效应”,探讨连接蛋白（Cx）介导的细胞间隙连接交流（GJIC）在该系统“旁观者效应”中的作用,观察apigenin对PC-3m细胞连接蛋白43（Cx43）表达及GJIC状况的调控。方法MTT法评价TK基因系统杀伤PC-3m细胞的“旁观者效应”,划痕标记染料示踪技术（SLDT）比较几种代表细胞系GJIC功能状况,检测HSV-TK/GCV对其“旁观者效应”。逆转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）法和SLDT检测PC-3m细胞Cx43表达和GJIC状况,并观察apigenin对Cx43表达、GJIC状况及“旁观者效应”的调控作用。结果HSV-TK/GCV系统杀伤PC-3m细胞时“旁观者效应”程度较弱,TK基因阳性细胞比例约为10%的混合细胞经100 μmol/L GCV处理72 h后,仅23.5%±3.21%细胞被杀灭。该自杀基因系统对GJIC功能强大的NIH-3T3、 Cos-7和L-02细胞“旁观者效应”程度远较GJIC功能低下的ACHN和HeLa细胞者强（P<0.001）。PC-3m细胞Cx43 mRNA表达降低,GJIC功能低下,apigenin不仅可上调PC-3m细胞Cx43表达、促进GJIC功能,还可使其“旁观者效应”明显改观（P<0.001）。结论细胞内在的GJIC功能与HSV-TK/GCV对其“旁观者效应”程度有正向关系,PC-3m细胞Cx43 mRNA表达减弱及GJIC功能低下可能是导致HSV-TK/GCV系统杀伤该细胞时“旁观者效应”较弱的原因,某些化学物质如apigenin可通过上调PC-3m细胞Cx43表达并促进GJIC功能,增强“旁观者效应”程度及TK基因系统疗效。     

自杀基因引导的旁观者效应对鼠膀胱癌的作用

目的研究单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase, HSVtk)基因联合丙氧鸟苷(ganciclovir, GCV)治疗对膀胱癌的旁观者效应.方法用逆转录病毒载体HSVtk转染鼠源性膀胱癌细胞株T739,体外检测其对GCV的敏感性.将不同比例的T739和T739TK细胞共培养观察体外旁观者效应.在同基因鼠,将不同比例的T739和T739TK细胞混合建立膀胱癌腹腔肿瘤模型.当肿瘤B超显示0.5～0.8 cm,腹腔GCV给药6 d,然后观察肿瘤大小变化及动物存活时间.结果转染HSVtk基因的T739细胞对GCV的敏感性,RT-PCR分析证实TK基因mRNA的表达.细胞混合培养发现,当T739TK细胞占10%强时就可显示出明显的旁观者效应.在GCV的作用下,动物体内肿瘤生长受到显著抑制,动物存活时间明显延长,证明存在体内旁观者效应.结论转染HSVtk基因的鼠膀胱癌细胞可引导产生体内外旁观者效应,这种效应有助于加强 HSVtk/GCV系统对膀胱肿瘤的抗癌作用.     

全反式维甲酸增强携单纯疱疹病毒胸苷酸激酶基因的超声微泡对SMMC-7721细胞的旁观者效应

目的观察经全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)诱导后,单纯疱疹病毒胸苷酸激酶/丙氧鸟苷系统(HSV-TK/GCV)对人肝癌细胞SMMC-7721旁观者效应的影响。方法免疫组化法观察经全反式维甲酸诱导前后SMMC-7721细胞连接蛋白Cx32的表达;将含有HSV-TK基因的质粒通过静电吸附在脂质微泡表面上,采用超声辐照转染并用倒置显微荧光镜及RT-PCR观察TK基因的转入及表达;MTT法观察经全反式维甲酸诱导后HSV-TK/GCV对肝癌细胞SMMC-7721的旁观者效应。结果经全反式维甲酸诱导后SMMC-7721细胞膜上Cx32表达明显增加,而胞质内仅少量表达;通过超声辐照后HSV-TK基因可顺利转入SMMC-7721细胞中并稳定表达;与对照组相比,经全反式维甲酸诱导组可明显提高HSV-TK/GCV对肝癌细胞SMMC-7721的旁观者效应(P<0.05)。结论全反式维甲酸可提高SMMC-7721细胞中连接蛋白Cx32的表达且能正确定位于细胞膜上,这可能与其能增强HSV-TK/GCV系统对肝癌细胞SMMC-7721的旁观者效应有关。     

恢复connexin26表达联合载酵母菌胞嘧啶脱氨酶自杀基因纳泡杀灭膀胱癌细胞

目的 分析载双基因的阳离子纳泡联合超声靶向微泡破坏技术进行基因转染的有效性,探索恢复或上调膀胱癌细胞的缝隙连接蛋白connexin26(Cx26)表达,能否增强自杀基因系统(yeast cytosine deaminase/5-fluorocytosine,YCD/5-FC)的旁观者效应,提高杀灭肿瘤细胞的效率.方法 阳离子纳泡结合超声辐照(US)转染人膀胱癌T24细胞,荧光显微镜及流式细胞仪观测转染效率;qRT-PCR和Western blot检测质粒转染后的mRNA或蛋白相对表达量.将实验分为兀处理空白对照、载pcDNA3.1-EGFP纳泡组、载Cx26纳泡组、载YCD纳泡组、载YCD+ Cx26纳泡组;通过流式细胞术观察恢复Cx26表达后对膀胱癌细胞凋亡的影响.结果 qRT-PCR、Western blot显示纳泡结合超声辐照成功将目的基因转染并有效表达.恢复Cx26表达后,载YCD+Cx26纳泡组的细胞凋亡率为(60.68±2.61)％,明显高于单载YCD纳泡组的(46.42±2.13)％,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 恢复缝隙连接蛋白Cx26表达,可改善细胞间通讯连接,加强自杀基因系统YCD/5-FC的旁观者效应,促进肿瘤细胞凋亡,提高杀灭膀胱癌细胞的效率.     

Apigenin/GCV对C_6-TK细胞株的杀伤效应及作用机制

目的探讨Apigenin/GCV对体外培养鼠胶质瘤C6细胞的杀伤效应及作用机制。方法对含有导入pcDNA3-TK质粒的C6细胞进行培养、传代：通过MTT法、TUNEL实验法及光镜技术检测GCV/Apigenin对检测不同组别C6细胞C6-TK细胞株的杀伤效应。结果给GCV＋Apigenin后：转染组、空载体组和对照组中两两比较：转染组的细胞增殖水平显著低于空载体组和对照组（P〈0.05）;相对未处理组,用10μmol/LApigenin预先处理6h后,GCV对C6混合细胞的杀伤效应显著增强（P〈0.01）。结论缝隙连接功能上调剂Apigenin可显著提高HSV-TK/GCV肿瘤自杀基因系统的＂旁观者效应＂及显著促凋亡作用。GCV的作用效能对细胞间通讯功能有一定的依赖性。     

体外培养的人脐静脉内皮细胞之间直接通讯的实验研究

目的寻找人脐静脉内皮细胞之间的直接通讯的形态学证据.方法本研究采用RT-PCR、免疫荧光染色、划痕负载染料迁移法等方法来研究培养的人脐静脉内皮细胞缝隙连接蛋白Cx43的表达情况以及染料负载迁移情况.结果RT-PCR方法证实体外原代培养的人脐静脉内皮细胞有缝隙连接蛋白Cx43的mRNA的表达,免疫荧光染色发现Cx43蛋白质主要位于胞膜上,少量位于胞浆中.用划痕负载染料迁移法发现,小分子量的荧光黄染料能在培养的人脐静脉内皮细胞之间互相传递,而大分子量的罗丹明染料则不能在细胞问自由扩散,荧光黄染料的传递是通过细胞问的缝隙连接来实现的.结论该研究为人脐静脉内皮细胞之间直接通讯提供了新的形态学证据.     

AFP增强子驱动的HSV-TK/GCV自杀基因系统对肝癌细胞杀伤的实验研究

目的 探讨人AFP增强子驱动的单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)自杀基因系统体外靶向杀伤肝癌细胞效应.方法 构建人AFP增强子驱动的pAFP-CDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒,脂质体转染肝癌细胞,检测TK mRNA和蛋白表达.MTT法检测GCV对肝癌细胞的杀伤作用.结果 成功构建pAFP-CDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒,在AFP阳性HepG2细胞中检测到TK mRNA和蛋白表达,添加GCV 可特异性地杀伤HepG2细胞,而AFP阴性的SMMC7721细胞生长不受影响.结论 AFP增强子驱动的TK/GCV自杀基因系统可以靶向杀伤AFP阳性肝癌细胞.     

LKB1通过增强间隙连接细胞通讯增加乳腺癌细胞对顺铂的敏感性

目的研究LKB1对乳腺癌细胞顺铂化学敏感性的作用及机制。方法构建LKB1高表达的稳定转染细胞MDA-MB-231/LKB1及其空载对照细胞MDA-MB-231/VEC。RT-PCR、Western印迹法检测细胞间隙连接蛋白Cx26、Cx32、Cx43和Cx50的核酸、蛋白水平表达;免疫荧光实验对Cx43进行胞内表达定位;染料传输实验评估间隙连接细胞通讯功能;细胞毒实验检测顺铂杀伤乳腺癌细胞的＂旁观者效应＂及计算顺铂的半数抑制浓度。结果 LKB1增加了间隙连接蛋白Cx43的核酸及蛋白水平表达（P〈0.01）,但对Cx26、Cx32及Cx50的表达水平无明显影响。LKB1增加了细胞膜上Cx43的表达,增强了细胞传递荧光黄染料的能力,并使顺铂对细胞的旁观者杀伤效应增强。LKB1也增加了细胞对顺铂的敏感性,MDA-MB-231、MDA-MB-231/VEC和MDA-MB-231/LKB1的半数抑制浓度分别为22.46、24.72、6.55 nmol/L,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论 LKB1通过增强乳腺癌细胞的Cx43表达及间隙连接细胞通讯功能增强了顺铂的旁观者杀伤效应,并增加了细胞对顺铂的敏感性。     

缝隙连接蛋白Cx26/Cx32对依托泊苷抗肿瘤作用的影响

目的观察宫颈癌Hela细胞中缝隙连接蛋白Cx26/Cx32对依托泊苷抗肿瘤作用的影响。方法采用荧光示踪实验检测Hela细胞中由Cx26/Cx32形成的缝隙连接通讯功能,及药物(油酸酰胺,维甲酸)对其功能的影响;采用标准细胞集落形成分析法检测Hela细胞中由Cx26/Cx32形成的缝隙连接通讯功能改变后,依托泊苷对Hela细胞生长抑制作用的影响;采用Hoechst33258荧光染色检测缝隙连接通讯功能改变后,依托泊苷对Hela细胞诱导凋亡作用的影响。结果荧光示踪实验结果显示油酸酰胺可显著降低缝隙连接通讯功能,而维甲酸则可增强该功能;标准细胞集落形成实验结果表明,在缝隙连接形成的Hela细胞中,油酸酰胺显著降低依托泊苷对Hela细胞生长的抑制作用,而维甲酸则增强依托泊苷的细胞生长抑制作用;Hoechst 33258荧光染色结果显示,在缝隙连接形成的Hela细胞中,油酸酰胺显著降低依托泊苷对Hela细胞的诱导凋亡作用,而维甲酸则增强依托泊苷的诱导凋亡作用。结论宫颈癌Hela细胞中缝隙连接蛋白Cx26/Cx32形成的缝隙连接通讯功能降低,依托泊苷的抗肿瘤作用下降;而当通讯功能增强时,其抗肿瘤作用则增加。     

Cx43蛋白在宫颈癌细胞中的表达及其对细胞通讯功能的影响

探讨细胞间隙连接蛋白Ｃｘ４３在人子宫吕细胞系ＨｅＬａ中表达,及其对细胞间隙连接通讯的影响。方法应用流式细胞仪以及ＬｕｃｉｆｅｒＹｅｌｌｏｗ划痕记荧光舆技术,研究维甲酸作用对ＨｅＬａ细胞Ｃｘ４３蛋白表达,以及细胞生长状态和间隙连接通讯功能的调节作用。     

生存素反义寡核苷酸诱导膀胱癌细胞凋亡及增强其化疗敏感性

目的探讨生存素反义寡核苷酸（生存素-ASODN）对化疗药多西紫杉醇（泰索帝）诱导膀胱癌细胞系BIU87细胞凋亡的影响。方法将已构建成功的生存素-ASODN真核表达载体pcDNA3-SWas通过脂质体介导转染膀胱癌细胞系BIU87,并筛选转染成功的阳性克隆;采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测其生存素mRNA表达;锥虫蓝拒染法观察生存素-ASODN与泰索帝联合应用对BIU87细胞生存的影响;细胞计数和四甲基偶氮唑盐（MTT）试验测定转染细胞对泰索帝敏感性;琼脂糖凝胶电泳分析细胞凋亡DNA断裂情况;核染色检测凋亡细胞的细胞核的变化;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果转染生存素-ASODN真核表达载体pcDNA3-SWas的BIU87-SVVas细胞生存素mRNA表达水平下降、细胞增殖明显受抑,与转染pcDNA3空载体BIU87-neo细胞、未转染载体的BIU87细胞进行比较,差异均有统计学意义（均P〈0．05）;经琼脂糖凝胶电泳,BIU87-SVVa8细胞可见到DNA梯形条带,而其他对照组未见到;与BIU87-neo、BIU87细胞相比,BIU87-SVVas细胞的细胞核呈致密浓染;加入泰索帝的BIU87-SVVas细胞组的凋亡率大幅度增加。结论生存素-ASODN可促进泰索帝诱导BIUg7细胞凋亡及增加其对泰索帝的敏感性,为膀胱癌的生物学治疗研究奠定了实验基础。     

Preliminary study of the in vitro growth inhibition of human bladder cancer cell line BIU-87 by arsenic trioxide

Arsenic trioxide (As,O, ) is the major effectivecomponent of Pishuang. Because of its toxic and sideeffects, it was not widely used in clinic for a lOng period. In addition, it was believed that arsenic compound could result in chromosome abnormality, sis…