siRNA沉默葡萄糖调节蛋白78可增强乳腺癌细胞对顺铂的敏感性

目的探讨siRNA沉默葡萄糖调节蛋白78（GRP78）增强顺铂对乳腺癌细胞凋亡的敏感性,以期为乳腺癌的临床治疗提供
新的靶点。方法MTT法检测不同浓度（0、1、2、4、8、16 μmol/L）顺铂对乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖抑制作用;PI/Annexin
V 双染检测顺铂（8 μmol/L）对siRNA转染沉默GRP78乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡的影响,同时将未转染和转染空质粒乳腺
癌细胞MDA-MB-231 作为空白和阴性对照;Western blot 检测顺铂（8 μmol/L）处理乳腺癌细胞MDA-MB-231 不同时间（0、6、
16、24 h）GRP78的表达以及siRNA转染沉默GRP78乳腺癌细胞MDA-MB-231 中GRP78的表达。结果8 μmol/L顺铂作用于
乳腺癌细胞MDA-MB-231 24、48、72 h细胞存活率分别为83.13%、54.22%、35.79%,但24 h细胞凋亡率仅为10.8%。将GRP78
沉默后,细胞的凋亡率为24.6%,沉默GRP78并合用顺铂进行刺激,细胞的凋亡率为48.9%,明显高于单用顺铂组。用顺铂刺激
乳腺癌细胞MDA-MB-231 GRP78表达先上调后有减弱趋势,而siRNA转染沉默GRP78后,GRP78表达明显下降。结论抑制
GRP78的表达可以增加乳腺癌细胞的凋亡率,为乳腺癌的临床治疗提供了新的靶点。
     

NK、T混合淋巴细胞与顺铂联合对乳腺癌MDA-MB-231细胞株体外杀伤研究

目的：探讨利用荧光染料CFSE标记法及MTT法,观察人NK、T混合淋巴细胞（NKTm）体外杀伤MDA-MB-231肿瘤株的效果。方法：应用CFSE/PI染色法及MTT法标记人乳腺癌MDA-MB-231肿瘤株,观察NKT细胞联合顺铂在各种时序下对乳腺癌MDA-MB-231肿瘤株的杀伤效果。结果：CFSE染色条件下,人NKTm细胞体外对MDA-MB-231细胞效靶比E/T=25：1时较E/T=12.5：1时杀伤率明显升高;E/T=12.5：1时杀伤率略低于顺铂;先加入NKTm各组随与顺铂间隔时间的延长而杀伤率升高（以上P均〈0.05）。结论：NKTm细胞对MDA-MB-231肿瘤细胞的直接杀伤作用强,同顺铂联用时要提高对肿瘤细胞的杀伤率应先给予NKTm细胞后应用顺铂。     

单纯疱疹胸苷激酶/更昔洛韦系统杀伤前列腺癌细胞的"旁观者效应"及其调控

目的评价单纯疱疹胸苷激酶/更昔洛韦（HSV-TK/GCV）系统杀伤前列腺癌细胞PC-3m的“旁观者效应”,探讨连接蛋白（Cx）介导的细胞间隙连接交流（GJIC）在该系统“旁观者效应”中的作用,观察apigenin对PC-3m细胞连接蛋白43（Cx43）表达及GJIC状况的调控。方法MTT法评价TK基因系统杀伤PC-3m细胞的“旁观者效应”,划痕标记染料示踪技术（SLDT）比较几种代表细胞系GJIC功能状况,检测HSV-TK/GCV对其“旁观者效应”。逆转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）法和SLDT检测PC-3m细胞Cx43表达和GJIC状况,并观察apigenin对Cx43表达、GJIC状况及“旁观者效应”的调控作用。结果HSV-TK/GCV系统杀伤PC-3m细胞时“旁观者效应”程度较弱,TK基因阳性细胞比例约为10%的混合细胞经100 μmol/L GCV处理72 h后,仅23.5%±3.21%细胞被杀灭。该自杀基因系统对GJIC功能强大的NIH-3T3、 Cos-7和L-02细胞“旁观者效应”程度远较GJIC功能低下的ACHN和HeLa细胞者强（P<0.001）。PC-3m细胞Cx43 mRNA表达降低,GJIC功能低下,apigenin不仅可上调PC-3m细胞Cx43表达、促进GJIC功能,还可使其“旁观者效应”明显改观（P<0.001）。结论细胞内在的GJIC功能与HSV-TK/GCV对其“旁观者效应”程度有正向关系,PC-3m细胞Cx43 mRNA表达减弱及GJIC功能低下可能是导致HSV-TK/GCV系统杀伤该细胞时“旁观者效应”较弱的原因,某些化学物质如apigenin可通过上调PC-3m细胞Cx43表达并促进GJIC功能,增强“旁观者效应”程度及TK基因系统疗效。     

间隙连接蛋白26-EGFP载体的构建与表达

目的：构建间隙连接蛋白(connexin，Cx)26-EGFP真核表达载体，观察其在细胞内的表达和功能情况。方法：经RT-PCR获得Cx26基因全长片段，重组至有增强绿色荧光蛋白标记的真核表达载体pEGFP-N2中，经脂质体转染至宫颈癌Hela细胞中，通过激光共聚焦显微镜、免疫细胞化学方法、蛋白印迹法(Western blot)检测蛋白表达，应用荧光染料(Lucifer Yellow)细胞划痕法检测细胞间间隙连接通信状态。结果：转染细胞有增强绿色荧光蛋白及Cx26的表达，细胞间间隙连接通讯恢复。结论：融合表达增强绿色荧光蛋白后，不影响间隙连接蛋白的功能，在间隙连接蛋白的研究中，pEGFP-N载体可以作为一个优选载体。     

乳酸菌培养上清液下调Piwil2基因增强三阴性乳腺癌细胞对顺铂的敏感性

目的 探讨乳酸菌培养上清液(lactobacilli supernatants,LS)处理乳腺癌细胞对顺铂(cisplatin,DDP)敏感性的影响及其机制.方法 采用CCK-8和Western blot检测不同浓度DDP(0、1、2、3、4、5 μg/mL)和LS(体积分数分别为1％、5％、10％、20％)对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和Piwil2基因表达的影响;瞬时转染Piwil2 siRNA沉默MDA-MB-231细胞中Piwil2基因表达,Westernblot检测其沉默效果,CCK-8检测Piwil2基因沉默后对MDA-MB-231细胞增殖的影响;2μg/mL DDP联合不同浓度LS(体积分数分别为1％、5％、10％、20％)作用MDA-MB-231细胞,观察细胞增殖抑制效应和Piwil2蛋白表达的改变.结果 高浓度DDP(≥3μg/mL)可抑制MDA-MB-231细胞的增殖(P＜0.05),而低浓度DDP(≤2 μg/mL)不能有效抑制细胞增殖;DDP以剂量依赖性方式上调Piwil2蛋白的表达;siRNA沉默Piwil2表达可恢复2μg/mL DDP对细胞增殖的抑制.与对照组(乳酸菌培养基,MRS)比较,LS以剂量依赖性方式下调Piwil2蛋白的表达,但并不影响细胞的增殖;与单用2μg/mLDDP比较,2μg/mL DDP联合20％ LS处理可显著下调Piwil2蛋白的表达并抑制细胞增殖(P＜0.05).结论三阴性乳腺癌细胞中Piwil2的高表达可导致细胞对顺铂敏感性的降低,乳酸菌培养上清液可通过下调PiwiL2基因的表达增强三阴性乳腺癌细胞对顺铂的敏感性.     

n-6/n-3 多不饱和脂肪酸不同比例对乳腺癌细胞缝隙连接细胞通讯的影响

目的观察N-6/N-3多不饱和脂肪酸(POLYUNSATURATED FATTY ACID,PUFA)不同比例对乳腺癌细胞缝隙连接细胞通讯的影响。方法N-6/N-3PUFA不同比例(1~10)处理MCF-7(ER )和MDA-MB-231(ER-)乳腺癌细胞,采用免疫细胞化学观察细胞核KI-67表达,WESTERN BLOT检测细胞膜和细胞质缝隙连接蛋白CX26、CX43表达,划痕负载染料迁移法分析细胞缝隙连接通讯功能。结果免疫组化结果显示,单纯N-6和10∶1N-6/N-3PUFA增强两种乳腺癌细胞KI-67表达(P<0.05),5∶1N-6/N-3PUFA虽无明显变化,但单纯N-3和1∶1N-6/N-3PUFA抑制细胞KI-67表达(P<0.01)。免疫印迹发现,单纯N-3和1∶1N-6/N-3PUFA能明显上调MCF-7细胞膜和细胞质的CX26、CX43蛋白表达,单纯N-6PUFA却下调两种蛋白表达;在MDA-MB-231细胞,N-6/N-3PUFA不同比例对膜和细胞质的CX43蛋白表达与MCF-7细胞具有相同趋势,但对CX26蛋白则无明显作用。用划痕负载染料迁移法却发现,N-6/N-3PUFA不同比例对细胞缝隙连接通讯功能均无明显影响。结论单纯N-3和1∶1N-6/N-3PUFA对MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖活性的抑制作用,可能是CX26和CX43蛋白通过独立于缝隙连接细胞通讯功能的调节所致。     

miR-18b增强乳腺癌MDA-MB-231细胞对顺铂化疗敏感性的作用及其机制

目的:探讨miR-18b在三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞对顺铂(DDP)化疗敏感性中的作用,阐明其可能的机制。方法:乳腺癌MDA-MB-231细胞根据转染条件分为MDA-MB-231组、MDA-MB-231+DDP组、MDA-MB-231-NC组、MDA-MB-231-NC+DDP组、MDA-MB-231 mimic组和MDA-MB-231 mimic+DDP组。采用生物信息学方法预测的miR-18b的靶基因;荧光素酶报告基因分析验证miR-18b与靶基因3'UTR的结合;应用qRT-PCR法检测各组MDA-MB-231细胞中miR-18b的表达水平;Western blotting法检测MDA-MB-231细胞中ATM蛋白表达水平;CCK-8法检测各组细胞的生长抑制率。结果:荧光素酶实验报告验证ATM为miR-18b的靶基因,并与ATM 3'UTR序列部分结合;与MDA-MB-231-NC组比较,MDA-MB-231 mimic组和MDA-MB-231 mimic+DDP组细胞中miR-18b的表达水平升高(P<0.05);Western blotting法检测,与MDA-MB-231组比较,MDA-MB-231+DDP组细胞中ATM蛋白表达水平升高(P<0.05);与MDA-MB-231-NC组比较,MDA-MB-231 mimic组细胞中ATM蛋白表达水平降低(P<0.05);与MDA-MB-231-NC+DDP组比较,MDA-MB-231 mimic+DDP组细胞中ATM蛋白表达水平降低(P<0.05);CCK-8法检测,与MDA-MB-231 NC组比较,经不同浓度DDP作用后,MDA-MB-231 mimic组细胞生长抑制率均升高。结论:miR-18b通过靶向调控ATM蛋白增强乳腺癌MDA-MB-231细胞对DDP的化疗敏感性。     

HSVtk/GCV介导的旁观者效应对人膀胱癌的作用机理

目的研究单纯疱疹病毒胸腺苷激酶基因(HSVtk)联合丙氧鸟苷(ganciclovir, GCV)对人膀胱癌细胞(BIU87)的旁观杀伤作用,探讨旁观者效应产生的机制.方法将携带HSVtk基因的细胞BIU87-TK与BIU87混合培养,观测HSVtk/GCV系统的旁观者效应.染料划痕标记观察细胞间缝隙连接功能;RT-PCR 检测连接蛋白Connexin26 (Cx26) mRNA表达.同时观测维甲酸对缝隙连接和旁观者效应的影响.结果当BIU87-TK占40%时,共培养细胞对GCV的杀伤敏感性接近60%,显示出旁观者效应.大量细胞凋亡.划痕实验见染料传至临近细胞,RT-PCR 检测出Cx26mRNA表达(0.15).维甲酸处理后,染料传递至更多细胞,Cx26mRNA表达增加到0.34, HSVtk/GCV的旁观者效应随之提高.结论 HSVtk/GCV对人膀胱癌细胞具有旁观杀伤作用,其机理与细胞间缝隙连接和凋亡有关.维甲酸能增强细Cx26表达和缝隙连接功能,提高旁观者效应.     

Hedgehog通路对乳腺癌细胞增殖和凋亡的作用及其对Cx32和Cx43表达的影响

目的: 研究Hedgehog通路对乳腺癌细胞增殖、凋亡及间隙连接蛋白32(Cx32)和间隙连接蛋白43(Cx43)表达的影响,探讨其在乳腺癌细胞增殖和转移中的作用机制。方法: 取对数生长期乳腺癌MCF-7细胞分为环巴胺组和空白对照组,环巴胺组分别以5、10、20、30和40 μmol·L^-1环巴胺处理MCF-7细胞24、48和72 h,应用MTT法测定各组MCF-7细胞增殖抑制率。以0(阴性对照组)和25 μmol·L^-1环巴胺处理MCF-7细胞48 h后,AnnexinⅤ/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率及Cx32、Cx43胞膜阳性表达率。结果: 与空白对照组比较,各剂量环巴胺组MCF-7细胞增殖抑制率明显升高(P<0.05),且随环巴胺剂量增加和作用时间延长其增殖抑制作用增强;与空白对照组比较,25 μmol·L^-1环巴胺组48 h时,MCF-7细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。与阴性对照组比较,25 μmol·L^-1环巴胺组48 h时,MCF-7细胞胞膜Cx32和Cx43阳性表达率明显升高(P<0.05)。结论: Hedgehog通路可抑制乳腺癌细胞凋亡,并调节Cx43和Cx32的胞膜表达。     

间隙连接蛋白43在系统旁观者效应中的作用

目的　研究细胞间间隙连接蛋白 4 3(connexin4 3,Cx4 3)在单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因及更昔洛韦 (HSV tk GCV)系统旁观者效应中的作用 ,探讨旁观者效应的机制。方法　用带tk基因的逆转录病毒载体感染不同Cx4 3表达水平的中国仓鼠卵巢细胞 (CHO) ,获得不同Cx4 3表达水平的tk 细胞 ,tk /tk-细胞按不同比例混合 ,经更昔洛韦 (GCV)作用后 ,用细胞计数检测混合细胞体系的生长抑制率 ,用流式细胞仪检测各组细胞的DNA含量并分析细胞周期。结果　体外实验证实 ,tk /tk-混合细胞经GCV作用后生长受抑制的程度与Cx4 3表达水平有关 ,Cx4 3表达水平高的混合细胞在含有 5 %tk 细胞时就表现出旁观者效应 ,而Cx4 3表达水平低的混合细胞在含有 2 0 %tk 细胞时才表现出明显的旁观者效应。结论　在HSV tk GCV系统的基因治疗过程中 ,旁观者效应的效率与间隙连接蛋白的表达水平有关     

DADS提高HSV—tk／GCV自杀基因系统对兔晶状体上皮细胞旁观者效应的机制

目的：探讨二烯丙基二硫化物（diallyl disulfide,DADS）提高重组腺相关病毒（recombinant adenoassociated virus,rAAV）介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶（herpes simplex virus kinase,HSV—tk）／丙氧乌苷（ganci—clovir,GCV）系统对兔晶状体上皮细胞旁观者效应的可能机制。方法：应用免疫组织化学方法检测正常兔晶状体上皮细胞间隙连接蛋白43（connexin43,Cx43）及转染HSV-tk基因的晶状体上皮细胞Cx43的表达,以及不同浓度的DADS诱导下的2种细胞的Cx43表达,MTT比色法检测细胞存活率。结果：兔晶状体上皮细胞Cx43及转染删弘砒基因的晶状体上皮细胞的Cx43经DADS诱导后表达阳性明显增强,尤其以50μmol／LDADS最明显。MTT比色法检测显示DADS增强了HSV—tk／GCV自杀基因系统的旁观者效应。结论：DADS可以提高晶状体上皮细胞Cx43的表达,并可提高HSV—tk／GCV自杀基因系统对兔晶状体上皮细胞的旁观者效应。     

黄芩苷对高糖环境下肾小球系膜细胞缝隙连接蛋白43表达的影响

目的 研究黄芩苷对高糖环境下肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cell,GMC）中缝隙连接蛋白43（connexin 43,Cx43）表达的影响.方法 将体外培养的大鼠GMC分为6组：低糖组,高糖组,黄芩苷低、中、高剂量组,蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）抑制剂组.培养72 h后,收集细胞并提取细胞总蛋白,Western-blot法检测黄芩苷对高糖环境下GMC中PKC和Cx43表达的影响,用划痕标记染料示踪技术检测黄芩苷对GMC缝隙链接通讯功能（gap junction intercellular communication,GJIC）的影响.结果 Western-blot结果显示,与低糖组比较,高糖组中PKC蛋白表达量显著增加（P〈0.01）,Cx43蛋白表达量显著减少（P〈0.01）;黄芩苷呈剂量依赖性降低PKC蛋白表达水平,升高Cx43蛋白表达水平.划痕标记染料示踪实验结果显示：与低糖组比较,高糖组GMC的GJIC功能缺乏,未向邻近细胞传输;与高糖组比较,PKC抑制剂组罗氏黄荧光染料向划痕两侧邻近细胞传输的层数较黄芩苷各剂量组明显增多,黄芩苷各剂量组呈剂量依赖性地增加传递的层数.结论 黄芩苷可剂量依赖性地抑制高糖环境下GMC中PKC的异常活化,从而上调Cx43表达,恢复GJIC的功能.     

DADS提高HSV-tk/GCV自杀基因系统对兔晶状体上皮细胞旁观者效应的机制

目的:探讨二烯丙基二硫化物(dialyl disulfide,DADS)提高重组腺相关病毒(recombinant adenoassociated virus,rAAV)介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus kinase,HSV-tk)/丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)系统对兔...     

青蒿琥酯对MDA—MB-231细胞增殖抑制作用及其机制

目的探讨青蒿琥酯（artesunate,ART）对乳腺癌雌激素受体阴性细胞MDA—MB-231抑制作用及其机制。方法ART处理细胞3d后,采用MTT比色法检测细胞增殖功能,观察细胞形态、结构的改变,免疫细胞化学检测Bax,nm23,Bcl-2,P21WAF1／CIP1蛋白的表达情况。结果ART作用于乳腺癌细胞MDA—MB-231后,发现其对细胞的抑制作用呈明显浓度依赖性,可导致细胞形态、结构改变;免疫细胞化学结果显示2μmol／L青蒿琥酯作用细胞72h后,药物组同细胞对照组比较,可上调Bax、nm23、P21WAF1／CIP1蛋白表达,差异有统计学意义（P〈0．05）,Bcl-2蛋白质表达差异无统计学意义（P〉0．05）。结论ART有抑制MDA—MB-231细胞增殖的作用,其机制可能与上调Bax、nm23、P21WAF1／CIP1蛋白表达有关。     

降低COX-2表达与乳腺癌细胞迁移和侵袭关系的研究

目的 探讨利用小RNA干扰技术降低COX-2表达对高度恶性乳腺癌MDA-MB-231细胞趋化和侵袭能力的影响.方法 应用合成的小RNA干扰质粒转染MDA-MB-231细胞株,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测COX-2mRNA的表达.通过划痕实验检测细胞的运动能力;体外侵袭实验检测细胞的侵袭能力;应用细胞黏附...     

雌二醇及雌酮对人子宫内膜细胞GJIC及连接蛋白的影响

【目的】 探讨雌二醇(E2)及雌酮(E1)对体外培养的人子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞间隙连接细胞间通讯(GJIC)及连接蛋白(Cx)43?32表达的影响?【方法】 采用划痕染料标记示踪技术及激光共聚焦显微镜扫描技术(LSCM),观察E2及E1对原代培养的20例人子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞GJIC的影响,采用激光共聚焦显微镜扫描技术,观察E2及E1对Cx 43?Cx 32表达的影响?【结果】 5 × 10-5 mol/L雌二醇作用48 h后间质细胞及腺上皮细胞GJIC功能没有明显变化(P > 0.05),2.5 × 10-5 mol/L雌酮作用间质及腺上皮细胞48 h后,细胞GJIC功能有所下降(P 0.05)?【结论】 E1抑制细胞GJIC功能,提示其在子宫内膜增殖性病变的阶段扮演重要角色;E1及E2均未影响子宫内膜细胞Cx43?Cx32的表达,提示Cx表达量不能完全反映GJIC功能?     

黄芩素对缝隙连接蛋白Cx32组成的GJIC功能的影响

目的:在转染并稳定表达Cx32的HeLa细胞上,观察黄芩素对Cx32组成的GJIC及Cx32蛋白表达水平的影响。方法:细胞接种荧光示踪法观察不同浓度黄芩素对GJIC的影响;细胞免疫荧光法观察黄芩素在影响GJIC功能浓度范围内对Cx32蛋白表达的影响。结果:黄芩素(2.5μmol/L,5μmol/L,10μmol/L)增强Cx32组成的GJIC功能的荧光渗透率为10.04%,22.5%和35.33%;黄芩素(2.5μmol/L,5μmol/L,10μmol/L)增强组成GJIC的Cx32蛋白表达的荧光强度为(27.12±0.30)%,(56.31±1.02)%和(83.47±1.85)%。结论:黄芩素可增强缝隙连接蛋白Cx32组成的GJIC功能,其机制可能与增加Cx32蛋白表达水平有关。