维甲酸对MESPU35胚胎干细胞系神经定向分化的影响

目的 了解维甲酸(Retinoic acid,RA)对MESPU35胚胎干细胞系诱导分化的影响。方法小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层，培养MESPU35细胞系，4—/4 法诱导其神经定向分化。结果 相差显微镜观察RA诱导MESPU35细胞系出现神经样细胞拟胚体百分率随分化时相点和RA浓度升高而升高，免疫细胞化学观察分化的NF200和GFAP阳性细胞随分化时相点和RA浓度升高而增加，NF200阳性细胞由无突起变为多极细胞，GFAP阳性细胞突起由短变长，最后联结成网状。流式细胞仪检测分化的GFAP、NF200阳性细胞比例变化与免疫细胞化学结果相符。结论 RA诱导MESPU35细胞系神经定向分化的调节以浓度和时间依赖模式进行，提示其神经定向分化产生的高比例神经细胞可以用于移植治疗。     

多肽二维凝胶支架材料与鼠神经干细胞的细胞相容性

目的研究鼠神经干细胞在二维自组装多肽凝胶支架材料表面生长及分化情况，证明多肽凝胶可作为神经组织工程支架材料。方法取新生1周内乳鼠的大脑皮质，机械分离出神经干细胞，无血清培养液（DMEM／F12＋bFGF＋EGF＋B27）培养，免疫组化SABC法对神经干细胞进行鉴定；然后，将其接种到凝胶支架材料表面（实验组）及多聚赖氨酸包被的盖玻片表面（对照组），倒置相差显微镜观察干细胞的生长及分化情况。结果免疫组化法鉴定：培养的细胞为神经干细胞，Nestin（＋）。神经干细胞可分化为神经元及星形胶质细胞，NSE（＋），GFAP（＋）。倒置相差显微镜观察：实验组中。接种的神经干细胞生长良好，7d后可分化为有突起神经细胞；对照组中，7d后未发现长出突起神经细胞。结论二维自组装多肽凝胶对神经干细胞有良好细胞相容性，可作为神经组织工程支架材料。     

ES-NT3细胞的神经定向诱导分化

目的了解维甲酸(retinoic acid,RA)对ES-NT3细胞的神经诱导分化的影响.方法转染NT3基因后的MESPU35胚胎干细胞(ES-NT3细胞),4-/4 法诱导其神经定向分化.结果相差显微镜观察ES-NT3细胞诱导分化的神经样细胞拟胚体百分率随分化时相点延长而升高;免疫细胞化学观察ES-NT3细胞诱导分化形成的NF200阳性细胞和GFAP阳性细胞的比例随分化时相点延长而升高,二者总和可以达到75%.结论RA诱导ES-NT3细胞神经定向分化能够产生高比例神经细胞,提示其可以作为移植治疗神经损伤的供体.     

三磷酸胞苷二钠诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的 探讨三磷酸胞苷二钠(CTP)诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的作用.方法 取成年SD大鼠,用贴壁培养法分离纯化骨髓间充质干细胞(BMSCs),传代扩增,连续观察细胞形态及生长特性.用不同浓度(0.05、0.10、0.20、0.40和0.80 mg/mL)CTP对BMSCs进行诱导;诱导后用免疫组织化学检测细胞神经微丝蛋白(NF)、胶质原性纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元烯醇化酶(NSE)的表达.计算阳性细胞比例,进行统计学分析,选出合适的诱导剂量.结果 随CTP浓度增高,经免疫组织化学检测NF、GFAP和NSE阳性细胞比例也呈现逐步增高趋势,到一定浓度后又有所下降,统计学分析,CTP浓度为02 mg/mL时,能够诱导NF、GFAP和NSE阳性细胞比例为(32.73±0.63)%、(62.77±2.45)%和(30.41±0.65)%,显著高于对照组(P＜0.01).结论 CTP是一种很好的体外诱导剂,可以诱导MSCs向神经细胞分化,以0.2 mg/mL CTP作诱导剂,能够获得较明显的诱导MSCs向神经细胞和神经胶质细胞分化的结果.     

VEGF对兔骨髓基质干细胞成骨诱导及成骨细胞分化与增殖影响的体外研究

目的探讨体外条件下成骨诱导剂和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的联合应用对兔骨髓基质干细胞(Bone Marrow Stromal Cells,BMSCs)成骨分化过程中细胞增殖和分化的影响,为骨组织工程研究提供实验基础。方法取2月龄新西兰大耳白兔,麻醉后抽取股骨骨髓进行BMSCs原代细胞培养,取生长良好的第三代BMSCs进行分组培养。空白组:完全培养基培养;对照组:完全培养基中加入成骨诱导剂;实验组:完全培养基中加入成骨诱导剂及VEGF(10ng/ml)。MTT法检测诱导BMSCs成骨分化过程中细胞生长与增殖情况并绘制生长曲线;倒置相差显微镜、光学显微镜及扫描电镜观察诱导BMSCs成骨分化过程细胞的形态特征;茜素红(Alizarin Red S,ARS)染色鉴定钙结节;碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)染色、ALP活性及RT-PCR检测I型胶原(Collagen typeⅠ,colⅠ)mRNA表达;免疫组化染色检测诱导后细胞中VEGF蛋白表达情况。结果 1诱导BMSCs向成骨细胞分化后细胞呈圆形或多边型,短柱状或立方形,细胞表面有短的突起与相邻细胞连接。2茜素红染色光学显微镜下可见实验组和对照组均有散在的红色团块即钙结节。3二组中ALP染色均可见细胞浆内有黑色的碱性磷酸酶颗粒,但实验组ALP染色阳性细胞数多于对照组(P<0.05)。4诱导培养的成骨细胞ALP活性测定实验组和对照组ALP活性早期较低,以后逐渐增高,第四天起,实验组明显高于对照组(P<0.05)。5MTT法检测细胞增殖状态,实验组细胞增殖速度高于对照组,6~8d细胞增殖速度加快,二组比较差异有统计学意义(P<0.05)。6RT-PCR检测成骨细胞colⅠmRNA表达,诱导后实验组和对照组均可见colⅠmRNA表达,实验组colⅠmRNA的表达强度高于对照组。7免疫组化染色显示BMSCs的VEGF蛋白呈阴性表达,而诱导分化后的成骨细胞实验组与对照组均可见有VEGF蛋白表达且实验组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论 1BMSCs在成骨诱导剂作用下可向成骨细胞诱导,成为骨组织工程中理想的种子细胞。2 VEGF可促进成骨细胞的增殖和分化,当与成骨细胞诱导剂联合应用时,能够提高成骨细胞的增殖能力、增强成骨细胞的ALP活性,二者的协同作用共同促进了BMSCs向成骨细胞的增殖和分化,将有望提高骨缺损修复的治疗效果。     

功能化自组装多肽水凝胶支架促进小鼠骨髓间充质干细胞的粘附、增殖及成骨

目的 探讨功能化自组装纳米多肽DGEAmx水凝胶对小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的粘附、增殖和成骨分化的影响.方法 原子力显微镜观察功能化自组装多肽形成的纳米级结构特征;用倒置显微镜对贴壁细胞拍照计数,对比细胞粘附情况;用CCK-8法检测细胞增殖;激光共聚焦显微镜观察细胞在材料表面形貌;检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、成骨分化特异性基因Ⅰ型胶原(ICAM-1)和骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)的表达来评价成骨效果.结果 原子力显微镜观察功能化自组装多肽DGEAmx可以形成纳米纤维网状结构;倒置显微镜对贴壁细胞拍照计数结果显示在30、60、90 min时DGEAmx组对比RADA16-Ⅰ组粘附细胞数差异有统计学意义(P＜0.05);CCK-8法检测结果显示在培养第3、5、7天,DGEAmx组MSCs增殖较RADA16-Ⅰ组明显增高(P＜0.05);DGEAmx组成骨诱导3、7、14 d后,ALP活性高于RADA16-Ⅰ组(P＜0.05);Real-time PCR结果显示成骨诱导3、7、14 d后DGEAmx组较RADA16-Ⅰ组有更高的ICAM-1和OCN的表达(P＜0.05).结论 功能化自组装多肽DGEAmx纳米纤维水凝胶支架能促进MSCs粘附、增殖和成骨分化,作为骨组织工程支架材料有良好的应用潜力.     

功能化海藻酸钠水凝胶促骨髓间充质干细胞增殖、成软骨向分化的研究

目的探讨RGD多肽修饰的酰化海藻酸钠水凝胶基质能否调节骨髓间充质干细胞（BMSCs）的行为活性并促进其成软骨向分化。方法RGD多肽通过迈克尔加成反应接枝于酰化的海藻酸钠。光引发剂与酰化海藻酸钠的双键在紫外光照射下交联成胶。通过CCK-8实验、扫描电镜、细胞骨架染色、免疫荧光染色、Westernblot和RT-PCR评价功能化水凝胶对BM-SCs增殖、成软骨向分化的作用。结果相较于未接枝组,RGD多肽修饰的酰化海藻酸钠水凝胶可以促进基质内BMSCs形态延展并出现聚集。接枝RGD多肽后,无论在二维还是三维培养体系中,BMSCs的增殖活性明显高于未接枝组。经过成软骨诱导培养后,RGD多肽修饰的酰化海藻酸钠水凝胶可以更好地促进BMSCs凝聚和成软骨向分化。结论接枝RGD多肽的酰化海藻酸钠水凝胶可以更好地促进BMSCs增殖、成软骨向分化。     

bFGF与EGF诱导BMSCs向神经干细胞分化的观察

目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）在体外条件下对骨髓基质干细胞（BMSCs）向神经千细胞（NSCs）和神经样细胞分化的诱导作用。方法 采用出生4周左右大鼠的全骨髓细胞进行培养，传至第3代时，分为两组：实验组细胞加入bFGF和EGF，进行诱导分化；对照组不加因子继续培养。在倒置显微镜下每日观察，记录BMSCs的诱导分化情况，并应用免疫组化技术对细胞进行兔抗巢蛋白（Nestin）单抗、兔抗神经元特异性烯醇化酶（NSE）单抗、兔抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）单抗鉴定。结果 实验组诱导7d后有部分细胞具备神经元样细胞形态，胞体锥形或圆形，有较长单极或多极的突起，均有Nestin、NSE、GFAP阳性细胞表达，且3种细胞数量差别有显著性（t=3．266～6．099，P〈0．05）。而对照组细胞仍为典型的成纤维细胞形态，无Nestin、NSE、GFAP阳性细胞。结论 bFGF、EGF可以诱导BMSCs向NSCs分化，并可调控神经元分化，促进神经元细胞成熟。     

大鼠骨髓基质干细胞向神经元样细胞的分化

目的:体外定向诱导大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）向神经元样细胞的分化。方法： 用DMEM培养液冲洗骨髓,收集骨髓细胞接种在培养瓶中体外扩增、纯化。用诱导剂诱导BMSCs分化为神经元样细胞。用免疫组化ABC法鉴定神经丝蛋白（NF-200）、微管相关蛋白（MAP-2）、神经元特异核蛋白（NeuN）、巢蛋白(Nestin) 、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、GAD和ChAT的表达。结果： BMSCs经诱导后,胞体增大,并伸出细长突起,与神经元形态相似。免疫组化显示大部分细胞NF-200,MAP-2,NeuN和Nestin表达阳性,(3±0.8)%的细胞GAD表达阳性,(5±0.3)%的细胞ChAT表达阳性,而GFAP 表达阴性。结论： BMSCs可被诱导分化为神经元样细胞,部分细胞可表达GAD与ChAT。     

透明质酸水凝胶体外促进骨髓间充质干细胞神经分化的研究

目的观察以透明质酸(hyaluronic acid,HA)水凝胶作细胞支架,骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)在HA水凝胶中的生长、增殖和分化情况,探讨HA水凝胶支持、促进BMSCs分化为神经元细胞的作用。方法采用Percoll法从SD雄鼠的骨髓中分离纯化BMSCs,传代培养,倒置显微镜观察BMSCs的生长情况和形态变化。各组以不同的方法诱导BMSCs分化。采用免疫细胞化学法检测各组BMSCs在相应时间点神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经丝蛋白(NF)及巢蛋白(nestin)的阳性细胞数。RT-PCR检测各组BMSCs相应时间点的NSE mRNA、NF mRNA和nestin mRNA表达。结果传代后BMSCs形似纤维细胞。诱导后,HA水凝胶组(A组)和脑组织提取液组(B组)BMSCs分化为神经元样细胞:A组细胞黏附在HA水凝胶表面,长出较多突起和分支;B组细胞出现突起及少量分支。诱导后A组和B组NSE、NF阳性细胞增多(P<0.05)。诱导2d后及7d后A组和B组nestin阳性细胞均增多:2d后,A组高于B组(P<0.05);7d后,A组低于B组(P<0.05)。诱导7d后A组和B组的NSE mRNA、NF mRNA表达均增加,A组增加明显(P<0.05)。诱导2d后A组和B组的nestin mRNA表达增加,A组更显著(P<0.05);7d后A组和B组的nestin mRNA表达则降低,A组更明显(P<0.05)。结论 HA水凝胶有利于BMSCs的黏附,为BMSCs生长、增殖和分化提供了结构支持和适宜的微环境,促使BMSCs向神经元细胞分化、增殖并表达神经元特异性蛋白。     

略论藏象辨证与证素辨证的关系

分析藏象辨证与证素辨证的关系。从理论认知、辨证原则、病位划分、思维模式和证名规范5个角度分析藏象辨证和证素辨证的异同。两种辨证体系在理论认知和辨证原则上具有相似性,提出了建立统一规范的辨证新体系,以病位和病性作为辨证的核心;两种辨证体系在病位划分、思维模式和证名规范上具有差异,证素辨证遵循“证候-证素-证名”的辨证模式,以时空划分病位,并建立了加权浮动阈值求和计量诊断方法和证候辨证素量表,信息量化和可操作性更强;藏象辨证以五脏系统为病位核心,按病性分类立证,总结了常见的基础证和复合证,对证的层次性、系统性的阐释更加清晰。藏象辨证在继承证素辨证的基础上进一步发展创新,使得病位划分更加系统,思维模式更加缜密,证名规范更具层次。在辨证研究中,宜将各种辨证方法相融合,以推动现代中医辨证理论体系的发展。      

从“证体合辨”论治干燥综合征

目的:观察运用"证体合辨"理论治疗干燥综合征(sjogren’s syndrome,SS)的临床疗效。方法:78例SS患者随机分成对照组和治疗组,每组39例,对照组依据"辨证论治"理论组方,治疗组运用"证体合辨"理论组方,12周为1个疗程,观察治疗后两组患者中医证候积分、免疫炎性指标及不良反应的发生情况,评价临床疗效。结果:治疗组有效率为74.36%,对照组有效率为56.41%,两组比较,差异有统计学意义(P0.05);两组患者治疗后中医证候积分、红细胞沉降率和免疫球蛋白G均明显下降(P0.05),且治疗组下降幅度优于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论:运用"证体合辨"理论治疗SS临床疗效显著,可降低免疫炎性指标,改善临床症状,且不良反应小。     

辨病与辨证结合治疗弱精症的临床研究

目的观察辨病结合辨证治疗弱精症的临床疗效。方法将弱精症患者分为精索静脉曲张（VC）、附性腺感染、VC＋附性腺感染、不明原因四种类型,每种类型随机分为对照组和治疗组。对照组各类型患者分别应用克罗米酚和相应的抗感染药物治疗;治疗组患者根据不同类型的原因给予不同的方剂治疗,同时也予以相应的抗感染治疗。观察两组患者的临床疗效及快速运动精子（a）和直线运动精子（a＋b）的改善情况。结果治疗组总有效率为87.50%,对照组为64.06%,两组比较有显著性差异（P〈0.01）。治疗组a、a＋b级精子提高明显优于对照组,两组比较具有显著性差异（P〈0.01）。结论辨病结合辨证治疗弱精症疗效满意,可明显提高a、a＋b级精子的数量,有提高精子活动力的作用。     

论奇恒之腑辨证

《中医诊断学》的辨证方法中,没有谈及奇恒之腑辨证,而奇恒之腑是属于臧象学说的内容.我作为30年前全国中医诊断学师资班的学员,首倡"奇恒之腑辨证",值此"朱文锋学术思想暨纪念全国中医诊断学师资班30周年学术研讨会"之际,为了完善脏腑辨证的内容,便于临床应用,再论奇恒之腑辨证,以供同道参考.脑、髓、骨、脉、胆、女子胞(男子精室)为奇恒之腑,髓、骨在肾病辨证、脉在心病辨证、胆在六腑病辨证中已讨论,故奇恒之腑辨证重在讨论脑、胞宫、精室病辨证.     

草类药材饮片的性状鉴别

草类药材饮片的性状鉴别是中药鉴定工作的难点,即使药材行业的老药工也常说“草类饮片难认”。笔者经多年实践,在这方面积累了一些经验和体会,简述如下,供同道参考。1草类药材饮片难以辨认的原因多数草类药干燥后,因失水收缩发生形态变化。如鱼腥草的茎鲜时为圆柱形,干后成为扁棱柱形,半边莲鲜时伸展,干后卷曲缠绕等。多数草类药干燥后质地酥脆,在切制、翻晒、包装、运输过程中,不断挤压、磨擦使植物器官组织破碎,失去原有特征。如仙鹤草表面密被毛茸,而饮片中却经常看不到;荆芥、益母草等药材的叶片常碎成粉末状,失去“深裂”的鉴别特征等…     

论以辨病为前提之《金匮要略》病证结合模式

重点阐述了《金匮要略》病证结合模式在理法方药诸方面的表现与特点；病种设立以特有的病理变化为分化原则；类别设置以病为划分标准；治疗法则确立以病为化生基础；以证为前提的效不更方原则、方由法出原则，据证用药原则，及与之相对应的以病为前提的阶段性治疗原则、一法多方原则、药因病别原则的结合共存，及预后转归立足于以病为判断前提等。     

生长分化因子5调控细胞分化机制研究新进展

生长分化因子5(GDF-5)属于转化生长因子β超家族,成熟的GDF-5含120个氨基酸残基,通过Smads介导和非Smads介导两种方式诱导目的基因,调控机体的骨骼、软骨等组织的生长发育和修复。近年来,又有研究发现GDF-5能够作用于脂肪来源的间充质干细胞,使其分化成骨、软骨、肌腱。此外,GDF-5在神经系统保护、心脏组织修复等方面的应用前景也越来越受到重视。     

辨证与辨病相结合治疗顽固性黄疸

论述周道红主任医师在中医辨证遣方的基础上配合辨病用药治疗顽固性黄疸的学术经验。主张辨证论治应立足脾胃，以治湿为本；久病又当活血化瘀，疏通经络。辨病用药则以病因病理为依据，在对症方药中酌加经现代药理及临床研究证实对改善胆红素代谢确有疗效的中药。并强调合理饮食对消退黄疸、巩固疗效的重要作用。     

异位妊娠的辨证施护

目的：探讨如何提高异住妊娠患者的治愈及抢救成功率。方法：对120例异位妊娠患者的急救治疗及护理措施进行回顾性分析和总结。结果：经急诊抢救后,行手术治疗者76例,经中西医结合保守治疗者44例,所有病例均痊愈出院。结论：对不同证型异位妊娠患者实施辨证施护,可使患者转危为安。     

口腔溃疡的中医辨治

口腔溃疡是指以周期性反复发作为特点的口腔黏膜局限性溃疡性损害。提出临床辨证应辨脏腑,从三焦定位;治疗时应分实火、虚火,参合辨证辨病,提倡内外治联用。