Muse细胞体外诱导为神经前体细胞的初步研究

【目的】 从成人骨髓中分离出Muse细胞,体外诱导成神经前体细胞,为细胞移植修复神经系统损伤提供种子细胞。 【方法】 利用密度梯度离心和差速贴壁法从健康成人骨髓中分离、培养骨髓基质干细胞,通过免疫荧光细胞化学技术和流式细胞仪技术对其进行鉴定;体外扩增、传代6次后利用Muse细胞特征性的SSEA-3/CD105分子表型阳性,通过流式细胞仪从骨髓基质干细胞中分选出Muse细胞并进行体外培养,观察其干细胞成球特性;对Muse细胞进行胰蛋白酶孵育,分析其应激耐受能力;利用免疫荧光细胞化学技术和RT-PCR技术检测Muse细胞的多能干细胞标记物表达情况;通过在培养基中添加成纤维细胞生长因子、表皮生长因子等对Muse细胞向神经前体细胞方向进行体外诱导,观察神经前体细胞的干细胞成球情况,利用免疫荧光细胞化学技术和RT-PCR技术对其进行表型鉴定并观察神经前体细胞标记物的表达情况。 【结果】 从成人骨髓中分离出骨髓基质干细胞,免疫荧光细胞化学检测和流式细胞仪检测结果显示CD90表达阳性、CD45和CD11b表达阴性;通过流式细胞仪从骨髓基质干细胞中分选出约0.5%的Muse细胞进行培养,细胞聚集成球,悬浮生长,表现为胰蛋白酶耐受;免疫荧光细胞化学检测和RT-PCR检测结果显示Muse细胞表达多能干细胞标记物Nanog、Oct4、Sox2阳性;体外诱导Muse细胞向神经前体细胞方向分化,观察到细胞成球现象,免疫荧光细胞化学检测和RT-PCR检测结果显示诱导后细胞表达神经前体细胞标记物nestin、βIII-tubulin。 【结论】 从成人骨髓中成功分离出Muse细胞,具有多能干细胞特性,经体外诱导形成神经前体细胞,为以后组织工程移植修复神经损伤提供新的种子细胞。     

人骨髓间质干细胞体外培养及诱导成骨的鉴定

目的 优化人骨髓间质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)体外分离培养方法,对hBMSCs体外培养及诱导成骨能力进行鉴定.方法 密度梯度离心法分离hBMSCs,流式细胞分析法(FACS)对细胞表面抗原、细胞活力、细胞周期进行检测.以含地塞米松(1×10-7 mmol/L)、β-甘油磷酸钠(10 mmol/L)、抗坏血酸(35.22 mg/L)的DMEM培养液对hBMSCs进行诱导分化,相差显微镜和透视电镜观察细胞形态,Gomori钙钴法进行碱性磷酸酶染色(ALP),免疫组化检测Ⅰ型胶原,茜素红法进行钙结节染色.结果 hBMSCs可在体外分离扩增,表达CD44、CD105和CD106,不表达CD34和CD45,细胞活力为92.3%,G0-G1细胞占94.2%.经成骨培养液诱导后细胞形态由长梭形向多边形转变,ALP染色、Ⅰ型胶原染色及钙结节染色均为强阳性.结论 hBMSCs可在体外长期、稳定培养,具有向成骨细胞分化的潜能.     

基因芯片分析釉基质蛋白对hBMSCs基因表达谱的影响

目的应用基因芯片技术分析釉基质蛋白(EMPs)对人骨髓基质细胞(hBMSCs)基因表达谱的影响。方法全骨髓法体外传代培养hBMSCs。以200μg/mLEMPs刺激hBMSCs作为实验组,以正常培养的hBMSCs作为对照组。培养5d后,选择含4096种人类基因的cDNA基因芯片进行检测和分析。运用实时PCR方法对呈差异表达基因中的4条进行扩增和检测,以验证基因芯片分析结果。结果hBMSCs经EMPs刺激后,有27条差异表达基因,其中18条基因表达上调,9条基因表达下调。经实时PCR检测的4条差异表达基因结果与基因芯片结果一致。结论应用基因表达谱芯片可筛选经EMPs诱导后hBMSCs的差异表达基因。为进一步研究EMPs促进牙周组织再生的分子学机制奠定了基础。     

基因芯片分析釉基质蛋白对hBMSCs基因表达谱的影响

目的 应用基因芯片技术分析釉基质蛋白(EMPs)对人骨髓基质细胞(hBMSCs)基因表达谱的影响.方法 全骨髓法体外传代培养hBMSCs.以200 μg/mL EMPs刺激hBMSCs作为实验组,以正常培养的hBMSCs作为对照组.培养5 d后,选择含4 096种人类基因的cDNA基因芯片进行检测和分析.运用实时PCR方法对呈差异表达基因中的4条进行扩增和检测,以验证基因芯片分析结果.结果 hBMSCs经EMPs刺激后,有27条差异表达基因,其中18条基因表达上调,9条基因表达下调.经实时PCR检测的4条差异表达基因结果与基因芯片结果一致.结论 应用基因表达谱芯片可筛选经EMPs诱导后hBMSCs的差异表达基因.为进一步研究EMPs促进牙周组织再生的分子学机制奠定了基础.     

清脑灵诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化成神经元样细胞

目的观察清脑灵煎剂是否能诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化成神经元样细胞。方法通过贴壁法分离获得大鼠骨使髓间充质干细胞,体外扩增培养,用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达。用浓度为1mg/mL的清脑灵煎剂诱导MSCs,分别于5h、12h、1d、3d、7d在倒置显微镜下观察细胞形态变化,用免疫细胞化学方法观察被诱导细胞巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果流式细胞仪检示MSCs不表达CD11b、CD45,诱导后细胞的免疫细胞化学示nestin阳性细胞、NSE阳性细胞和GFAP阴性细胞。结论清脑灵能诱导MSCs分化神经元样细胞。     

人羊膜间充质细胞的分离培养及向胰岛样细胞诱导分化

目的分离培养人羊膜间质细胞(hAMCs),初步探讨其向胰岛样细胞的诱导分化。方法羊膜组织经胰蛋白酶消化去除上皮细胞后,采用胶原酶I联合中性蛋白酶的方法分离hAMCs。细胞免疫荧光检测分离得到细胞表面标记Vimen-tin+,SSEA-4+表达;流式细胞仪检测CD29,CD90及CD34,CD45表达;RT-PCR检测ACTG2、ACTA2、MMP2、Cripto、Sox2、LEFTYA、nanog、Oct-4基因表达;添加诱导因子诱导hAMCs向胰岛样细胞分化。结果分离得到的hAMCs可体外长期传代,并保持稳定的遗传学特性;细胞表现vimentin+、SSEA-4+;CD29、CD90表达量分别为91.5%±9.93%和48.7%±9.47%;不表达CD34,CD45;表达ACTG2、ACTA2、MMP2和Cripto、Sox2、LEFTYA、nanog、Oct-4等基因。诱导后的细胞表达insulin、PDX1、ngn3、glucagon等基因,并表现insulin+。结论建立了人羊膜间充质细胞的分离培养方法;在体外可诱导分化为胰岛样细胞。     

胶质瘤U251细胞中CD133表达及干细胞特性分析

目的： 探讨CD133⁺细胞的生物学特性,分析CD133作为胶质瘤干细胞标记的可行性。方法： 利用免疫荧光染色检测U251细胞中CD133、巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶( NSE )、神经胶质细胞纤维酸性蛋白(GFAP)等蛋白表达,分析CD133⁺细胞与CD133^－细胞中巢蛋白、NSE、GFAP阳性细胞存在的差异。结果： U251中CD133⁺细胞比例为0.060±0.003,在CD133⁺细胞中,巢蛋白阳性细胞,NSE和GFAP阴性细胞比CD133^－中明显增多;在CD133^－细胞中,也存在巢蛋白阳性细胞,数目较CD133⁺中明显减少,相反巢蛋白阴性细胞,NSE和GFAP阳性细胞明显增多。结论： 胶质瘤U251细胞存在CD133⁺细胞,在CD133阳性和阴性细胞中,均存在干细胞样细胞,但是在CD133⁺细胞中此类细胞更多。     

WIP1对小鼠B细胞及T细胞发育的影响

目的研究WIP1基因对小鼠骨髓B细胞发育及胸腺T细胞发育的影响。方法流式细胞术测定小鼠骨髓B细胞及胸腺T细胞发育中各阶段的细胞比例。结果虽然WIP1缺失小鼠骨髓B细胞发育各阶段比例正常,但骨髓总体B细胞比例下降;WIP1基因敲除小鼠胸腺发育障碍,CD8/CD4双阴性细胞比例增高,CD8/CD4双阳性细胞比例降低。结论 WIP1基因在小鼠骨髓B细胞及胸腺T细胞的发育过程中起重要作用。     

转前强啡肽基因修饰人骨髓间充质干细胞株的建立

目的 建立前强啡肽(PDP)基因修饰的人骨髓间充质干细胞株并验证其可在体外增强细胞强啡肽的分泌.方法 本实验运用载体Ad5F35-PDP转染人骨髓间充质干细胞hBMSCs,获得分泌强啡肽的干细胞株(hBMSCs-PDP),以转染空载体的细胞(hBMSCs-空载体)和未转染的细胞hBMSCs作为对照,此3组细胞分别采用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD29、CD44、CD34、CD45的表达,免疫荧光法检测强啡肽的表达,RT-PCR法检测强啡肽mRNA的表达、Western Blot法测定强啡肽蛋白的分泌.结果 体外实验以流式细胞仪检测此3组细胞的表面标志物CD29、CD44表达均阳性,CD34、CD45表达均阴性且这3组细胞的表达差异比较无统计学意义(P＞0.05).与hBMSCs和hBMSCs-空载体比较,hBMSCs-PDP细胞株强啡肽mRNA的表达和强啡肽蛋白的表达均上调(P＜0.05).结论 本实验成功构建了前强啡肽基因修饰的人骨髓间充质干细胞,并证明转染后的细胞株hBMSCs-PDP可稳定分泌强啡肽并保留干细胞原有的特征表型.     

血管紧张素Ⅱ联合生长因子诱导人骨髓间充质干细胞分化为多巴胺能神经元

目的：观察血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ,AngⅡ）联合应用多种生长因子体外诱导人骨髓间充质干细胞（Human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs）向神经元和多巴胺神经元分化的潜能。方法：从正常人骨髓中分离单个核细胞并对hBMSCs进行纯化、鉴定;hBMSCs先经用碱性成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子预诱导,再用胶质细胞源性神经营养因子（Glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF）和AngⅡ联合诱导生长良好的hBMSCs向神经元分化。倒置显微镜观察hBMSCs分化过程中细胞形态的变化;RT-PCR方法检测诱导前后hBMSCs神经干细胞的标记物巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（Neuron-specific enolase,NSE）、神经胶质细胞的特异性标记物酸性纤维蛋白（Glial fibrillary acidic protein,GFAP）以及多巴胺能神经元特异性标记物酪氨酸羟化酶（Tyrosinehydroxylase,TH）等标志物的表达情况;免疫荧光法检测诱导前后hBMSCs的NSE、TH和GFAP蛋白表达情况。结果：流式分析获得了高纯度的hBMSCs。在不同浓度的AngⅡ诱导2周后,倒置显微镜观察hBMSCs,具有典型神经元细胞形态,大多呈双极、多极和锥形; Nestin、NSE、TH的基因mRNA表达量,诱导组相较于对照组,有显著性差异（P<0.05）;免疫荧光细胞化学检测结果表明诱导分化后表达NSE、Nestin、TH蛋白的细胞数明显增加（P<0.05）,但诱导前后的细胞都不表达GFAP基因。结论：多种生长因子联合AngⅡ可以在体外诱导hBMSCs分化为多巴胺能神经元样细胞。     

以STO细胞和hELF作为胚胎生殖细胞培养饲养层的比较

目的:比较以STO细胞和人胚胎肺成纤维细胞(hELF)作为饲养层对人胚胎生殖嵴细胞(EG)生长的影响以及经丝裂酶素C处理后的两种饲养层的变化.方法:分离、培养3～4 mo hELF,观察经丝裂酶素C处理STO细胞和hELF后形态学变化,以STO细胞和hELF作为饲养层培养人EG细胞,计数EG细胞集落的形成率以及免疫组化检测EG细胞表面标志物抗阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1)和抗阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4).结果:经丝裂霉素C处理后hELF较STO细胞生存时间明显长,形态维持更好;以hELF和STO细胞作为饲养层培养人EG细胞,集落形成率没有明显差异;两种饲养层上形成的集落免疫学特征无明显差异.结论:在培养人EG细胞时,hELF饲养层较STO细胞饲养层更有优势.     

依达拉奉联合表皮生长因子诱导人骨髓间充质干细胞神经元样细胞分化中端粒酶活性的变化

目的观察依达拉奉联合表皮生长因子（EGF）诱导人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）神经元样细胞分化过程中端粒酶活性的变化。方法依达拉奉联合EGF诱导hBMSCs,观察其形态变化。免疫细胞化学法检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达,采用TRAP-ELISA和Western blotting分别检测诱导后hBMSCs端粒酶活性及端粒酶逆转录酶（TERT）变化。结果经诱导后,hBMSCs呈典型神经元样细胞分化,NSE阳性率为81.7%,GFAP阳性率为8.5%。端粒酶活性和TERT蛋白诱导4h后均无明显变化,但诱导6h后细胞端粒酶活性明显降低,诱导至24h时,细胞端粒酶活性已近阴性。Western blotting试验的结果与细胞端粒酶活性的改变一致。结论依达拉奉联合表皮生长因子体外可以诱导hBMSCs分化为神经元样细胞,端粒酶活性在诱导分化早期呈高表达,分化过程中逐渐降低直至消失。     

体外诱导人胚胎干细胞定向分化为神经干细胞

目的:探讨体外定向诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法.方法:模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境,分三阶段诱导hESCs定向生成NSCs.形态学观察结合免疫荧光细胞化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志和神经干细胞标志;NSCs分化实验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测.结果:体外培养的hESCs在胚胎成纤维细胞饲养层上连续传代培养50代,仍保持SSEA-4,TRA-1-81阳性,表达Nanog基因,流式细胞术检测SSEA-4阳性表达率为83.44%;经三步法最终可诱导形成纯度高达90%以上的nestin阳性细胞,表达nestin基因,流式细胞术检测nestin阳性表达率为89.38%;诱导生成的细胞反复传代,仍表现为nestin阳性,并可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞.结论:模拟体内神经分化过程的三步诱导法,可诱导hESCs生成较高纯度的NSCs,并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力.     

人原始生殖细胞的迁移及表面标志物变化的实验研究

目的探讨人胚胎原始生殖细胞向生殖嵴迁移及其细胞标志物改变.方法人胚生殖嵴或生殖腺经石蜡切片;HE染色,光镜观察;免疫组化方法检测阶段特异性胚胎抗原SSEA-4和SSEA-1的表达;钙-钴法检测碱性磷酸酶(AP)活性;RT-PCR检测4.5、7、9、11周人胚胎生殖嵴中转录因子Oct-4的表达.结果人胚胎第4.5周生殖嵴未见有碱性磷酸酶、阶段特异性胚胎抗原SSEA-4、SSEA-1阳性细胞,且不表达转录因子Oct-4;第5～11周胚胎生殖嵴中持续存在碱性磷酸酶、阶段特异性胚胎抗原SSEA-4、SSEA-1阳性细胞,且表达转录因子Oct-4;第12周胚胎生殖嵴中阶段特异性胚胎抗原SSEA-4、SSEA-1阳性细胞数量明显减少,但存在碱性磷酸酶阳性细胞.结论人胚胎原始生殖细胞自第5周后开始迁移至生殖嵴,直至第11周后完全分化,其形态学特征为碱性磷酸酶、阶段特异性胚胎抗原SSEA-4、SSEA-1阳性,且表达转录因子Oct-4.     

Par-4基因沉默对人骨髓间充质干细胞中Smac基因表达和半胱氨酸蛋白水解酶3酶活性的影响及其抗凋亡作用

目的 研究Par-4基因沉默对人骨髓间充质干细胞(hBMSC)中Smac基因表达和半胱氨酸蛋白水解酶(Caspase)3酶活性的影响及其抗凋亡作用.方法 原代培养hBMSC.谷氨酸诱导hBMSC凋亡.设计和合成两对针对Par-4基因mRNA的小RNA干扰(siRNA)序列(Par-4-SiRNA-1、2),构建真核细胞表达载体,用脂质体介导转染hBMSC,利用G418筛选稳定表达细胞株.实时荧光定量PCR法检测Par-4 mRNA表达水平.流式细胞术测定细胞凋亡百分率.Western印迹测定Smac蛋白表达量.比色法测定Caspase-3酶的活性.结果 设计的Par-4-SiRNA-1、2可显著诱导hBMSC中Par-4基因沉默,Par-4 mRNA水平分别被降低88%、67%,谷氨酸诱导hBMSC凋亡,凋亡百分率为(58.9±8.9)%.Par-4-SiRNA-1可显著拮抗谷氨酸的诱导凋亡作用,凋亡百分率降为(37.2±6.3)%(F=58.26,P＜0.01).Par-4-SiRNA-1对谷氨酸诱导的hBMSC中Smac蛋白表达上调(P＜0.01)和Caspase-3酶活性上调(P＜0.01)有显著的抑制作用(P＜0.01).结论 Par-4基因沉默能拮抗谷氰酸对hBMSC凋亡的诱导作用.其机制可能与Smac基因表达和Caspase-3酶活性被抑制有关.     

淫羊藿素诱导小鼠胚胎干细胞体外定向分化为神经细胞

目的:采用淫羊藿素(icaritin,ICT)改变小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)体外培养微环境,论证ICT提高ES细胞体外定向分化为神经细胞的效应。方法:采用拟胚体培养法,评价ICT对ES细胞体外定向分化为神经细胞的诱导作用;并利用RT-PCR法和免疫荧光法鉴定神经细胞特异基因和蛋白表达谱。结果:ICT在10-7mol/L浓度时,对ES细胞定向分化为神经细胞表型呈现最佳诱导效应,在分化d8 8时,分化率高达80%(P<0.001),并呈良好的量效和时效关系。分化神经表型者表达神经元特异性微管蛋白(β-tubulin Ⅲ)基因和神经胶质细胞特异性胶质纤维酸性蛋白(GFAP)基因,同时伴有神经前体细胞特异性标志蛋白(nestin)及β-tubulin Ⅲ和GFAP特异性蛋白阳性表达。结论:应用拟胚体培养微环境调控法,ICT可诱导小鼠ES细胞定向分化为神经细胞,并与神经发育依赖性特异基因和蛋白表达呈正相关。     

高糖环境下FGF-21对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的 研究高糖环境下成纤维细胞生长因子21(FGF-21)对人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）骨向分化的作用及其机制。方法 取健康成人骨髓,分离培养hBMSCs,成骨、成脂诱导分化后,茜素红、油红O染色鉴定,流式细胞仪检测第3代细胞表面标志物CD105、CD90、 CD73和CD44水平。将hBMSCs分为对照组〔以葡萄糖（Glu）浓度5.5 mmol/L模拟正常生理状态糖浓度〕,Glu A、B、C高糖浓度梯度组（Glu 16.5、25、40 mmol/ L）,FGF-21干预组(Glu 5.5 mmol/ L+ FGF-21),高糖环境FGF-21干预组(Glu B+FGF-21)和Glu B+FGF-21干预+细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK) 信号转导阻断剂（包括PD98059、SP600125、SB203580）组。成骨诱导第14天,检测碱性磷酸酶（ALP）活性;成骨诱导第21天,以RT-PCR检测骨向分化的相关因子ALP、骨钙素（OCN）、Runx2的mRNA水平,以Western blot检测MAPK通路中细胞外信号调节激酶(ERK1/ 2)、P38丝裂原活化蛋白激酶(P38)、c-Jun 氨基末端激酶(JNK)蛋白磷酸化水平。结果 ①分离培养得到的hBMSCs成骨、成脂诱导后茜红素、油红O染色阳性,hBMSCs被成功地诱导向成骨细胞（OB）和脂肪细胞分化。流式细胞仪鉴定为hBMSCs。②与对照组相比,高糖组的骨向分化标志物ALP、OCN、Runx2的mRNA水平明显增加,MAPK通路中ERK、P38、JNK磷酸化水平表达增加。③与Glu B组相比,Glu B+FGF-21组的ALP、OCN、Runx2的mRNA水平降低,ERK、P38和JNK的磷酸化水平降低。④与Glu B+FGF-21组相比,Glu B+FGF-21+MAPK信号转导阻断剂组的ALP、Runx2的mRNA水平进一步降低,且相应的ERK、JNK和P38及其磷酸化水平进一步降低。结论 高糖能促进hBMSCs的骨向分化。高糖环境下FGF-21具有抑制hBMSCs的成骨分化或矿化作用。     

间充质干细胞定向成骨细胞分化的蛋白质组学分析

目的:探讨用蛋白质组学方法分析人骨髓间充质干细胞(MSCs)定向成骨细胞诱导分化中细胞蛋白表达谱的改变. 方法: 从人骨髓细胞中分离获得MSCs,经细胞表型及多向分化能力测定鉴定MSCs的纯度和功能后,采用定向成骨细胞分化诱导培养体系,于分化后14 d分别提取未分化细胞及分化后细胞的总蛋白,双向电泳分析,确定蛋白差异点,经酶切后行蛋白肽质量指纹谱鉴定差异蛋白表达. 结果: 双向电泳找到38个蛋白差异点,质谱分析鉴定出23个差异蛋白分子表达. 结论: 用蛋白质组学方法可高通量筛选与MSCs定向诱导成骨细胞分化相关的重要蛋白.     

人骨形态发生蛋白-2腺病毒表达载体转染人骨髓基质干细胞及对其增殖的影响

目的 :用人骨形态发生蛋白 - 2腺病毒表达载体 ( Ad- BMP- 2 )转染人骨髓基质干细胞( h BMSC) ,以探讨基因转染对 h BMSC增殖的影响。方法 :将 Ad- BMP- 2转染体外培养的成人骨髓基质干细胞 ,利用免疫组化、原位杂交染色方法检测细胞内骨形态发生蛋白 - 2 ( BMP- 2 )的表达 ,蛋白印迹法检测转染后细胞培养液中 BMP- 2分泌蛋白表达。然后通过流式细胞仪分析其对细胞增殖的影响。结果 :转染后 ,h BMP- 2基因在 m RNA水平和蛋白水平均有表达。蛋白印迹法检测到培养液中有 BMP- 2蛋白阳性表达。转染 h BMP- 2基因后 ,细胞经流式细胞仪分析 ,S期细胞比例增多 ,说明细胞 DNA的合成增加。结论 :Ad- BMP- 2可高效转染 h BMSC,且促进细胞增殖