肺结核继发真菌感染患者分离真菌的基因检测与鉴定的研究

目的探讨肺结核继发真菌感染患者分离致病性真菌的基因鉴定及其类型。方法采集80例肺结核患者的下呼吸道分泌物标本,接种科玛嘉（Chrom）琼脂平板、置温箱内28℃培养48～72h。分离的真菌分别以常规真菌学方法、PCR扩增核糖体基因转录间隔区（ITS）序列和25SrDNAⅠ型内含子序列进行鉴定。结果分离的99株真菌含78株酵母菌（78.8%）和21株霉菌（21.2%）。78株酵母菌的ITS基因鉴定法与生物学鉴定法的符合率为83.3%;21株霉菌ITS基因鉴定法与生物学鉴定法符合率为71.4%。99株真菌的ITS基因鉴定法与生物学鉴定法总符合率为80.8%。49株白假丝酵母菌经25SrDNAⅠ型内含子基因鉴定分为3型,包括基因A型21株（40.8%）、基因B型14株（28.5%）以及基因C型15株（30.6%）,未发现基因D型与基因E型菌株。结论花都区肺结核患者病原性真菌感染常见为酵母菌,其中主要是白假丝酵母菌,基因型为A型。检测ITS序列和25SrDNAⅠ型内含子序列有助于真菌感染的快速基因诊断和提高菌种鉴定的准确率。     

应用rDNA ITS测序检测海南岛条件致病性真菌

目的:应用内转录间隔区(ITS)引物建立一种较为敏感、特异检测和鉴定条件致病性真菌的方法,为进一步鉴定不同真菌的种、型的亲缘关系提供分子生物学依据。方法:用常规的真菌检验方法对76份口腔标本做初步鉴定,采用通用引物ITS1、ITS4对可疑真菌菌悬液进行PCR扩增,PCR扩增产物纯化、DNA测序,做序列比对分析。结果:ITS-PCR扩增出种特异的DNA条带,检测菌株76株,DNA测序鉴定出白假丝酵母菌53株(69.7%),其他真菌23株(30.3%)。结论:采用ITS引物测序法,可准确地检测出不同种的条件致病性真菌,并为进一步鉴定菌株的变异性,发现亚种提供基础。     

用锅柄聚合酶链反应法克隆卡地腐霉Pr1基因的未知片段

目的：分离和克隆灭蚊真菌卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因已知片段的3′端未知序列。方法：采用PANHANDLE PCR，以基因组DNA为模板，通过链内退火及延伸形成一个类似锅柄形状的结构，经嵌套式PCR扩增得到未知目的片段。通过已知cDNA片段设计引物，PCR扩增得到该蛋白酶部分基因组序列，采用限制性内切酶BamH Ⅰ消化卡地腐霉基因组DNA，经去磷酸化处理后，在消化片段3′端连接一段与卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因5′端已知序列互补的5′端磷酸化寡核苷酸链NA，经链内退火及聚合酶延伸形成一锅柄状结构。结果：获得一大小为876bp的PCR产物，经序列分析验证，该panhandle PCR产物包含了已知卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因3′端未知的853bp核苷酸序列。结论：这种特殊的PCR方法可以高度有效地克隆和鉴定已知片段两侧的未知基因片段。     

白假丝酵母ERG11基因突变分析

目的 探讨白假丝酵母氟康唑作用的靶酶编码基因(ERG11)突变与氟康唑耐药性的关系。方法 选择从尿道、阴道、口咽部、呼吸道、血液和前列腺液分离的10株氟康唑耐药白假丝酵母菌和3株敏感菌株,以抽提的白假丝酵母菌基因组DNA为模板,对ERG11基因序列进行PCR扩增,PCR产物直接DNA序列测定,最后应用BLAST和ClustalW软件对测序结果进行比较。结果 13株白假丝酵母菌的ERG11基因序列(以已知序列第1个ATG起始密码的A作为第1个记数单位)共有21个位点发生突变,其中17个同义突变位点和4个错义突变位点;在第348bp位点和第383bp位点,耐药菌株和药物敏感株均可发生D116E和K128T变异;在靶酶活性中心血色素结合区和疏水端螺旋区的对应基因片段,耐药株在第1309bp位点可致V437I变化;在第1320bp位点耐药菌株发生碱基突变,形成A、C基因杂合子,有可能导致N440K变化。结论 (1)ERG11基因的D116E和K128T位点变异可能与白假丝酵母菌耐药无关;(2)ERG11基因的V437I和N440K位点的改变,可能与耐药形成有关。     

人类Vimentin基因第1，2，6，7内含子序列的测定

目的 人vimentin(VIM）基因位于10号染色本短臂1区3带,属于第Ⅲ型中间丝纤维蛋白基因。目前已知全部外显子序列及部分内含子序列。本测定了部分未知的VIM基因内含子序列。方法 通过已知VIM基因的外显子序列设计引物,用PCR扩增其未知的内含子片段,将PCR产物进行克隆测序。结果 共测得未知的4个内含子序列,内含子1长692bp,测得其全部序列;内含子2长2kb,测得其两端与外显子相接的序列,共1kb;内含子6长456bp,测得其全部旬;内含子7长404bp,测得其全部序列。结论 本研究PCR检测多例人VIM基因的内含子7大小为404bp,与献报道人类vimentin基因的内含子7大小为800bp相差很大,但引物两端外显子序列相同,另外,献报道的人类vimentin基因与外显子3相邻的第2内含子末端41nt的核苷酸序列与本研究所测的第2内含子末端序列完全不同。     

人类Vimentin基因第1,2,6,7内含子序列的测定

[目的]人vimentin(VIM)基因位于10号染色体短臂1区3带,属于第Ⅲ型中间丝纤维蛋白基因.目前已知全部外显子序列及部分内含子序列,本文测定了部分未知的VIM基因内含子序列.[方法]通过已知VIM基因的外显子序列设计引物,用PCR扩增其未知的内含子片段,将PCR产物进行克隆测序.[结果]共测得未知的4个内含子序列,内含子1长692bp,测得其全部序列;内含子2长2kb,测得其两端与外显子相接的序列,共1kb;内含子6长456bp,测得其全部序列;内含子7长404 bp,测得其全部序列.[结论]本研究PCR检测多例人VIM基因的内含子7大小为404 bp,与文献报道人类vi-mentin基因的内含子7大小为800bp相差很大,但引物两端外显子序列相同.另外,文献报道的人类vimentin基因与外显子3相邻的第2内含子末端41nt的核苷酸序列与本研究所测的第2内含子末端序列完全不同.     

阴道白假丝酵母菌基因型与体外药物敏感性研究

目的 研究不同基因型阴道假丝酵母菌对克霉唑、咪康唑和制霉菌素的体外药物敏感性.方法 以特异引物PCR法(INT-PCR)对151株致病白假丝酵母菌进行基因分型,参考美国临床和实验室标准协会(CLSI)抗真菌药敏实验标准(M27-A方案)以微量稀释法检测不同基因型菌株的药物敏感性.结果 根据扩增条带中是否存在450 bp和840 bp片段可将白假丝酵母菌分为A、B、C 3种基因型;克霉唑和咪康唑对A基因型菌株的最小抑菌浓度(MIC)值明显高于C基因型菌株,差异有统计学意义(P＜0.05);制霉菌素对不同基因型菌株的MIC值间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 不同基因型白假丝酵母菌株对抗真菌药物的敏感性有明显差异,这种差异可能是临床上假丝酵母菌性外阴阴道炎治疗效果存在个体差异的原因之一.     

白假丝酵母菌25SrDNA基因分型与粘附力的相关性

目的 调查白假丝酵母菌25SrDNA基因型分布,并分析白假丝酵母菌各基因型与粘附力之间的相关性.方法 收集76株白假丝酵母菌,转沙保罗氏培养液纯培养24 h,裂解法提取基因组DNA,用特异性引物扩增白假丝酵母菌25SrDNA基因,根据PCR产物电泳图谱进行基因分型;分别测定各基因型粘附力.结果 PCR产物电泳结果显示76例白假丝酵母菌可分为A、B、C 3种基因型(其中A型48例,B型8例,C 型20例).测序结果显示,B型和C型产物比A型产物多出1个379 bp的序列(Ⅰ类内含子).根据有无内含子将菌株分为无内含子组(A型)和有内含子组(B型+C型),无内含子组粘附力明显强于有内含子组,两组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 白假丝酵母菌25SrDNA基因型与粘附力之间可能存在相关性,内含子的插入可能影响白假丝酵母菌的粘附力.     

散发性帕金森病α-synuclein基因突变的检测

目的探讨α-synuclein基因已知突变与散发性帕金森病人的关系.方法分离PD组和对照组的外围血基因组DNA,采用α-synuclein基因特异引物对其第四外显子进行PCR扩增,扩增产物用Tsp45Ⅰ酶切鉴定.结果两组PCR均可扩增出216bp的片段,PCR产物不能被Tsp45Ⅰ酶切.结论α-synuclein基因已知点突变与散发性帕金森病可能无明确关系.     

流感嗜血杆菌16S rRNA和p6基因PCR检测结果比较

目的 比较流感嗜血杆菌(Hi) 16S rRNA和p6基因的PCR检测结果的差异.方法 以Hi的16S rRNA基因及外膜蛋白p6基因作为靶基因,设计特异性引物分别对临床标本分离的43株Hi进行PCR快速检测. 结果 34株16S rRNA基因扩增出538bp大小DNA片段,检出率为79%;43株p6基因均扩增出296bp大小DNA片段,检出率为100%.同时,其他细菌对照株16S rRNA和p6基因扩增均未出现假阳性结果.结论 相比于16S rRNA基因,p6基因对Hi检测和鉴定更具特异性,可用于临床对Hi感染疾病的快速诊断和流行病学研究.     

Clinical Identification of Common Species of Dermatophytes by PCR and PCR-RFLP

Summary: To find a fast and efficient way of identifying seven common dermatophytes in clinical practice, we used the techniques of polymerase chain reaction (PCR) and PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP) targeting Topoisomerase Ⅱ gene. The DNA of 7 dermatophytes, along with Candida albicans, Aspergillus terreus and Aspergillus flavus were amplified by consensus primer dPsD1. They were then subjected to a second PCR with primers dPsD2 and species-specific primers PsT and PsME separately. 6 of the products generated by dPsD2 were digested with restriction enzyme Hinc Ⅱ. DNA fragments of 3390 bp and 2380 bp was amplified by using consensus primer dPsD1 and dPsD2 from the genomic DNA of each dermatophyte species separately. By combining the results of the two species-specific primer sets (PsT and PsME), all species of dermatophyte yielded unique sizes-set of PCR products expect for T. mentagrophytes and T. tonsurans.From the restriction profiles of Hine Ⅱ , 6 of the 7 dermatophytoses were diagnosed to species levelincluding T. mentagrophytes and T. tonsurans. By combining the results of the PCR and PCR-RFLP, the 7 common dermatophytes can be identified to species level. It is conclude that the multiplex PCR and PCR-RFLP identification targeting the DNA topoisomerase Ⅱ gene is rapid and efficient.     

不同产地何首乌的ITS序列研究

目的研究不同产地何首乌的ITS片段遗传差异性,分析该片段在何首乌道地性的DNA分子鉴别和野生资源品种的鉴定及种质资源研究中的意义。方法从来自不同原产地的何首乌中提取总DNA,以核基因组ITS通用引物为引物进行扩增,扩增产物经纯化后,用PCR产物直接测序法进行测序。结果各样品rDNA的ITS及5.8S rDNA完全序列,18S和26S rDNA部分序列,共约648bp,其中ITS1长度为195bp,5.8S长度为164bp,ITS2长度为189bp。序列间共有17个变异位点。结论ITS序列可对何首乌的道地性做出鉴别,对野生资源品种的鉴定具有较好的分辨性。     

丹参及鼠尾草属植物的rDNA ITS序列分析

目的研究丹参ITS片段遗传多样性,分析该片段在丹参药材DNA分子鉴别和鼠尾草属植物系统学研究中的意义。方法用一对引物进行PCR扩增,扩增产物纯化后用双脱氧终止法测序。结果获得核糖体DNA中ITS和5.8SrDNA完整序列,13个鼠尾草属植物ITS1与ITS2序列的长度分别为222～224bp、220～223bp。鼠尾草属植物种间ITS1序列差异百分率为0～12.16%,ITS2序列的差异百分率为0.5%～13.51%;丹参种内ITS1序列的差异百分率为0～0.9%,ITS2序列的差异百分率为0～0.5%;鼠尾草属各类群与外类群的差异百分率ITS1序列为16.07%～20.27%,ITS2序列为15.91%～20.27%。用邻接法(NJ)根据ITS1与ITS2序列数据建立系统发生树。结论两段序列在丹参种内保守,在属间有较大的差异,与外类群的差异最大,可作为中药丹参分子鉴定的标记,而鼠尾草属植物的系统发生关系尚须进一步研究。     

TaqMan 探针荧光定量PCR支原体快速检测方法的建立及应用

目的： 在支原体16SrRNA的种属特异性区域设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立荧光定量PCR方法,检测细胞培养物中支原体。方法：选择16srRNA支原体种属特异性区域作为扩增区,设计支原体通用引物,PCR扩增片段的预期大小为288 bp。回收PCR扩增产物,连接pMD-18T载体,转化JM109大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR鉴定后提取质粒。构建荧光定量PCR绝对定量的标准品,设计荧光定量引物、探针,采用矩阵法对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用十倍稀释法检验灵敏度并与普通PCR法及培养法进行比较;对支原体及其他5种革兰氏阳性杆菌进行特异性检验;对培养法、普通PCR法及荧光定量PCR法检测样本的灵敏度进行比较。结果：支原体PCR产物大小约为288 bp,质粒质量浓度为13.9 mg/L,A260/Ａ280 (Ratio)为1
.780,质粒溶液浓度为4.25×109拷贝/ μL。10 μmol/L的引物浓度和10 μmol/L-1探针浓度为最佳反应浓度,双温循环及60℃退火温度为最佳的循环条件。检测灵敏度为4.250×101 拷贝。拷贝数与Ct值之间的线性关系表达式：Ct= －2.916×log拷贝数+40.02。特异性检验中5种革兰氏阳性杆菌样本检测均为阴性,支原体样本为阳性,表明特异性好。准确性检测中变异系数小,表明稳定性好。组内及组间相同浓度样本检测具有相同的Ct值,表明重现性好。样本检验中,荧光定量PCR检测出的阳性样本高于普通PCR及培养法。结论：支原体荧光定量PCR法检测细胞样本及临床样本中支原体快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好。     

长江中下游地区菱属植物的DNA分子鉴别

目的 对野生菱和栽培菱种rDNA ITS片段进行分析，探讨该片段在两大群体中的系统学及鉴别研究意义。方法 对菱的rDNA ITS区进行了PCR扩增、测序，运用clustal、Mega 2．0等软件对ITs区进行序列分析鉴别。结果 获得rDNAI TS1、ITS2和5．8S rDNA完整序列，10个居群菱的ITS1与ITS2序列的长度分别为234～236 bp和220～221 bp，5．8S区均为164bp，不同居群的碱基差异为0．22％～2．94％。变异位点数为16个，信息位点数6个。用NJ法根据ITS序列数据构建系统发生树。结论 尽管菱属各居群间rDNA ITS的差异百分率较小，其亲缘关系较近，但根据ITS序列的特征可以很好地鉴别野生菱、栽培菱，菱属植物有可能都起源于同一种野生类居群。     

天麻ITS序列的聚合酶链反应扩增

目的:为天麻核糖体DNA中的内转录间隔区(internal transcribed spacer ,ITS)序列分析提供可靠、特异的聚合酶链反应(PCR)条件.方法:选择ITS序列通用引物对天麻ITS序列进行PCR扩增,对一系列PCR条件参数进行摸索,同时对PCR产物进行纯化后直接测序.结果:天麻ITS序列PCR扩增产物约为750 bp,不同来源样本存在有一定的差异.经测序后与Genebank中相关序列比对,天麻ITS序列总长度为598 bp,其中ITS1为235 bp,ITS2为209 bp,5.8S为154 bp,G C(%)为52%.结论:扩增天麻ITS序列的PCR反应条件可以得到可靠、特异的结果.     

Establishment of a multiplex PCR system to diagnose tuberculosis and other bacterial infections

BactirialinfectiousdiseasesareverycommoninchildrenofChina.Manysevereinfectionssuchaspu-rulentmeningitis,tuberculousmeningitisandsepsisstillthreatenchildren'shealthandeventheirlives.Bacterialcultureisaclassicmethedtodetectthepathogensofinfectiousdiseases,butithastotakeseveraldaysforgeneralbacteriaandeven4to8weeksfortuberclebacillus(Tb).ltcouldbringsomeperplexitiesfordoctorstodeterminetheeffectivetherapy.So,arapid,specificandsensitivemethodisrequiredfordiagnoslngbacterialinfections,speciallydif…     

Development of Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction for the Detection of Vibrio vulnificus Based on Hemolysin （vvhA） Coding System

Objective To establish a TaqMan real-time fluorescent quantitative PCR to detect Vibrio vulnificus based on the hemolysin gene （vvhA） coding cytolysin. Methods Primers and probes in the conserved region of the vvhA gene sequence were designed for the TaqMan real-time PCR to detect 100 bp amplicon from V. vulnificus DNA. Recombinant plasmid pMD19-vvhA100 was constructed and used as a positive control during the detection. Minimal amplification cycles （Ct value） and fluorescence intensity enhancement （ARn value） were used as observing indexes to optimize the reaction conditions of TaqMan real-time PCR. The TaqMan assay for the detection of Vbirio vulnificus was evaluated in pure culture, mice tissue which artificially contaminated Vibrio vulnificus and clinical samples. Results The established TaqMan real-time PCR showed positive results only for Vibrio vulnificus DNA and pMD19-vvhA100. The standard curve was plotted and the minimum level of the vvhA target from the recombinant plasmid DNA was 103 copies with a Ct value of 37.94±0.19, as the equivalent of 0.01 ng purified genomic DNA of Vibrio vulnificus. The results detected by TaqMan PCR were positive for the 16 clinical samples and all the specimens of peripheral blood and subcutaneous tissue of mice which were infected with Vibrio vulnificus. Conclusion TaqMan real-time PCR is a rapid, effective, and quantitative tool to detect Vibro vulnificus, and can be used in clinical laboratory diagnosis of septicemia and wound infection caused by Vibrio vulnificus.     

多重半巢式聚合酶链反应检测巨细胞病毒DNA多聚酶基因

目的：探讨多重半巢式聚合酶链反应（msnPCR)在研究巨细胞病毒（CMV）DNA多聚酶基因（UL-54）中的应用价值。方法：从8例心肺移植患者血标本中提取DNA,以CMV-UL54为模板,自行设计6条特异性引物,建立msnPCR扩增系统。扩增产物在DNA测序仪上自动测序。结果：msnPCR能扩增出427bp和1052bp两条目的片段,扩增产物测序表面存在导致氨基酸改变的碱基有义突变。结论：msnPCR扩增结合测序,可检测CMV-UL54的7个功能区目片段中的碱基突变,msnPCR比普通PCR更加省时和经济。     

人核糖体蛋白S13编码基因的克隆及其正反义真核表达载体的构建

目的：克隆人核糖体蛋白S13(RPS13)cDNA片编码区全长序列，构建其正、反义真核表达载体，以进一步研究RPS13基因与胃癌多药耐药的关系。方法：采用RT-PCR法扩增RPS13cDNA片段编码区全长序列，DNA重组技术构建其正、反义真核表达载体。结果：RT-PCR法成功扩增了RPS13cDNA片段编码区全长序列，经DNA序列分析，证实与文献报道的人RPS13编码区序列一致。目的基因分别按正、反两个方向亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1（ ），并经酶切鉴定证实。结论：成功克隆了人RPS13编码区全长基因序列，并构建了正、反义真核表达载体。