实时荧光定量PCR法检测人粪便中双歧杆菌方法的建立及评价 

目的：建立利用实时荧光定量PCR法检测人粪便中双歧杆菌浓度的方法,为检测人肠道内菌群浓度提供有效手段。方法：提取60例儿童粪便样本中细菌总DNA。选择细
菌种属的特异性基因16SrRNA作为扩增区,依据双歧杆菌的16SrRNA序列共设计3条引物,以常规PCR扩增出的16SrRNA部分基因片段制作标准品,应用SYBR Green Ⅰ双链嵌合染料,对连续稀释的标准品及待测样本进行分析,建立绝对定量的标准曲线,同时计算出待测样本双歧杆菌浓度;根据可检测到的标准品最低拷贝数计算反应灵敏度;分析PCR产物熔解曲线评价反应特异性;重复检测梯度稀释的标准品,用相同浓度标准品的Ct值变异系数（CV）评价反应稳定性。结果：常规PCR扩增出双歧杆菌16SrRNA部分基因片段长度约为613 bp,测序结果正确,成功构建了双歧杆菌实时荧光定量PCR反应中的标准品;生成的标准曲线R2=0.999,最低检测限度为每个反应1.48×102个拷贝;实时荧光定量PCR产物的熔解曲线为单峰。对待测样本分批进行荧光定量PCR检测,各组间每微升1.48×103~1.48×107个拷贝浓度标准品Ct值的变异系数为2.94%、3.39%、3.54%、3.08%和3.34%。60份儿童粪便样本双歧杆菌浓度对数值为7.77±0.86（拷贝数?g-1湿便）。结论：本研究所建立的实时荧光定量PCR法敏感性高、特异性强,且重复性好,适用于检测人粪便中双歧杆菌的浓度。     

人类mdr1基因新型Taq Man-MGB探针实时定量PCR检测方法的建立

目的建立一种比现有方法敏感、特异性高、重复性好的实时荧光定量PCR检测的新方法检测人类mdr1基因。方法以含有目的基因mdr1cDNA的质粒pHaMDR1/A为阳性模板,用Primerexpress2.0引物设计软件设计引物和TaqMan-MGB探针,建立荧光定量PCR检测方法。结果当待扩增DNA浓度在3.601×103cps/ml～3.601×109cps/ml范围时,模板浓度与循环阈值(Ct)之间的相关性良好,相关系数r2大于0.98。结论应用TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR方法检测人类mdr1基因,具有灵敏度高、特异性高和精确度高等优点,可作为进一步研究人类mdr1基因的方法。     

新型Taq Man-MGB探针实时荧光定量PCR检测人类mdr1基因

目的建立一种比现有方法敏感、准确性高、重复性好的人类mdr1基因的新型实时荧光定量PCR检测新方法。方法用Primer Express 2．0引物设计软件设计引物和MGB探针,以Taq Man-MGB探针技术为基础,运用Taq Man-MGB探针,以含有目的基因mdr1cDNA的质粒pHaMDR1／A为阳性模板,建立实时荧光定量PCR检测方法。结果所建立方法的最低检测限度为15个基因拷贝／反应,在待扩增DNA浓度为3．061×103 cps／ml-3．061×109cps／ml范围时,模板浓度与循环阈值(Ct)之间的相关性良好,决定系数r2为0．988243。结论应用Taq Man-MGB探针的实时荧光定量PCR方法检测人类mdr1基因,具有灵敏度高、特异性高和精确性高等优点。     

α变形菌纲磁螺菌属TaqMan探针实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的建立一种快速有效检测环境中α变形菌纲磁螺菌属细菌的方法。方法本研究以α变形菌纲磁螺菌属保守且特异的16SrRNA片段为靶序列,化学合成基因序列,制备重组质粒作为磁螺菌属检测的标准品;用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术,针对目的片段基因设计特异性引物和TaqMan荧光探针,进行实时荧光定量PCR检测,运用统计学方法评价该方法的特异性、敏感性及重复性。结果本实验成功构建了质粒PUC19-QC,引物、探针特异性良好,标准曲线在5.10×101~5.10×107拷贝数之间具有较好的线性关系,相关系数R2=0.999。该法最低可检测到5.10×10个DNA拷贝数,灵敏度明显高于普通PCR;重复性试验表明,荧光定量PCR检测结果 Ct值波动范围较小,Ct值的标准差均小于0.23,表明该法重复性好,可靠性高。析因方差分析表明不同稀释度之间的Ct值差异有统计学意义(F=3 125.305,P0.001),三个批次的再现性良好,差异无统计学意义(F=0.057,P=0.945),而浓度分组与时间之间也无交叉效应(F=0.533,P=0.873)。结论本实验所建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测技术,能够快速有效地检测α变形菌纲磁螺菌属细菌,且检测结果稳定,受外界条件如时间、气温等影响小。     

单核细胞增生李斯特菌hlyA基因实时荧光PCR的建立与研究

目的建立单核细胞增生李斯特菌hlyA基因TaqMan探针实时荧光PCR,用于食品卫生检验的快速筛查。方法根据单核细胞增生李斯特菌hlyA基因设计特异的引物与TaqMan探针,建立和优化实时荧光PCR反应体系,评估其特异性、灵敏度、稳定性,并在食品卫生检验中与细菌分离方法同步应用比较。结果建立了单核细胞增生李斯特菌TaqMan探针实时荧光PCR反应体系,经优化其最佳退火/延伸的温度为58°C,25μL反应体系中上、下游引物和探针最佳终浓度配比分别为0.7、0.7、0.4μmol/L;该实时荧光PCR反应体系可在35 min内完成检测,与沙门菌、绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌等16种非目标菌无交叉反应,对阳性克隆质粒的检测下限可达100拷贝/μL的稀释梯度,对同一核酸浓度样本20次检测的Ct值变异系数为0.46%;在对120份食品安全风险监测标本的快速检测应用中,6份标本单核细胞增生李斯特菌实时荧光PCR扩增阳性,从相应样本中分离出6株单核细胞增生李斯特菌,实时荧光PCR与分离培养方法检测结果相一致。结论针对单核细胞增生李斯特菌hlyA基因建立的TaqMan探针实时荧光PCR具有快速、特异、灵敏、稳定等优势,可用于食品卫生检验中单核细胞增生李斯特菌的快速、高效筛查。     

新型MGB探针特异性检测变形链球菌

目的:设计一种新型TaqManMGB探针,利用实时荧光定量PCR检测变形链球菌,提高PCR法检测变形链球菌的特异性,减少检测的假阳性。方法:提取6种不同链球属细菌的DNA,分别进行巢式PCR和TaqManMGB实时荧光定量PCR,比较两种PCR方法检测变形链球菌的特异性。巢式PCR第1轮扩增的引物是细菌16S rRNA基因通用引物,第2轮扩增使用变形链球菌16S rRNA基因可变区序列的特异性引物。TaqManMGB实时荧光定量PCR的引物与第2轮巢式PCR特异性引物相同,设计的MGB探针序列与变形链球菌16S rRNA基因中特异性序列相匹配,不与其他细菌的基因序列匹配。将变形链球菌标准株的DNA样本从2.5 mg/L至0.16μg/L按5倍梯度稀释,制备出实时荧光定量PCR的标准曲线。结果:变形链球菌和格氏链球菌在巢式PCR中均扩增出282 bp的DNA片段,出现假阳性结果。TaqManMGB实时荧光定量PCR能定量检出变形链球菌标准株和临床株,不检出其他链球菌,比巢式PCR特异性更好。TaqManMGB实时荧光定量PCR对变形链球菌DNA的最低检出浓度为20μg/L。结论:本研究设计出一种针对变形链球菌的TaqManMGB探针,建立利用TaqManMGB实时荧光定量PCR特异性检测口腔中变形链球菌的方法。     

检测肺炎支原体的实时荧光PCR方法的建立

目的 采用Taqman探针技术,组建肺炎支原体荧光PCR基因检测方法.方法 对GenBank登录的肺炎支原体的基因序列进行生物信息学分析.针对16s核糖体蛋白基因的保守区域设计引物和探针,组建实时荧光PCR方法检测.采用流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒进行特异性评价.采用倍数稀释的方法进行灵敏度的评价.对来自南方医院的522份临床咽拭子样本进行检测.结果 用实时荧光PCR方法检测甲型流感病毒(甲型、乙型)、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒均无特异性反应.该方法可以检测出稀释浓度约为103/mL的肺炎支原体样本.对本院的临床样本检出39份.结论 实时荧光PCR检测肺炎支原体具有较高的特异性和灵敏度,可用于肺炎支原体感染的诊断.     

应用MGB探针检测人丙型肝炎病毒的基因型

目的检测血浆或血清样本中人丙型肝炎病毒（HCV）的基因型,建立了基于MGB探针的实时荧光定量PCR检测体系。方法在HCV基因组型特异性碱基的聚集区域设计荧光定量PCR引物及探针,为保证特征特异性及高分辨率,选择设计MGB探针,然后将PCR扩增的产物先进行基因克隆,而后制备病毒样颗粒做为阳性质控品,从而建立完整的MGB探针法的荧光定量PCR检测体系,最后对该检测体系进行方法学评价。结果成功建立了基于MGB探针的HCV荧光定量PCR的基因分型检测体系。方法学评价显示,该检测体系的灵敏度达100IU/mL;重复性好;特异性良好,以多种血浆病毒的核酸样品为模板进行检测时结果全为阴性。结论本研究建立基于MGB探针的HCV荧光定量PCR的基因分型检测方法,可定性检测血浆或血清样本及血液制品中的人丙型肝炎病毒HCV的基因型及含量,对于该疾病的研究及临床治疗都具有重要的意义。     

CAR菌TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用研究

目的 建立特异、敏感、快速检测CAR菌的TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法。方法 针对CAR菌16S rRNA基因序列设计特异性引物和探针,建立MGB探针荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性。对2008~2012年期间采集的1344份临床标本中的CAR菌进行检测,同时进行普通PCR检测作为对照。结果 CAR菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有高度特异性,与肺炎支原体、侵肺巴斯德菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希氏菌、肺炎链球菌间无交叉反应,检测灵敏度达2.7拷贝。标准曲线显示各浓度范围内具有良好线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.22,TaqMan MGB探针荧光定量PCR效率为104.432%。对1344份标本进行检测,结果TaqMan MGB探针荧光定量PCR检出510份CAR菌阳性样本。TaqMan MGB探针荧光定量PCR能够直接从标本中检出CAR菌DNA,检测时间仅为40分钟。结论 TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有可靠、特异、敏感的特点,适用于CAR菌的快速检测。     

一步法实时荧光定量PCR检测白血病WT1基因mRNA

目的 构建RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因mRNA表达的方法,准确定量检测白血病患者微小残留病,指导临床判断预后和早期预测复发.方法 从K562细胞提取的RNA用特异性引物扩增WT1基因,pMD18-T载体克隆法构建荧光定量PCR标准模板,建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测wTl基因方法,并对该方法的灵敏度、重复性和稳定性进行检测.结果 构建的RT-PCR一步法实时荧光定量PCR方法的灵敏度达10-4水平:以拷贝数为1.0x106～1.0×102 cps/ml的标准品,分别进行RT-PCR一步法实时荧光定量PCR扩增后,标准品的Ct值与该标准品模板起始浓度的对数存在线性关系,r值达0.998:管间和批间的变异系数均小于8%.结论 所建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因方法的灵敏度、重复性和特异性好;RT和PCR反应过程一步完成,更简便快捷,减少加样和污染机会,更适合临床检测.     

博尔纳病病毒荧光定量套式RT-PCR检测方法的建立

目的：建立博尔纳病病毒(BDV)荧光定量套式RT-PCR检测方法，为快速、准确地定量检测BDV奠定基础。方法：根据BDV P24基因序列，设计并合成引物和荧光标记探针。将PCR扩增的BDV P24基因片段克隆入载体，重组质粒经筛选、鉴定后，作为阳性模板，用于标准曲线的制定和样品检测。结果：应用量组质粒制作的定量曲线循环阈值与模板具有良好的线性关系，相关系数为0．998，建立了检测BDV的荧光定量套式RT-PCR方法。检测58例神经精神病患者及50例健康人外周血单核细胞(PBMC)中BDV P24基因片段，3例精神分裂症及1例帕金森病患者呈阳性，其余均为阴性。结论：荧光定量套式RT-PCR方法能够避免PCR后处理导致的假阳性污染，并实现准确定量，对于研究BDV感染与人类神经精神疾病的关系有很好的应用价值。     

结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法的建立与应用

目的建立结核分枝杆菌的荧光定量PCR检测方法，探讨荧光PCR检测痰标本中结核分枝杆菌的应用价值。方法根据结核分枝杆菌基因保守序列设计引物和探针，并构建标准品。对102例培养涂阳的结核痰液标本和45例非结核感染者的痰标本，应用荧光定量PCR法、痰涂片抗酸染色法检测结核分枝杆菌。结果荧光定量PCR、抗酸染色法检测结核分枝杆菌的特异性分别为100％、30％。结论荧光定量PCR是一种快速、敏感性高、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法，具有重要的应用价值。     

生殖支原体16SrRNA基因和MgPa基因TaqMan荧光聚合酶链反应检测的比较研究

目的  对生殖支原体（Mg）16SrRNA基因和MgPa基因TaqMan荧光聚合酶链反应（PCR）检测结果进行比较,选取敏感度更高的靶基因进行TaqMan荧光PCR检测。方法  选取Mg 16SrRNA基因和MgPa基因为靶基因,根据已报道文献设计合成特异性扩增引物和探针,对泌尿生殖道拭子标本进行TaqMan荧光PCR检测,对Mg不同靶基因TaqMan荧光PCR检测结果进行统计学分析。结果  Mg 16SrRNA基因TaqMan荧光PCR检测敏感性为90%,MgPa基因TaqMan荧光PCR检测敏感性为97.5%。结论  MgPa基因TaqMan荧光PCR敏感性要高于16SrRNA基因TaqMan荧光PCR。

     

RNA恒温扩增法在肺炎支原体检测中的应用

目的 探讨RNA恒温扩增法检测肺炎支原体的可行性及其应用价值.方法 采集2016年5~7月在我院住院治疗的200例患急性呼吸道感染儿童咽拭子,分别用RNA恒温扩增法和PCR荧光探针法进行肺炎支原体检测,分别计算两种检测方法的检出率,根据公式计算灵敏度和特异性,并进行统计学分析.结果 RNA恒温扩增法检出肺炎支原体17例,检出率为8.5%,PCR荧光探针法检出肺炎支原体18例,检出率为9.0%,两种方法的检出率比较差异无统计学意义(P>0.05);RNA恒温扩增法与PCR荧光探针法相比灵敏度为88.9%、特异度为99.5%.结论 RNA恒温扩增法与PCR荧光探针法检出率相当,具有较高的灵敏度和特异度,可以作为一种新的方法用于肺炎支原体临床检测.     

实时荧光定量TaqMan-PCR检测小鼠多瘤病毒方法的建立

目的 建立一种快速、特异、敏感的小鼠多瘤病毒 (murine polyomavirus, MPyV)荧光定量 TaqMan PCR检测方法, 用于MPyV核酸的检测。 方法 根据GenBank中小鼠多瘤病毒基因组序列设计了一对特异性引物及TaqMan探针, 扩增长度为69 bp的片段, 通过优化反应体系和反应条件, 对构建的重组质粒标准品进行检测, 并绘制标准曲线, 进行特异性、敏感性和重复性试验。最后用建立的方法对人工感染MPyV的肺脏、脾脏和粪便, 及86 份小鼠临床样本进行检测, 验证在临床应用中的效果。 结果 所建立的检测方法特异性强, 只能在小鼠多瘤病毒DNA中检出荧光信号, 检测灵敏度达到100拷贝, 批内和批间重复性好, 检测结果变异系数(CV)均小于1.13%, 人工感染MPyV小鼠的肺脏、脾脏和粪便均为阳性, 对86份临床样本进行检测, 有3份样本呈阳性(阳性率为3.5%)。 结论 建立的MPyV荧光定量TaqMan-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好, 适合用于MPyV临床诊断、日常监测和流行病学调查。     

Taqman—MGB荧光定量PCR测定饮用水中大肠菌群

目的建立饮用水中大肠菌群荧光定量PCR定量检测方法。方法以大肠菌群lacZ基因为靶基因,建立Taqman—MGB探针荧光定量PCR定量方法测定饮用水中大肠菌群,并进行方法学评价。结果25山荧光定量PCR反应体系中Mg3＋为5．0mmol／L,dNTPs0．2mmol／L,引物0．2μmol／L,探针0．5μmol／L,TaqDNA聚合酶2．0U,加入样品模板5μl。检测方法的特异性、重复性好,灵敏度高,可检出单个拷贝大肠菌群模板。结论所建立荧光定量PCR方法可快速、灵敏、特异检测饮用水中大肠菌群。     

FEPAS牛肉单核细胞增生性李斯特菌几种检验方法比较

目的:探讨在食品检验中单核细胞增生性李斯特菌的检验方法。方法:采用常规培养法、全自动酶联免疫荧光分析仪筛选法、基因探针化学发光检测法、实时荧光定量PCR检测法对英国食品检验能力评价体系(FEPAS)牛肉单核细胞增生性李斯特菌水平测试提供的二份盲样(M164d02A和M164d02B)进行检测。结果:4种检测方法检测结果一致,样本M164d02A检出单核细胞增生性李斯特菌、样本M164d02B未检出单核细胞增生性李斯特菌,而实时荧光定量PCR检测法灵敏度较高,检测周期较短、特异性较高。结论:实时荧光定量PCR检测法在单核细胞增生性李斯特菌的检测中具有灵敏度高、检测时间短、特异性高等特点。     

双重实时荧光PCR检测肠出血型大肠埃希菌stx1和stx2基因方法的建立

目的建立一种检测肠出血型大肠埃希菌(EHEC)产毒基因stx1和stx2的TaqMan双重实时荧光PCR法。方法根据GenBank公布的EHECstx1和stx2基因序列进行比对后设计相应的PCR引物和TaqMan探针,探针报告基团分别使用FAM和HEX标记,淬灭基团使用BHQ1标记。建立双重实时荧光PCR反应体系并对反应条件进行优化,对方法的灵敏度、特异性及其重复性进行分析。结果建立了EHEC双重实时荧光PCR检测方法。菌液浓度为102～108cuf/ml时,均可观察到扩增曲线,且扩增曲线平滑;检测30份模拟临床样品,均检测到stx1和stx2基因,且均培养出EHEC,该方法灵敏度为100%;3次重复测定108、105、102cfu/ml3个高、中、低浓度的菌液DNA模板,得到其扩增曲线,计算各浓度的Ct值标准差及变异系数,均小于5%,在误差允许范围内。结论建立的双重实时荧光PCR法可快速、灵敏、特异、有效地检出EHEC。