重组hEGF-TCS融合蛋白基因表达载体的构建及表达产物的纯化

目的 构建新型人表皮生长因子(human epidermal growth factor,hEGF)和天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)融合蛋白的表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化EGF-TCS融合蛋白.方法 利用基因工程技术将人表皮生长因子EGF和天花粉蛋白基因连接起来,克隆到高效表达载体pQE30中,构建重组表达质粒pQE30-EGF-TCS.并在大肠杆菌M15中表达该融合蛋白(EGF-TCS).产物经Ni-NTA Agrose亲和层析柱纯化.结果 重组表达质粒pQE30-EGF-TCS在大肠杆菌M15中获得稳定、高效的融合表达.目的蛋白占细胞总蛋白的40%左右,以可溶性形式存在,表达上清柱纯化纯度达95%以上.结论 应用基因工程技术,成功构建了融合蛋白EGF-TCS,为进一步研究其结构功能关系和临床应用奠定了基础.     

融合蛋白EGF-TCS的纯化及体外靶向杀伤肿瘤细胞的研究

目的 在大肠杆菌中表达并纯化EGF-TCS融合蛋白,观察该融合蛋白对肿瘤细胞的靶向选择性杀伤作用.方法 将重组表达质粒PQE30/EGF-TCS转化至大肠杆菌M15中,表达该融合蛋白(EGF-TCS).产物经Ni-NTA Agrose亲和层析柱纯化;用流式细胞仪检测肿瘤细胞株和正常肝LO2细胞株的EGFR表达量;进行细胞杀伤实验,验证EGF-TCS的选择性杀伤能力;用流式细胞仪检测细胞凋亡的方法进一步考察EGF-TCS的靶向选择性杀伤能力,并用电镜观察细胞形态.结果 重组表达质粒PQE30/EGF-TCS在大肠杆菌M15中获得稳定、高效的融合表达,表达上清柱纯化纯度达95%以上;肝癌BEL-7402细胞表面EGFR表达量最高(72.33%),正常肝LO2细胞表面EGFR表达量最低(5.51%),重组的融合蛋白对肿瘤细胞具有较大的杀伤能力(BEL-7402、MCF-7和BGC-823的IC50分别为11.40、22.47、12.53 μg/ml),对正常细胞的杀伤能力微弱(IC50为53.19 μg/ml).结论 应用基因工程技术,成功构建了融合蛋白EGF-TCS,该融合蛋白可明显促进肿瘤细胞的凋亡.     

结核分支杆菌HSP70原核表达载体的构建和表达及蛋白纯化

目的：构建结核分支杆菌HSP70原核表达载体并诱导其表达和纯化及鉴定目的蛋白。方法：利用PCR技术从牛型结核分支杆菌基因组中扩增出Mtb HSP70 DNA序列，构建重组质粒pGEM-Mtb HSP70，经酶切、PCR和测序鉴定后，将Mtb HSP70基因亚克隆到原核表达质粒PQE30，构建重组表达质粒PQE30-Mtb HSP70，在大肠杆菌M15中诱导表达。用镍凝胶亲和层析的方法纯化目的蛋白，Western blotting杂交鉴定纯化蛋白。结果：经测序证实，获得的目的基因与GenBank中公布的结核杆菌Mtb HSP70基因序列一致。构建的原核表达载体PQE30-Mtb HSP70在大肠杆菌M15中经1 mmol•L^-1 IPTG诱导后表达出相对分子质量约为70 400的蛋白，镍柱纯化后经抗组氨酸单克隆抗体进行Western blotting,在相对分子质量约70 400处可见特异性着色带。结论：成功构建原核表达载体PQE30-Mtb HSP70，并成功诱导Mtb HSP70蛋白的 表达，通过镍凝胶亲和层析法获得纯度较高的Mtb HSP70蛋白。     

Flt3配体基因原核表达载体的构建、表达、纯化及生物学活性鉴定

目的：获得人Flt3配体(FL) cDNA胞外段序列,构建表达人FL蛋白的原核重组表达载体并诱导其表达、纯化及鉴定目的蛋白。方法：提取K562细胞总RNA,利用巢式PCR技术扩增出目的cDNA序列,构建重组质粒pGEM-FL,经酶切、PCR和测序鉴定后,将rhFL基因亚克隆到原核表达质粒PQE30,构建重组表达质粒PQE30-rhFL,在大肠杆菌M15中诱导表达。用镍凝胶亲和层 析方法纯化目的蛋白,Westren blotting杂交鉴定纯化蛋白,并用造血集落形成实验检测生物学活性。结果：经测序证实,获得的目的基因与GenBank公布的FL基因序列100%一致。构建的原核表达载体PQE30-rhFL在大肠杆菌M15中经1 mmol•L^-1IPTG诱导后表达出相对分子质量为25 000的蛋白,镍柱纯化后经抗组氨酸单克隆抗体进行Westren blotting,在相对分子质量为25 000处可见特异性着色带。结论：构建了原核表达载体PQE30-rhFL,并成功诱导了rhFL蛋白的表达,通过镍凝胶亲和层析法获得纯度较高的rhFL蛋白。     

人睾丸新基因SPAG4L的原核表达与纯化

目的 原核表达人睾丸生精相关基因SPAG4L,并对重组蛋白进行纯化,为下一步研究SPAG4L的生物学功能奠定基础.方法 运用RT-PCR从人睾丸中扩增编码SPAG4L126-379的基因片段,并将PCR产物克隆至pUCm-T载体.用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ消化后,将目的 片段克隆至带有6个组氨酸标签的原核表达载体PQE30中.重组质粒PQE-30-SPAG4L经酶切和测序验证后,转化大肠杆菌JM15,IPTG诱导融合蛋白表达.SPAG4L融合蛋白以westernblot进行鉴定,最后用NI-NTA磁性琼脂糖珠进行纯化.结果 成功构建了重组表达质粒PQE-30-SPAG4L,并能够在大肠杆菌JM15中诱导表达,经Westernblot分析证实,IPTG诱导表达的是SPAG4L融合蛋白.建立小规模的SPAG4L融合蛋白表达、纯化系统,获得了带有6个组氨酸标签的纯化的SPAG4L融合蛋白.结论 成功地对人睾丸生精相关基因SPAG4L进行了体外原核表达,获得了纯化的融合蛋白蛋白,为进一步研究该蛋白在精子发生中的生物功能奠定了基础.     

人白细胞介素-22的克隆及原核表达

目的克隆hIL-22成熟链基因并在大肠杆菌表达体系中进行有效表达。方法采用反转录PCR以及巢式PCR的方法克隆得到hIL-22基因。将hIL-22基因装入PQE3.0载体构建重组载体hIL-22/PQE3.0,继而转化宿主工程菌株M15。经异丙基B-D硫代半乳糖苷诱导表达产生hIL-22/His重组蛋白并纯化。重组蛋白经电泳分析和Westernblot验证。结果成功地克隆和构建了hIL-22/PQE3.0载体,转化的工程菌经过诱导表达18kd的hIL-22成熟链,利用亲和层析得到了纯化的重组蛋白。结论成功获得hIL-22/His重组蛋白,为下一步研究人IL-22在肿瘤细胞中的作用奠定了物质基础。     

GST-hPBD融合蛋白的克隆、表达及活化Rac1蛋白的分析

目的:制备GST-hPBD融合蛋白,探讨活化的Rac1在血管内皮细胞中的表达. 方法:采用RT-PCR方法克隆与活化Rac1相结合的hPBD基因片段,构建pGEX-2T/hPBD原核表达载体,并纯化GST-hPBD融合蛋白;应用pull down测定血管内皮细胞中活化Rac1的蛋白表达. 结果:基因测序证实原核表达载体pGEX-2T/hPBD序列正确,并在大肠杆菌中高效表达,纯化得到纯度约75% GST-hPBD融合蛋白,其Mr为36 000;进一步分析证实血管内皮细胞可表达活化的Rac1蛋白. 结论:成功构建了人pGEX-2T/hPBD原核表达载体,纯化了GST-hPBD融合蛋白,并检测到血管内皮细胞中活化Rac1蛋白的表达.     

PTD-SH2融合蛋白的原核表达和纯化

目的:构建含SH2与蛋白转导结构域(PTD)融合基因片段的重组表达载体,在大肠杆菌中进行表达并纯化蛋白. 方法: 通过PCR方法扩增出SH2基因,克隆入pMD-18T载体,进行测序分析,将该基因亚克隆入原核表达载体pET-16b中PTD 的下游构建重组质粒pET-16b-PTD-SH2,转化感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组融合蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析,将已表达的蛋白质通过Ni-NTA亲和色谱柱进行纯化. 结果:构建了重组融合表达质粒pET-16b-PTD-SH2, 表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析,在约Mr为15×103处出现了一条新生的蛋白条带,经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的16%, 可溶性分析发现融合蛋白主要以包涵体形式存在,纯化后得到了目的蛋白. 结论: 成功构建了PTD-SH2的重组表达载体,使融合蛋白在E. coli DE3中高效表达,亲和层析后获得了纯化目的蛋白,为后续的SH2结构域的功能研究奠定了基础.     

表皮生长因子介导的基因转移载体蛋白的制备

目的制备一种表皮生长因子(EGF)受体介导的、完全非病毒基因转移载体。方法通过PCR分别扩增出人类组蛋白第一功能域(H1)基因的编码序列和EGF的受体结合结构域(C环)基因的编码序列:将它们以EcoRⅠ位点连接后作为模板,PCR扩增出融合蛋白H1EGFc的基因。在对此融合基因进行克隆、测序之后,构建原核表达载体PLYI-H1EGFc,并转化大肠杆菌DH5α进行诱导表达。将表达出的融合蛋白利用SDS-PAGE电泳凝胶切割法进行纯化。结果表达出的目的蛋白与设计的融合蛋白分子量相符;经SDS-PAGE扫描,纯化后的目的蛋白纯度达94.02%。结论表达并纯化了融合蛋白H1EGFc。     

大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭蛋白-yijP的表达纯化

目的:研究大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭基因yijP的编码产物在大肠杆菌侵袭脑微血管内皮细胞中的作用,以期阐明大肠杆菌穿过血脑屏障的机制.方法:应用PCR方法获取yijP基因C末端1.04 kb片断(编码333个氨基酸),将其克隆到PQE载体并转化到受体菌M15,以构建出表达N-末端带有6个组氨酸的yijP融合蛋白的工程菌.通过Ni-NTA Agarose亲和层析法提纯yijP融合蛋白,初步分析该蛋白对人脑微血管内皮细胞(HB-MEC)生长的影响.结果:成功获得了分子量为41kb的yijP融合蛋白,并发现yijP蛋白对HBMEC有较强的细胞毒作用.结论:大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭基因yijP的编码产物-yijP蛋白可能是一种细胞毒因子.     

重组结核分枝杆菌CFP10的克隆与表达

目的:克隆和表达结核分枝杆菌CFP10,并分析其免疫学活性。方法:自结核分枝杆菌标准株H37Rv提取基因组DNA,PCR扩增cfp10基因,克隆至T载体pMD18T,转化入大肠杆菌JM109,菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析。将测序正确的pMD18-cfp10的cfp10基因亚克隆至表达载体PQE30,构建重组质粒PQE30-cfp10,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,PCR和双酶切鉴定阳性重组体,IPTG诱导CFP10表达,亲和层析纯化,western-blot分析其免疫活性。结果:成功构建PQE30-cfp10重组表达质粒,表达、纯化获得分子量约10kDa的CFP10,并能被结核病人血清识别。结论:克隆表达获得具有免疫活性的重组结核分枝杆菌CFP10。     

重组hIL-17B/His原核蛋白表达和生物学活性初步研究

目的研究原核表达hIL-17B/His重组蛋白及生物学活性。方法 RT-PCR法克隆去信号肽的hIL-17B基因序列。将测序后的hIL-17B分子扩增产物插入PQE3.0载体构建hIL-17B/PQE3.0重组载体。再将该重组载体导入M15工程菌,应用异丙基B-D硫代半乳糖苷诱导后表达hIL-17B/His重组蛋白,并经Western blot实验证实。结果获得原核表达的hIL-17B/His重组蛋白。体外实验表明,该融合蛋白具有上调人巨噬细胞TNF-α、IL-1β等分子表达的作用。结论原核表达获得具有生物学活性的hIL-17B重组蛋白,为进一步研究该分子的生物学功能提供了物质条件。     

人白细胞介素24基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

目的：构建人白细胞介素24（hIL-24）基因原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达hIL-24蛋白,并测定其生物学活性。方法：用PCR方法从含有hIL-24的质粒中扩增hIL-24 cDNA序列,测序鉴定正确后,应用基因重组技术构建PQE/hIL-24,并转入大肠杆菌(E.coli)M15。IPTG诱导表达目的蛋白,镍凝胶亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析鉴定结果,应用外周血单核细胞（PBMCs）,通过ELESA法分别在48和72 h检测rhIL-24刺激的PBMCs中 IL-6、IFN-γ及TNF-α产生情况。结果：获得与GenBank中报道一致的hIL-24基因片段。SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析显示,获得具有hIL-24免疫原性、相对分子质量约为18 400目的蛋白。Ni²⁺-NTA agarose纯化得到单一条带蛋白, 获得rhIL-24蛋白刺激的PBMCs,PBMCs分泌IL-6、IFN-γ、TNF-α的水平显著高于未刺激前分泌水平(P<0.05),rhIL-24具有与天然hIL-24蛋白相同的生物学活性。结论 成功地构建了hIL-24的原核表达载体,在E.coli中高效表达了rhIL-24蛋白,获得了与天然hIL-24蛋白具有相同生物学活性的rhIL-24。     

天花粉蛋白突变体的构建及其在原核系统中的表达

目的：构建天花粉蛋白（TCS）突变体,并将其在原核系统内进行表达及纯化。方法：借助计算机预测TCS可能的抗原决定簇（YFF81-83）并设计出适当的突变引物。以栝楼基因组DNA为模板,利用重组PCR技术扩增TCS突变体全长基因,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后与原核表达载体pRSET-A连接,转化感受态E.coli DH5α,提取质粒进行酶切鉴定及测序。将所获阳性重组质粒转化感受态E.coli BL21（DE3）,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行Western blot鉴定。最后用Ni-NTA亲和层析柱对所获突变体蛋白进行纯化。结果：成功构建了TCS突变体（TCSYFF81-83ACS）,并获得了突变体蛋白在大肠杆菌内的可溶性高效表达,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,产生出大量均一的TCS突变体蛋白。结论：TCS的定点突变及其在原核系统内的表达,为基因工程方法改造TCS提供了新的途径。     

TTV蛋白抗原在大肠杆菌中的表达

目的 :用原核系统表达TTV的重组蛋白抗原 ,建立诊断TTV感染的特异性方法。方法 :采用PCR方法扩增TTVORF2 基因 ,将之插入到测序质粒载体中进行测序 ,验证序列正确后再嵌入到原核表达载体pQE30 ,并转化大肠杆菌M15菌株 ,进行诱导表达。用SDS PAGE分析表达产物。表达产物经Ni NTA柱层析纯化后 ,得到纯度为90 %的ORF蛋白抗原。用TTV感染者的阳性血清对该蛋白进行了Western BlotBlotting分析。结果 :经IPTG诱导后 ,筛选出 2株高表达株。结论 :该蛋白具有良好的抗原活性     

用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素

目的 利用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素（endostatin）.方法 采用PCR技术从pMFGendo质粒上扩增出小鼠endostatin完整的cDNA序列,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pThiohisA中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物为包涵体,将包涵体纯化后通过镍柱亲和层析得到纯化的、可溶性的小鼠内皮抑素,经SDS-PAGE分析鉴定.结果 高效表达出相对分子量约32KD的重组融合蛋白,灰度扫描软件分析显示,其表达量占菌体总蛋白质的35.9%,经镍柱亲和层析获得了高纯度的小鼠内皮抑素重组融合蛋白,纯度可达95%,得率为0.27g/L.结论 用硫氧还蛋白融合表达系统在大肠杆菌中表达的小鼠内皮抑素重组融合蛋白易纯化并具有高活性.     

人成熟转化生长因子β1蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的构建人成熟转化生长因子β1（hmTGF-β1）的原核表达载体,表达并纯化hmTGF-β1蛋白。方法应用RT-PCR方法获得hmTGF-β1基因,连接至自带6His标签表达载体pET23b,构建原核表达质粒pET23b-hmTGF-β1,诱导表达hmTGF-β1融合蛋白,镍亲合层析法纯化融合蛋白,并对纯化产物进行纯度分析。结果成功构建了hmTGF-β1原核表达质粒pET23b-hmTGF-β1,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳分析,在约15kD处出现了一条新的蛋白条带,WesternBlot结果显示该条带能够与His抗体特异性结合。应用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白,分析纯度达95%。结论成功构建了hmTGF-β1蛋白的原核表达质粒,并成功表达与纯化hmTGF-β1蛋白,为进一步复性、获得有活性的hmTGF-β1打下基础。     

rhTL1A基因原核表达载体的构建、表达与纯化

目的：构建人肿瘤坏死因子样分子1A（TL1A）原核表达质粒并诱导其表达,纯化及鉴定目的蛋白。方法：人HUVECs总RNA经逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增TL1A基因,克隆到pTA2载体,酶切和测序鉴定正确后构建重组原核表达质粒pQE-TL1A,并转化大肠杆菌M15［pREP4］。IPTG诱导目的蛋白表达并进行Western blotting鉴定;镍离子亲和层析柱(Ni²⁺-NTA)纯化靶蛋白。结果：目的基因经酶切其结果与预期相符,测序结果显示目的基因与GenBank登录的序列(登录号AF520785)完全一致;工程化大肠杆菌M15［pREP4］经IPTG诱导表达相对分子质量约22 000的目的蛋白;Western blotting鉴定结果显示,重组蛋白能够与抗His单克隆抗体特异性结合。结论：成功地构建了重组原核表达质粒pQE-Tl1A,并纯化获得高纯度重组TL1A蛋白。