14-3-3γ表达载体的构建及其对子宫肌瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的：构建一种稳定、高表达的14-3-3γ基因真核表达质粒载体,并探索其抗子宫肌瘤的作用。方法：提取子宫肌瘤细胞总RNA,反转录后通过RT-PCR扩增14-3-3γ,并将扩增的目的基因片段插入pCMV-N-Flag真核表达质粒,构建重组质粒14-3-3γ-pCMV-N-Flag,重组体经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术导入子宫肌瘤细胞。应用WesternBlot法检测14-3-3γ蛋白的表达,应用CCK-8检测细胞增殖变化,应用Annexin V-FITC／PI双染色法经流式细胞术检测细胞凋亡。结果：①构建的14-3-3γ-pCMV-N-Flag真核表达载体经酶切后电泳和DNA测序,显示载体构建正确;②子宫肌瘤细胞转染重组体后的14-3-3γ表达明显高于转染前（P〈0．05）;③子宫肌瘤细胞转染重组体后,细胞增殖抑制率为52．90％（P〈0．05）;④转染重组体后肌瘤细胞的凋亡率明显高于转染前（P〈0．05）。结论：本研究成功构建14-3-3γ-pCMV-N-Flag真核表述质粒载体,14．3．3Y在子宫肌瘤细胞内高表达后可抑制细胞的增殖和促进细胞凋亡。     

人类14-3-3β真核表达系统的构建

目的:构建人类14-3-3β基因真核表达载体并观察其转染的ECV-304细胞中14-3-3β的表达.方法:用基因重组技术将人类14-3-3βcDNA的开放阅读框克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,经酶切鉴定及测序分析并以脂质体介导转染ECV-304细胞,Western-blot检测其在细胞内的表达.结果:酶切鉴定及测序分析表明重组pcDNA3.1-14-3-3β表达质粒克隆成功,经Westem-blot检测14-3-3β蛋白在ECV-304细胞中获得表达.结论:以脂质体介导pcDNA3.1-14-3-3β质粒转染真核细胞为进一步研究14-3-3β基因的功能奠定了实验基础.     

人Fn14基因真核重组质粒的构建及其表达

目的构建人成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14（fibroblast growth factor—inducible 14，Fn14）基因真核重组质粒及其表达。方法从人肝细胞癌组织抽取总RNA，RT—PCR扩增出Fn14基因全长cDNA，经测序正确后，核酸内切酶EcoR I、Xba I酶切PCR产物，亚克隆人pcDNA3．1-Myc载体，重组质粒pcDNA3．1-Myc—Fn14经酶切及测序鉴定正确后转染COS-7细胞，通过免疫组织化学DAB法检测Myc—Fn14融合蛋白的表达。结果重组质粒pcDNA3．1-Myc—Fn14经EcoR I、Xba I酶切及测序鉴定正确，重组质粒包含人Fn14基因完整编码区。免疫组织化学检测结果显示，重组质粒转染COS-7细胞后成功表达Myc—Fn14融合蛋白，转染空载体pcD—NA3．1-Myc的COS-7细胞未见Myc—Fn14融合蛋白表达。结论构建了人Fn14基因真核表达载体，该重组质粒可表达含Myc-Fn14的融合蛋白，为研究Fn14功能奠定了基础。     

Galectin-3重组真核表达载体的构建及其在NIH/3T3细胞中的表达

目的:构建半乳糖凝集素-3(Gal-3)的真核表达载体,在NIH/3T3细胞中表达,并检测其表达?方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人肿瘤细胞克隆Gal-3基因,插入真核表达载体pEGFP-N1中,通过酶切和测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pEGFP-Gal-3瞬时转染NIH/3T3细胞,经荧光和Western blot方法检测Gal-3表达,MTT法检测Gal-3对NIH/3T3细胞增殖的影响?结果:限制性内切酶鉴定和核酸序列测序证实成功构建含Gal-3的重组真核表达载体pEGFP-Gal-3?以重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞,检测到Gal-3蛋白表达,并证实Gal-3蛋白促进NIH/3T3细胞增殖?结论:成功构建的pEGFP-Gal-3真核表达载体在小鼠NIH/3T3细胞中成功表达,并促进NIH/3T3细胞增殖?     

鼠源pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85真核表达质粒的构建及其部分功能研究

目的 构建鼠源pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85真核表达质粒，并观察其对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞中炎症相关因子分泌的影响及对RAW264.7细胞增殖和凋亡的影响。方法 通过PCR扩增NUP85基因，构建pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85真核表达质粒。将pcDNA3.1-3×Flag-c载体进行酶切。纯化的PCR产物与载体连接，将连接产物转化细菌感受态细胞。酶切鉴定后，再进行测序和比对分析。然后将其转染至RAW264.7细胞中，通过CCK-8实验和流式细胞术检测其对LPS诱导的RAW264.7细胞增殖和凋亡的影响，并通过Western blot技术和ELISA法检测RAW264.7细胞中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的表达情况。结果 酶切鉴定和Western blot结果显示pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85真核表达质粒成功构建和表达。CCK-8实验结果显示：24 h后过表达NUP85组细胞的存活率显著低于对照组[(0.55±0.03)vs(0.67±0.05),F=30.98,P<0.05]。流式细...     

重组人釉原蛋白真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的稳定表达

目的构建含人釉原蛋白(hAm)基因的重组真核表达质粒并转染哺乳动物细胞NIH3T3,建立稳定表达重组hAm的细胞株,为临床应用奠定基础。方法利用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ将hAm基因插入真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)A,构建含hAm基因的重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm,双酶切和测序鉴定。通过LipofectamineTM2000介导重组质粒转染NIH3T3细胞,利用G418筛选出阳性克隆,建立稳定表达人釉原蛋白的细胞株,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting验证蛋白表达。结果重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误。重组质粒转染NIH3T3细胞后建立的稳定转染细胞株经SDS-PAGE电泳及Western blotting检测显示有相对分子质量为28 000的hAm表达,与预测一致。结论成功构建含hAm基因的重组真核表达系统,并获得稳定表达重组hAm的细胞株NIH3T3-hAm细胞株。     

人BNIP3基因真核表达载体的构建及其对HT-29细胞化疗敏感性的影响

目的 构建人BNIP3真核表达载体,观察BNIP3高表达对人结肠癌细胞HT-29化疗敏感性的影响.方法 PCR法扩增BNIP3基因,酶切后插入质粒pEGFP-C3,构建重组真核表达载体pEGFP-C3/BNIP3.脂质体转染人结肠癌细胞HT-29,Western blot检测BNIP3蛋白表达.MTT法检测5-氟尿嘧啶(5-Fu)的化疗敏感性和细胞增殖,AnnexinV-APC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡.结果 酶切电泳分析和DNA序列测定证实,重组质粒pEGFP-C3/BNIP3构建成功;转染重组质粒的HT-29细胞BNIP3蛋白明显高表达.与未转染组和转染空质粒pEGFP-C3组比较,转染pEGFP-C3/BNIP3组5-Fu的IC50值显著降低[(120.11 ±5.45)、(113.40 ±4.72) μg/mL vs (19.08 ±2.62) μg/mL,P＜0.05],细胞凋亡率显著增加[(5.51±0.32)％、(7.19±0.47)％vs (41.72±1.48)％,P＜0.05],细胞克隆形成显著减少[(52±6)、(49±5)vs(11±3),P＜0.05],细胞增殖速度减慢.结论 成功构建了人BNIP3真核表达载体,BNIP3高表达可增加HT-29细胞对5-Fu的化疗敏感性.     

H3N2流感病毒非结构蛋白-1真核表达载体的构建与表达及其对293T细胞增殖的影响

目的:构建甲型H3N2流感病毒非结构蛋白-1( nonstructal-1,NS1)真核表达载体并表达其编码蛋白;探讨NS1对细胞增殖的影响?方法:从江苏省甲型H3N2流感病毒毒株提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T Simple Vector中构建pMD18-T/NS1质粒,双酶切pMD18-T/NS1与pXJ40-HA后,构建真核表达载体pXJ40-HA-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过免疫印迹法鉴定NS1蛋白的表达?3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT]法检测NS1转染细胞后对细胞增殖的影响? 结果:经双酶切?测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功;免疫印迹法证实NS1蛋白的表达?MTT法证实转染NS1质粒后对细胞增殖有抑制作用?结论:成功克隆了NS1全长基因,构建了其真核表达载体,并初步验证了NS1蛋白过表达后能抑制细胞的增殖,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1的细胞模型和NS1蛋白对细胞增殖和凋亡作用机制的进一步研究提供了基础?     

CSF2A融合基因真核表达载体的构建及其对EBV+肿瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的: 构建爱泼斯坦-巴尔(EB)病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2A)基因与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)融合基因(CSF2A)重组真核表达载体,探讨CSF2A融合蛋白对EBV阳性(EBV⁺)肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法: 根据重叠延伸原理,将LMP2A与GM-CSF在编码(Gly4Ser)3多肽的DNA基因片段连接下进行重组。采用DNA重组技术将融合基因片段连接于pIRES2-eGFP真核表达载体上,行酶切电泳分析和DNA测序鉴定重组质粒。设pIRES2-CSF2A重组质粒转染组为实验组,pIRES2-LMP2A质粒转染组和pIRES2-eGFP空质粒转染组为对照组,分别转染树突状细胞(DC)。采用RT-PCR和Western blotting法检测细胞中CSF2A基因和蛋白表达;MTT和Hochest法检测各组EBV⁺肿瘤细胞增殖抑制率和细胞凋亡形态学。结果: 酶切实验和序列测定,CSF2A融合基因正确插入pIRES2-eGFP质粒,并成功获得重组真核表达载体pIRES2-CSF2A。转染pIRES2-CSF2A至DC后,检测到CSF2A蛋白的表达。MTT法检测,pIRES2-CSF2A质粒转染组细胞增殖抑制率高于对照组(P<0.05或P<0.01),且呈时间依赖性;Hochest检测,细胞出现凋亡形态学改变并产生凋亡小体。pIRES2-CSF2A质粒转染组作用于EBV⁺肿瘤细胞48h时凋亡细胞明显增多。结论: 重组真核表达载体pIRES2-CSF2A可有效转染DC,并明显抑制EBV⁺CNE2细胞增殖且促进其凋亡。     

S100A9真核表达载体pEGFP-N3-S100A9的构建及其对U251细胞生长的影响

目的构建S100A9真核表达载体pEGFP-N3-S100A9,观察其对胶质瘤细胞系U251内S100A9基因表达及细胞生长的影响。方法应用RT-PCR和DNA重组技术构建pEGFP-N3-S100A9融合蛋白表达载体,并用双酶切、测序进行鉴定,用脂质体转染胶质瘤细胞系U251细胞。荧光显微镜下动态观察U251细胞绿色荧光的变化;培养24 h后提取转染细胞的总RNA及总蛋白。通过荧光定量PCR（qRT-PCR）观察其mRNA表达情况,Western blot检测其蛋白表达情况,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期分布。结果酶切鉴定与S100A9全长基因长度一致（345 bp）;测序证实重组质粒中含有一与GenBank上登录的S100A9基因（NM₀02965）序列完全一致的片段,表明成功构建真核表达载体;荧光显微镜下转染U251细胞可见绿色荧光蛋白表达,12 h后逐渐增多,24～48 h达高峰,且稳定表达较长时间;24 h后通过qRT-PCR检测到mRNA表达,Western blot检测到14×103目的蛋白表达（P<0.05）,其增殖能力明显增强（P<0.01）,且引起细胞G1期减少,S期增加（P<0.05）。结论成功构建真核表达载体pEGFP-N3-S100A9,转染到U251细胞后能有效上调S100A9基因的mRNA及蛋白的表达、促进细胞增殖。     

野生型p53基因转染前列腺癌细胞系PC-3m对细胞凋亡的不同影响

目的：观察野生型p53基因转染对前列腺癌细胞PC-3m增殖和凋亡的影响。方法：用脂质体Lipofectamine将真核表达载体pCMV—p53和pCMV—p53mt135分别转染PC-3m细胞，MTT法检测转染前后细胞生长情况，转染48h后采用流式细胞技术(FCM)检测细胞凋亡率。结果：pCMV—p53转染后的PC-3m细胞生长明显受到抑制，FCM显示，转染48h后，细胞凋亡率为15％。结论：野生型p53基因瞬间转染PC-3m细胞可抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。     

靶向PDCD5-Caspase-3 融合基因过表达 对HepG2 肝癌细胞增殖与凋亡的影响

目的 探讨靶向PDCD5-Caspase-3 融合基因过表达对HepG2 肝癌细胞体外增殖与凋亡的影响。 方法 利用基因重组技术构建PDCD5-Caspase-3 融合基因,克隆到带有EGFP 基因的GV358 慢病毒表达载 体,与辅助质粒共同转染293T 细胞,通过同源重组,获得融合基因重组慢病毒PDCD5-Caspase-3。体外 转染人肝癌HepG-2 细胞72 h 后,Western bolt 检测肝癌HepG-2 细胞中PDCD5 蛋白和Caspase-3 蛋白表 达,CCK-8 法检测PDCD5-Caspase-3 融合基因过表达对HepG-2 肝癌细胞增殖的影响,流式细胞术观察其 对细胞凋亡的影响。结果 PDCD5-Caspase-3 融合基因过表达可增加HepG-2 肝癌细胞中PDCD5 蛋白和 Caspase-3 蛋白合成（P <0.05）;与对照组或空白组相比,转染72 h 后实验组细胞增殖能力下降（P <0.05）; 与对照组或空白组比较,转染72 h 后实验组细胞凋亡率增加（P <0.05）。结论 促凋亡基因PDCD5 和 Caspase-3 联合表达可抑制HepG2 肝癌细胞增殖,并促进其凋亡,可作为肝癌治疗潜在靶点。     

PCNA的shRNA对子宫颈癌细胞的抑制研究

目的:构建增殖细胞抗原(PCNA)的小发夹结构RNA(shRNA)的真核表达载体并在HeLa细胞表达,同时观察PCNA的shRNA对人HeLa细胞株体外增殖的影响及生物学特性的改变。方法:将PCNA的cDNA的shRNA引物插入真核表达载体pGenesil1,构建真核表达质粒pGenesil1PCNA14,并通过酶切和测序等方法进行鉴定,将真核表达质粒pGenesil1PCNA14转染子宫颈癌细胞,运用Westernblot检测PCNA的蛋白表达,流式细胞仪分析细胞周期变化。结果:PCNA的shRNA能显著抑制人HeLa细胞的生长,阻滞细胞G0/G1S期,PCNA的蛋白表达同时受到抑制。结论:PCNA的shRNA能显著抑制人HeLa细胞的生长,其抑制作用可能通过阻断PCNA蛋白表达实现,实验结果为进一步研究PCNA的shRNA对子宫颈癌的基因治疗奠定了基础。     

MAD1基因在主动脉夹层中的表达及对主动脉平滑肌细胞的影响

收集病变的升主动脉中膜组织标本为主动脉夹层组；收集同期在本院行尸检且无手术史、大血管病变史的升主动脉壁内组织标本18份为对照组；RT-PCR和Western blot检测有丝分裂阻滞缺陷蛋白(MAD1) mRNA和蛋白表达水平。在体外建立MAD1基因高表达人主动脉血管平滑肌细胞(HA-VSMC)模型,检测细胞增殖和凋亡情况以及凋亡相关蛋白。结果显示主动脉夹层组患者主动脉夹层中MAD1 mRNA和蛋白相对表达量明显高于对照组(P<0.05)。随着转染时间的延长,各组细胞增殖水平均逐渐增加,转染48 h、72 h后MAD1过表达组细胞增殖情况低于空白对照组及空载体转染组(P<0.01)。转染48 h后,MAD1过表达组细胞凋亡率明显高于空白对照组及空载体转染组(P<0.01)。MAD1过表达组含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA和蛋白相对表达量明显高于空白对照组及空载体转染组(P<0.05)。实验结果表明,MAD1过表达可通过抑制细胞增殖,激活细胞外凋亡途径和细胞内凋亡途径来促进人主动脉平滑肌细胞HA-VSMC细胞凋亡,参与主动脉夹层的发生与发展。     

RNA干扰IDH2基因对HCT-8细胞增殖能力的影响

目的：研究RNA干扰(RNAi)对结肠癌HCT-8细胞IDH2基因表达的抑制作用及干扰后对HCT-8细胞增殖的影响,为结肠癌的基因靶向治疗提供理论依据。方法：实验分siRNA干扰质粒转染组、阴性质粒对照组和HCT-8细胞空白对照组。构建靶向基因IDH2的siRNA真核绿色荧光载体重组质粒PGPU6/GFP/Neo-IDH2,利用FuGENE HD转染剂转染HCT-8细胞,通过荧光定量PCR检测IDH2 mRNA的表达情况及MTT法检测结肠癌HCT-8细胞增殖变化。结果：在荧光显微镜下进行细胞计数,细胞转染率为74%。实时荧光定量PCR检测,siRNA重组质粒PGPU6/GFP/Neo-IDH2对IDH2基因表达的抑制率为85.02%,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。MTT检测,干扰质粒转染组细胞的增殖能力明显低于空白对照组(P<0.05)。结论：抑制IDH2基因的表达可影响结肠癌细胞的增殖能力,提示IDH2基因在结肠癌的发生发展中起重要作用,抑制IDH2基因的表达可能成为一种治疗结肠癌的方法。     

ATP1B1真核表达质粒的构建及其对胃腺癌SGC-7901细胞的作用

目的构建Na ,K -ATP酶β1亚基(ATP1B1)真核表达质粒,为利用ATP1B1进行肿瘤基因治疗奠定基础。方法以白细胞文库为模板扩增ATP1B1 cDNA,定向插入到pEGFP-C3真核表达质粒中,构建pEGFP-ATP1B1重组质粒;经酶切分析和测序鉴定后,通过脂质体介导转染胃腺癌SGC-7901细胞,利用real-time PCR检测转染后SGC-7901细胞的ATP1B1基因表达,并进行其ATP酶活性检测;MTT法测定转染后SGC-7901细胞的增殖活性。结果重组质粒经鉴定证实含有ATP1B1 cDNA序列,转染pEGFP-ATP1B1的SGC-7901细胞ATP1B1基因表达增高达129.2%,ATP酶活性增强为(2.95±0.210)%,细胞生长增殖显著受抑。结论成功构建了ATP1B1真核表达质粒,为进一步利用ATP1B1研究恶性肿瘤基因治疗奠定基础。     

喉癌来源的MAGE-A3基因真核表达载体及其稳定表达模型的构建和鉴定

目的：克隆人黑色素瘤相关抗原MAGE—A3基因,构建真核表达载体,检测、鉴定其在细胞中的表达。方法：MAGE-A3基因进行PCR扩增,凝胶回收PCR产物片段并连接至pMDl8一T载体。测序后将MAGE—A3基因片段亚克隆至真核表达载体,构建成plRES2-EGFP／MAGE—A3重组质粒。经脂质体转染至293T细胞株后,荧光定量PCR、Western-blotting法鉴定MAGE—A3基因的表达。结果：MAGE-A3基因正确克隆在plRES2-EGFP／MAGE-A3,测序结果与GenBank公布的MAGE—A3序列一致。转染293T细胞后能检测到MAGE-A3基因和蛋白的表达。结论：成功构建plRES2-EGFP／MAGE—A3真核表达质粒,并能在293T细胞中有效表达MAGE—A3蛋白,奠定了其作为DNA疫苗应用的基础。