HBV S-ecdCD40L融合基因修饰对树突状细胞功能的影响

目的探讨HBVS—ecdCD40L融合基因修饰对树突状细胞（DC）功能的影响。方法分离健康成人外周血单个核细胞,GM—CSF、IL-4诱导培养树突状细胞,培养第5天,以脂质体介导转染,分为pcDNA3．1-S—ecdCD40L转染组、pcD—NA3．1-S转染组、pcDNA3．1转染组及PBS对照组。转染48h收集DC及上清,流式细胞仪检测DC表面CD80、CD86、HLA—DR表达水平;CCK-8法检测混合淋巴细胞反应（MLR）中DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力;酶联免疫吸附试验（ELISA）检测IL-12的分泌水平。结果与对照组比较,pcDNA3．1-S—ecdCD40L转染组DC表达CD80、CD86、HLA—DR水平增加,刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力增强,分泌IL-12水平增高。结论HBVS—ecdCD40L融合基因修饰能促进DC活化。增强DC功能,将CD40L胞外段基因与HBV抗原基因融合可能是增强乙肝疫苗免疫效果的有效方法。     

慢性乙型肝炎病人外周血树突状细胞的功能研究

目的 比较慢性乙型肝炎病人外周血及正常人外周血两种来源的树突状细胞(dendritic cell，DC)表型及功能上的差异。方法 从慢性乙型肝炎病人及正常人外周血分离单个核细胞，在含有粒单细胞集落刺激因子(GM-CSF)白细胞介素4(IL-4)肿瘤坏死因子α(NFFα)的无血清培养基AVI-M中培养。流式细胞仪检测其表型，并采用MLR方法检测树突状细胞刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结果 慢性乙型肝炎病人外周血单核细胞经诱导可获得成熟的树突状细胞，但CD80表达较正常人低，刺激同种异体T细胞增殖能力低于正常人。结论 慢性乙型肝炎病人的外周血来源的树突状细胞的功能较正常人低。     

慢性乙型肝炎病人外周血树突状细胞功能的研究

目的：体外培养慢性乙型肝炎病人的树突状细胞,并从细胞表型和功能方面与正常人树突状细胞进行比较。方法：从慢性乙型肝炎病人及正常人外周血分离单个核细胞,加入含1000U／ml GM-CSF和500U/ml IL-4的无血清培养基AIM－V体外培养,获得树突状细胞。利用流式细胞仪检测细胞因子TNF－α对树突状细胞培养的影响,IL－12ELISA试剂盒检测树突状细胞分泌IL－12的水平,并采用MLR方法检测树突状细胞刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结果：1．慢性乙型肝炎病人的外周血单个核细胞用AIM－V培养及细胞因子诱导后,可获得成熟的具有典型形态的树突状细胞,加入TNF－α后,IL－12分泌增高,CD83表达增加;2．病人树突状细胞与正常人比较,CD80表达较正常人的低（P＜0．05）,刺激同种异体T细胞增殖能力低于正常人。结论：1．慢性乙型肝炎病人的树突状细胞与正常人一样可用AIM－V无血清培养基及特定的细胞因子诱导在体外大量获得;2．慢性乙型肝炎病人的树突状细胞与正常人相比较在功能上降低,在形态数量上差异无显著意义。     

HBsAg 对健康成人外周血单核细胞来源树突状细胞Tim-3信号通路的影响

目的 探讨HBsAg 对健康成人外周血单核细胞来源树突状细胞（MD-DCs）的免疫活性及对T细胞免疫球蛋白黏 蛋白分子3（Tim-3）和下游信号分子核因子-κB（NF-κB）蛋白表达的影响。方法 分离健康成人外周血单核细胞,经GM-CSF、IL-4 联合诱导为树突状细胞（DCs）,流式细胞术检测DCs 表面标志物表达水平。MD-DCs 分4 组添加不同浓度HBsAg（0、1、2、5滋g/ml）,分别设为对照组、+1滋g/ml 组、+2滋g/ml 组、+5滋g/ml 组,Western 印迹法检测Tim-3、NF-κB 信号蛋白表达,细胞增殖与毒性检测试剂检测MD-DCs 刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力,ELISA 法检测细胞因子分泌水平。结果 外周血来源单核细胞成功诱导分化为DCs。与对照组相比,+2滋g/ml 及+5滋g/ml 组MD-DCs Tim-3 及NF-κB 表达水平均上调,刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力均增强,炎症因子IL-6、IL-10、IFN-γ 分泌水平均增高（均P＜0.05）,而+1滋g/ml 组较对照组无统计学差异（均P＞0.05）。与其他3 组相比,+5滋g/ml 组MD-DCs Tim-3、NF-κB、炎症因子分泌水平增高,刺激同种异体淋巴细胞增殖能力增强（均P＜ 0.05）。结论 HBsAg 上调MD-DCs Tim-3 及NF-κB表达水平,增强MD-DCs 免疫活性,且刺激作用随HBsAg 浓度的增高而增强。     

慢性乙型肝炎外周血树突状细胞的功能障碍机制的初步探讨

目的:探讨慢性乙型肝炎者树突状细胞(DCs)的功能状态及机制。方法:以直接荧光法进行表型分析、CCK8法测定DCs对同种异体淋巴细胞的刺激作用、AnnexinV/FITC法测定细胞凋亡率进行分析。结果:慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞经诱导分化形成的DCs,与正常人相比,表达协同刺激分子CD80、CD86水平均较低;刺激同种异体淋巴细胞增殖能力也低于正常人;DCs凋亡率明显增高。结论:慢性乙型肝炎患者外周血的DCs免疫功能处于抑制状态,而HBV感染导致的DCs凋亡增多可能是引起DCs功能障碍的原因之一。     

人外周血来源树突状细胞诱导培养及鉴定的实验研究

目的探讨树突状细胞(DC)体外培养的方法。方法用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素4、重组人肿瘤坏死因子α等细胞因子自外周血单个核细胞诱导分离DC,流式细胞仪检测其表面标志,四氮唑蓝法测定其刺激同种异体淋巴细胞增殖能力。结果体外培养第10天,大量细胞出现典型的树突状形态;流式细胞仪检测高表达CD80、CD86、CD83、CD40、CD1a、人白细胞DR抗原;在体外能强烈刺激同种异体混合淋巴细胞增殖反应。结论该方法可获得较高纯度典型的DC,为DC的临床免疫治疗提供实验依据。     

体外负载HBeAg对乙型肝炎免疫耐受期患者树突状细胞功能的影响

目的探讨HBeAg对体外活化乙型肝炎免疫耐受期患者树突状细胞（DC）功能的影响。方法将24例患者分为HBV-1组（免疫耐受期）、HBV-2组（低或非HBV复制期）,并设正常对照组,自各组外周血单核细胞中诱导培养DC,经HBeAg体外负载后,分别检测各组负载前后的DC表型、DC在同种异体混合淋巴细胞反应中的刺激能力和细胞因子的分泌。结果（1）与其他两组比较,HBV-1组患者DC表面分子表达率降低、刺激同种异体T淋巴细胞增殖和分泌IL-12的能力较弱;（2）经HBeAg刺激后的DC表面分子表达率升高,3组间CD86、人类白细胞抗原-DR表达率无明显差异,HBV-1组患者DC的CD80表达率较其他两组降低（P〈005）;（3）混合淋巴细胞反应实验显示,HBeAg负载的DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力增强,在DC：T比例为1：5、1：10、1：20时,各组之间的刺激指数无明显差异;（4）HBeAg负载后的DC分泌IL-12水平较负载前明显增高,3组间细胞因子水平无明显差异。结论免疫耐受期乙肝患者存在DC成熟障碍和功能缺陷,HBeAg体外负载可提高DC功能,从而可能对增强免疫耐受期患者的HBeAg特异性免疫应答具有重要作用。     

Serrate1基因转染对小鼠树突状细胞生物学特性的影响

目的 探讨Serratel基因转染对小鼠树突状细胞生物学特性的影响。方法 将Serratel基因体外转染小鼠DCs，经G418筛选后，Western blot检测DCs Serratel的表达，流式细胞仪检测转染后DCs表面共刺激分子的表达，混合淋巴细胞反应观察DCs对T淋巴细胞增殖的影响。结果 Serratel基因转染的树突状细胞Serratel的表达较未转染组明显增高，转染Serratel基因的DCs表面CD80、CD86等共刺激分子的表达与对照组比较无明显改变（P〉0．05）；在混合淋巴细胞反应中，转染DCs对T细胞的增殖有抑制作用，而空载体pcDNA3．1（＋）对照组与未转染组的树突状细胞具有强烈的激发T细胞增殖的能力。结论 Serratel基因转染能在不影响DCs表面共刺激分子表达的情况下显著抑制T细胞活化。     

痘苗病毒载体介导爱泼斯坦-巴尔病毒潜伏期膜蛋白2A基因转染树突状细胞对其功能的影响

目的：探讨痘苗病毒载体介导爱泼斯坦－巴尔病毒（EBV）潜伏期膜蛋白2A（LMP2A）基因转染树突状细胞（DC）对DC的表型和功能的影响，以及EBV相关肿瘤免疫治疗性疫苗的可行性，方法：用EBV－LMP2A基因重组痘苗病毒（Vac-LMP2A)转染成熟的DC，流式细胞术（FACS）检测转染前后DC表面分子CD1a,CD83,CD40,CD80,HLA-DR变化，3H－TdR掺入法检测转染前后DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖等功能的改变。结果：转染后LMP2A蛋白在DC细胞内高表达，Vac-LMP2A转染成熟DC前后对其表面共刺激分子及特征性表面标志无影响，转染后的DC仍具有较强的刺激同种异体TI林巴细胞增殖的能力。结论：痘苗病毒载体是介导外源基因LMP2A转染DC的有效载体，Vac-LMP2A转染成熟DC对DC表型和功能无明显影响，是EBV相关肿瘤如鼻咽癌免疫治疗的理想载体。     

HBV全基因真核表达载体的构建及表达

目的：为诱导HBV特异性CTL，构建HBV全基因真核表达载体，并对其在细胞中的表达进行了初步研究。方法：以EcoRⅠ酶切pBR322-2HBV和pcDNA3，回收完整的HBV基因片段及线性化的载体pcDNA3，T4 DNA连接酶连接HBV和pcDNA3，转化、筛选，酶切鉴定HBV的插入方向。以脂质体将构建的pcDNA3-HBV转染HepG2肝癌细胞，经G418筛选，ELISA检测细胞培养上清中HBsAg、HBeAg的表达，RT-PCR检测转染细胞中PreSl mRNA的表达。结果：经酶切鉴定获得正向插入的pcDNA3-HBV，转染HepG2后，建立了新的肝癌细胞系HepG2．02G，细胞培养上清中可检测到高水平的HBsAg，PreSl mRNA在转染细胞中表达。结论：经体外重组，获得携带全长HBV基因片段的pcDNA3-HBV表达载体，并可在肝癌细胞中稳定表达。     

尿酸刺激树突状细胞成熟与Toll样受体mRNA表达关系的研究

目的 观察未成熟树突状细胞（DC）经尿酸刺激成熟过程中,TLRs mRNA的表达情况。方法 分离培养小鼠骨髓来源未成熟 DC。以尿酸体外刺激48 h后,RT-PCR方法检测DC TLR2 mRNA、TLR3 mRNA、TLR4 mRNA 、IL-12p70 mRNA等的表达,ELISA法检测上清IL-12P70水平。尿酸及NF-κB抑制剂PDTC刺激不同时间点时,免疫印迹法检测DC NF-κB p65活化情况。结果 尿酸刺激后DC TLRs mRNA 表达出现明显的变化,与培养基对照组相比,TLR2 mRNA、TLR3 mRNA、TLR4 mRNA表达下降（P＜0.05）,以TLR4 mRNA下降最明显;IL-12p70表达显著增高（P＜0.05）;与LPS组相比,TLRs mRNA 与IL-12p70表达水平相似（P＞0.05）。尿酸刺激后15～45 min,DC核因子NF-κB p65显著活化。结论 尿酸能调节未成熟树突细胞 TLR2 mRNA、TLR3 mRNA、TLR4 mRNA及IL-12 p70的表达,促进NF-κB向核内转移,促进DC成熟。TLRs mRNA的动态变化可能为其诱导 DC 成熟及免疫功能提高的机制之一。     

TLR3配体polyI：C经TRIF／NF—KB途径抑制Bewo细胞中HBV复制

摘要：目的探讨T0Ⅱ样受体3（TLR3）配体聚肌苷酸胞苷酸（polyI：C）抑制人滋养层细胞Bewo中乙型肝炎病毒（HBV）复制的作用机制。方法首先将2斗g1．3倍HBV全基因重组质粒pcDNA3．1（＋）-HBVl．3转染Bewo细胞,12h后,以TLR3配体polyI：C处理3d。然后以polyi：C处理Bewo细胞,观察IFN-B、TNF_d表达的动力学。最后,观察核因子-KB（NF-KB）拈抗剂PDTC对polyI：C诱导Bewo细胞产生细胞因子的作用。采用微粒子酶免疫分析法（MEIA）和荧光定量PCR法分别检测HBsAg、HBeAg和HBVDNA水平,并以ELISA和RT-PCR分别检测IFN-B、TNF-Ⅸ水平及TIR结构域的转接蛋白（TRIF）、髓样分化蛋白88（MyD88）表达。结果与对照组比较,polyIC可显著抑制Bewo细胞中HBV复制,差异有统计学意义（P〈O．01）,且polyI：C可显著诱导Bewo细胞产生IFN-p和TNF_d（P〈O．05）,呈时间和剂量依赖性。PDTC可抑制polyhC诱导细胞产生TNF_Ot,显著低于对照组（P〈0．01）,但对IFN-B无显著作用（乃0D5）。与对照组比较,polyI：c可诱导HBV重组质粒转染的Bewo细胞表达TRIFmRNA（P〈O．01）。结论TLR3配体poyZ：C可能通过rrRIF依赖性途径诱导Bewo细胞产生IFN-B和TNF-d,且TNF-a产生还涉及NF-KB途径,并最终抑制Bewo细胞中HBV复制。     

持续表达的丙型肝炎病毒NS4B激活HepG2细胞内质网应激反应的研究

目的研究持续表达的丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)对HepG2细胞内质网应激反应的影响。方法 NS4B重组真核表达质粒pcDNA3.1(-)NS4B通过脂质体转染HepG2细胞,G418筛选、基因组PCR和Western blot鉴定稳定转染细胞;RT-PCR检测稳定转染细胞内人X盒结合蛋白1(XBP1)mRNA剪接,荧光素酶试验检测稳定转染细胞内GRP78启动子、XBP1启动子和核因子κB(NF-κB)活性。结果基因组PCR和Western blot鉴定证实NS4B基因整合到转染HepG2细胞的染色体上,并有效表达;在NS4B稳定转染的HepG2细胞中,检测到XBP1mRNA剪接、XBP1和Grp78启动子激活、Ca2+稳态变化及NF-κB激活。结论 NS4B在HepG2的稳定表达诱导了内质网应激反应,揭示NS4B可能通过诱导肝细胞内质网应激反应在HCV感染及其致病性中发挥作用。     

Role of myeloid differentiation factor 88 in HSP60 signal transduction in dendritic cells

Objective: To explore the role and mechanism of myeloid differentiation factor88 (MyD88) in HSP60 signal transduction in dendritic cells. Methods:Mouse DCs were cultured from murine bone marrow cells. The DC marker CD11c was detected by flow cytometry, then DCs were divided into control group, HSP60 groupand RNA interference group. Control group was cultured under normal condition, and HSP60 group was cultured with 10 μg/ml of HSP60. RNA interference group was first cultured with MyD88 siRNA forl2 hours and then HSP60 was added into the culture mixture. All groups were cultured for 48 hours. Immunochemistry was used to detect the concentration of MyD88 and NF- κB. Western blot was used to detect the concentration of MyD88. Flow cytometry and mixed lymphocyte reaction (MLR) were used to detect the phenotype and functional properties of DCs. ELISA was used to detect the concentration of TNF-α, IFN-γ and IL-12 in the supernatant. Results:The expression of CD11c in marine bone marrow DCs was 88.76%. HSP60 stimulation increased the expression of CD80, CD86, MHC-Ⅱ in DCs and TNF-α, IFN-γ, IL-12 secretion in the supematant. HSP60 stimulation also increased the level of MyD88 in the cytoplasm and promoted the shift of NF-κB to karyon and the proliferation of allogeneic T cells. MyD88 siRNA could decreaseMyD88 and inhibit these effects induced by HSP60. Conclusion:HSP60 activates DCs through MyD88-dependent pathway. MyD88 plays a critical role in HSP60 signal transduction. Inhibition of MyD88 may be a novel way for treating disease correlated with HSP60.     

Dexamethasone impairs the differentiation and maturation of murine dendritic cells by Toll-like receptor 4-nuclear factor-κB pathway

Background Recent studies have demonstrated that dexamethasone （DEX） interferes with immune responses by targeting key functions of dendritic cells （DCs） at the earliest stage. However, the cellular and molecular mechanisms are still incompletely understood. This study aimed to explore the possible mechanisms by investigating the roles of DEX on differentiation, maturation ＆ function of murine DCs and the effects of DEX on DCs via Toll-like receptor 4 （TLR4）-nuclear factor （NF）-KB mediated signal pathway. Methods Immature DCs （imDCs） were cultured from murine bone marrow （BM） cells. We added DEX into culture medium at different time. The expression of CD11c, CD86 and I-Ab （mouse MHC class II molecule） was determined by flow cytometry. We determined the expression of NF-κB and its inhibitory protein I-κBα by electrophoretic mobility shift assay （EMSA） and Western blotting, respectively. The productions of interleukin （IL）-12p70 and IL-10 in cell culture supernatants were determined by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Results DEX impaired differentiation of DCs from murine bone marrow progenitors, and inhibited lipopolysaccharide （LPS） induced maturation of DCs. DEX significantly inhibited NF-κB expression of normal DCs, the higher the DEX concentration or the longer the DEX treatment time, the more obvious the effect. However, DEX had little effect on LPS-induced NF-KB activation, and partially impaired LPS-induced I-κBα degradation. DEX significantly decreased LPS induced IL-12p70 production by DCs. Interestingly, our results showed a synergistic effect between DEX and LPS on the production of IL-10 by DCs. Conclusions DEX inhibits the differentiation and maturation of murine DCs involved in TLR4-I-κB-NF-κB pathway, and also indirectly impairs Thl development and interferes with the Thl-Th2 balance through IL-12 and/or IL-10 secretion by DCs.     

RhoB对胰腺癌细胞SW1990中NF-κB转录活性调控研究

目的观察RhoB对人胰腺癌SWl990细胞中NF—κB转录活性的影响。方法将空载体质粒（pcDNA3）、野生型RhoB过表达质粒（RhoB—wt）、RNA干扰对照质粒fRNAi—control）、RhoBRNA干扰质粒（RhoB—RNAi）、RhoB激活质粒（RhoB—V14）或RhoB失活质粒（RhoB—N19）和NF—κB报告基因质粒（NF—κB—luc）以及内参照质粒（pRLSV40-luc）共转染人SW1990细胞中,24h后用双萤光素酶检测基因的转录活性,Western Blot检测RhoB蛋白。结果SW1990细胞中,转染0．8μg的RhoB过表达和激活均能抑制NF—κB报告基因的活性,分别是对照的54％和21％;RhoBIRNA干扰后NF—κB的转录活性上调为对照的1．5倍。结论在胰腺癌SW1990细胞中RhoB能抑制NF—κB的转录活性。     

猪苓多糖对慢性乙型肝炎患者单核细胞源树突状细胞的影响初探

目的 探讨猪苓多糖（PPS）对慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血单核细胞源树突状细胞（MoDC）的影响。方法 从CHB患者外周血中分离出单核细胞（Mo）,然后将Mo与GM-CSF、IL-4体外培养9天,并于培养第6天加入PPS共同培养,在倒置显微镜下观察DC的形态,用MTT法测定DC刺激同种异体T细胞增殖的能力,用ELISA检测DC培养上清中IL-12p40＋p70的含量,并与对照组比较。结果 PPS可刺激DC分泌IL-12p40＋p70,增强DC刺激同种异体T细胞增殖的能力。结论 PPS可以增强CHB患者外周血MoDC的免疫功能,提示其可能通过调节DC的功能参与免疫应答。     

心力衰竭患者外周血单个核细胞核转录因子κB/P65的表达及卡维地洛的影响

目的：探讨慢性心力衰竭（CHF）患者外周血单个核细胞（PBMCs）核因子-кB（NF-кB）/P65的表达及卡维地洛的干预作用。方法：对25例CHF患者和17例健康对照组分离出的PBMCs进行培养,并对二组培养的PBMCs分成3组：空白对照组、脂多糖（LPS）刺激组和卡维地洛干预组,共培养24h,对3组培养后的PBMCsNF-кB/P65的表达进行免疫组化染色检测和半定量分析。结果：CHF患者PBMCsNF-кB/P65胞核染色阳性率非常明显高于健康对照组（22%±8%vs9%±2%,P〈0.01）。LPS刺激下,CHF患者和健康对照组PBMCsNF-кB/P65胞核染色阳性率均极显著增加（38%±9%,27%±13%,P〈0.01）;而在卡维地洛干预下,CHF患者和健康对照组PBMCsNF-кB/P65胞核染色阳性率则极显著下降（20%±8%,18%±7%,P〈0.01）。结论：心力衰竭患者NF-кB/P65表达增高,而卡维地洛可下调LPS刺激下NF-кB/P65表达增高。这可能是卡维地洛降低慢性心衰死亡率的机制之一。     

α-干扰素联合GM-CSF体外诱导培养脐血树突状细胞及其功能的测定

目的 探讨重组人α-干扰素(rhIFN-α)联合重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)体外诱导培养脐血树突状细胞(DCs)的实验方法。方法 人脐血贴壁单个核细胞加入rhIFN-α及rhGM-CSF诱导培养,镜下观察培养细胞形态;流式细胞术检测培养细胞CD83、CD86的表达;MTT法检测诱导培养的DCs体外刺激同种异体T淋巴细胞增殖的活性。结果 人脐血贴壁单个核细胞经rhIFN-α联合rhGM-CSF共同培养后,第7d镜下可见有表面呈树状突起的DCs;细胞免疫表型检测结果示培养细胞有成熟DCs特异性标记CD83及共刺激分子CD86表达;rhIFN-α为600U／ml、rhGM-CSF为2000U／ml时为脐血DCs诱导培养的合适浓度(培养细胞CD83^ CD86^ 细胞比率最高);以诱导培养7d的脐血细胞(含DCs)作为刺激细胞与同种异体T淋巴细胞(反应细胞)以不同比例混合培养时,DCs均可刺激其增殖,其中以反应细胞：刺激细胞为20：1时最明显。结论 rhIFN-α联合rhGM-CSF细胞因子体外诱导人脐血贴壁单个核细胞,可生成具有典型形态及功能的成熟DCs。