人地中海贫血基因β654的克隆与序列分析

【目的】克隆人地中海贫血基因β654,并进行序列分析,为下游转基因小鼠模型的建立奠定工作基础。【方法】以PCR法扩增获得人β654基因,将其克隆入卸除了人β基因的质粒pBGT51中,酶切、反向点杂交及测序法鉴定重组质粒。【结果】所构建的重组质粒中含人β654基因,其引入方向正确,序列分析结果正确。【结论】构建所得的重组质粒可用于下游的转基因工作。     

人苯丙氨酸羟化酶基因克隆及其原核表达质粒的构建

[目的]克隆健康人苯丙氨酸羟化酶基因全长cDNA序列,构建并鉴定其原核表达质粒pTrcHisB/PAH。[方法]采用RT-PCR方法从人肝组织中扩增PAH基因全长cDNA,T/A克隆到pMD18-T载体中,双酶切后将cDA亚克隆入pTrcHisB载体,构建pTrcHisB/PAH质粒,经限制性内切酶鉴定并测序。[结果]人PAH基因cDNA正确克隆入pTrcHisB表达载体,与Genebank中PAH基因序列一致。[结论]成功构建pTrcHisB/PAH表达质粒,为进一步进行研究PAH蛋白表达和重组蛋白活性鉴定奠定基础。     

人苯丙氨酸羟化酶基因克隆及其原核表达质粒的构建

 [目的]克隆健康人苯丙氨酸羟化酶基因全长cDNA序列,构建并鉴定其原核表达质粒pTrcHisB/PAH。[方法]采用RT-PCR方法从人肝组织中扩增PAH基因全长cDNA,T/A克隆到pMD18-T载体中,双酶切后将cDA亚克隆入pTrcHisB载体,构建pTrcHisB/PAH质粒,经限制性内切酶鉴定并测序。[结果]人PAH基因cDNA正确克隆入pTrcHisB表达载体,与Genebank中PAH基因序列一致。[结论]成功构建pTrcHisB/PAH表达质粒,为进一步进行研究PAH蛋白表达和重组蛋白活性鉴定奠定基础。     

腺病毒载体介导的大鼠DNA多聚酶β重组体的构建及其在PC12细胞中的表达

[目的]为探讨DNA多聚酶β在神经细胞损伤中的作用与机制,构建其重组腺病毒载体,并在PC12细胞中表达.[方法]RT-PCR获取大鼠DNA多聚酶β(POLβ)的编码序列,TA克隆测序,酶切POLβ基因并连入穿梭质粒pAdTrack-CMV,电转至含腺病毒pAdeasy骨架质粒的大肠杆菌BJ5183.重组腺病毒质粒(pAd-polβ)和Lipofectamine2000转染293细胞,用重组腺病毒感染PC12细胞.[结果]10个TA克隆中有3个克隆的序列与GENE BANK中大鼠POLβ cDNA序列完全一致,同源重组检测时30个克隆中有8个含目标条带.DNA序列正确的POLβ重组腺病毒质粒转染293细胞后,感染Ad-polβ的293及PC12细胞荧光显微镜下可见绿色荧光,重组腺病毒Ad-polβPCR鉴定含目标条带,Ad-polβ感染PC12细胞Western Blot检测到POLβ蛋白表达.[结论]成功构建了大鼠DNA多聚酶β的腺病毒重组体并在PC12细胞中表达     

重组突变型DNA聚合酶β表达载体pcDNA3.1—polβ的构建

目的：构建含突变型polβ基因重组表达载体。方法：从食管癌标本中提取总RNA,反转录合成cDNA,克隆入pCDNA3．1质粒。以通用鉴定引物PCR扩增、小量提取质粒酶切鉴定重组质粒,并进行测序。结果：测序结果证实重组载体中的外源片段序列与所选取的标本完全相符。结论：成功构建了含突变型polβ基因重组表达载体,可应用于下游研究。     

TH和GDNF双基因表达载体的构建及其在MES23.5细胞中的表达

目的 构建酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)和胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)双基因表达载体并检测其在体外的表达,为帕金森病提供新的治疗措施.方法 采用分子克隆技术,从pWAV2-TH质粒酶切获得人TH基因片段,将其克隆入真核表达质粒载体pIRES的上游,构建出pIRES-TH.PCR法扩增小鼠GDNF基因片段,克隆入pIRES-TH的下游,构建出携带TH和GDNF双基因的重组质粒pIRES-TH-GDNF.用酶切电泳验证重组结果的正确性,测序检测质粒重组后的序列.随后将重组质粒用Lipofectamine2000转染至MES23.5细胞,经G418筛选后,以RT-PCR及免疫荧光法检测TH和GDNF基因在mRNA及蛋白水平的表达.结果 重组质粒酶切后其片段大小与预期结果相同,测序发现基因序列完全正确.转染后MES23.5细胞中TH和GDNF基因的水平明显升高(P＜0.05).结论 重组pIRES-TH-GDNF质粒构建成功并能在体外正确表达TH和GDNF基因.     

人血管内皮生长因子的克隆表达及活性鉴定

[目的]克隆人血管内皮生长因子165基因，并测定蛋白质的表达及鉴定其活性。[方法]用PCR法从人心脏cDNA文库中钓取目的基因VEGF165，插入质粒PCU19中并测序鉴定，构建真核表达重组质粒AdtrackCMV-VEGF165转染293细胞，用RNA斑点杂交和Western blot方法检测VEGF165基因表达，并通过Miles试验检测VEGF156蛋白活性。[结果]PCR产物为582bp，测序结果表明其序列正确，在RNA和蛋白水平检测到VEGF165基因表达，VEGF165蛋白相对分子质量为22ku，具有生物学活性。[结论]成功地克隆了有表达生物学活性的VEGF165基因。     

反义重组腺病毒质粒pAdxsi-GFP-hVEGF的构建与鉴定

目的构建反义重组腺病毒质粒pAdxsi-GFP-hVEGF。方法从人外周血细胞中提取总RNA,RT-PCR法反转录合成人cDNA文库。设计带有酶切位点的引物,调取VEGF目的基因,插入pShuttle-GFP-CMV穿梭载体。经鉴定序列正确后,将VEGF目的基因构建至亚克隆重组腺病毒质粒pAdxsi中。结果成功构建反义重组腺病毒质粒pAdxsi-GFP-hVEGF,经酶切鉴定,目的基因分子量与预计的相同,测序插入载体部位正确。结论反义重组腺病毒质粒pAdxsi-GFP-hVEGF构建正确、稳定,为进一步抑制人VEGF基因的表达和体内外实验打下了良好的基础。     

弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建

目的　构建弓形虫棒状体蛋白2（POP2）基因真核表达重组质粒。方法　根据ROP2基因已知序列,设计合成一对引物,上、下游引物分别引入EcoRI、SalI酶切位点,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段,插入pGEX-4T-1质粒,构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2,而后经EcoR　I、Not　I双酶切出ROP2基因片段,再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2。结果　ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子,克隆基因测序结果与已知序列基本吻合。结论　在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2,为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础。     

重组体pcDNA3.1(+)-tyr的构建及在小鼠NIH3T3细胞中的表达

[目的]克隆酪氨酸酶基因(tyr),构建pcDNA3.1(+)-tyr真核表达重组体,并导入NIH3T3细胞表达。[方法]用RT-PCR法从小鼠B16黑色素瘤细胞中克隆tyr全长cDNA片段,利用DNA重组技术将其定向插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)的T7启动子下游,并用脂质体法导入NIH3T3细胞,RT-PCR,酪氨酸酶活性测定及多巴染色法检测tyr的表达。[结果]成功克隆1.74kb的全长tyr cDNA片段,经测序证实与GenBank所报道的序列完全一致,tyr准确克隆入pcDNA3.1(+)的多克隆位点,RT-PCR及酪氨酸酶活性测定等方法检测到转染了重组体的NIH3T3细胞中有tyr的表达。[结论]本实验成功构建了pcDNA3.1(+)-tyr真核表达重组体,并成功导入NIH3T3细胞中表达。     

弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建

目的 构建弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）基因真核表达重组质粒，方法 根据ROP2基因已知序列，设计合成一对引物，上，下游引物分别引入EcoRI,SalI酶切位点，用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段，插入pGEX-4T-1质粒，构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2，而后经EcoRI,NotI双酶切除ROP2基因片段，再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2。结果 ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp，重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子，克隆基因测序结果与已知序列基本吻合。结论 在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2。为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础。     

小鼠肥大细胞瘤P815特异抗原P1A的克隆与表达

目的 克隆小鼠肥大细胞瘤Ｐ８１５细胞株的ＰＩＡ基因以制备肿瘤ＤＮＡ疫苗,方法 用ＲＴ－ＰＣＲ方法制备ＰＩＡ基因,以哺乳细胞高效表达质粒ｐＣＩ－ｎｅｏ为载体,构建重组ＤＮＡ疫苗。重组体用克隆位点上游和下游的Ｔ７和Ｔ１３启动了序列为测序引物,用自动测序仪测定鉴定克隆的正确性。再将鉴定过的重组质粒用磷酸钙法转化２９３细胞,用ＲＴ－ＰＣＲ法鉴定转化细胞中ＰＩＡ基因的表达。结果 正确构建了ＰＩＡ／ｐＣＩ－ｎ     

新基因s-lap编码区的克隆及其重组表达质粒PHB/s-lap的构建

目的：克隆新基因s-lap编码区序列并构建其重组表达质粒。 方法：利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法,以可见光损伤早期的培养的猪视网膜色素上皮（RPE）细胞ds cDNA为模板,扩增新基因s-lap编码区序列;利用基因重组技术构建PHB/s-lap重组表达质粒。 结果：经测序证实获得了正确的新基因s-lap编码区序列,酶切鉴定及DNA序列分析表明已经将s-lap基因编码区序列克隆到PHB表达载体, 成功地构建了PHB/s-lap重组表达质粒。结论：成功地克隆了新基因s-lap编码区序列,并构建了其重组表达质粒PHB/s-lap。     

TGF—β1原核表达载体的构建

目的：克隆人TGF—β1基因,为TGF—β1的研究提供平台。方法：应用RT—PCR技术扩增人TGF—β1基因序列,将TGF-β1基因插入载体PET-28a,构建pET28a—TGF—β1重组质粒。结果：经限制性内切酶鉴定及DNA序列测定,重组质粒PET-28a—TGF—β1序列及阅读框架正确。结论：获得了TGF—β1编码序列和表达载体,能满足进一步实验的需要。     

VEGF基因RNA干扰质粒的构建与鉴定

目的构建干扰血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）基因RNA表达的重组质粒。方法设计3组针对VEGF基因的核糖核酸干扰（RNA interference,RNAi）序列,应用基因重组技术克隆入载体pcDNA3.1中,重组质粒分别命名为pcDNA3.1-VEGF-LH1、pcDNA3.1-VEGF-LH2和pcDNA3.1-VEGF-LH3,用DNA直接测序法和双酶切法鉴定构建的重组质粒。结果 DNA测序证实克隆入载体pcDNA3.1（-）中的序列正确,双酶切证实RNA干扰序列正确插入载体pcDNA3.1（-）。结论成功构建针对VEGF基因的RNAi质粒,为进一步研究该RNAi质粒在脉络膜新生血管形成中的作用奠定了基础。     

β1整合素启动子荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定

目的克隆β1整合素(CD29)启动子区基因全长序列,构建并鉴定β1整合素启动子全长序列荧光素酶报告基因载体pGL3-β1。方法以含β1整合素启动子基因全长序列的基因片段(2 735 bp)的重组pGEM-T easy载体为模板,用含有酶切位点的特异性引物扩增出整合素β1启动子基因全长序列1 756 bp,克隆至荧光素酶表达载体pGL3-basic,构建含正确目的基因的表达载体pGL3-β1,并NheⅠ、XhoⅠ酶切、PCR及测序鉴定;并以该质粒转染人表皮细胞株HaCaT进行活性检测。结果酶切、PCR及序列测定表明,克隆获得的1 756 bp与GenBank DNA序列数据库对比分析序列一致,插入方向正确;且pGL3-β1启动子在人表皮细胞株HaCaT中有明显转录活性。结论成功构建了β1整合素启动子基因全长序列荧光素酶报告基因载体,为下一步研究人β1整合素启动子的活性分析、基因表达调控机制及其信号转导通路等研究奠定基础。     

人TGFβ1cDNA高表达重组质粒的构建

目的为了得到基因工程制备的人重组TGFβ1,构建人TGFβ;cDNA高表达重组质粒。方法从人血小板中提取总RNA,经RT－PCR得到TGFβ;cDNA基因,并克隆到表达质粒pBLMVL2中,构建了在PL启动控制基因表达质粒pBLMVL2－TGFβ;,使其在大肠杆菌中进行温敏诱导表达。结果RT－PCR得到的TGFβcDNA经DNA序列分析与文献报道一致,pBLMVL2－TGFβ1在大肠杆菌中表达产物人重组TGFβ1经还原型SDS－PAGE电泳,呈一条蛋白条带,分子量12．5kd,表达产物约占全菌蛋白20％。结论构建的重组质粒pBLMVL2－TGFβ1能高表达人重组TGFβ1。     

慢性粒细胞白血病bcr/abl的糖基化磷脂酰肌醇锚定修饰及在COS-7细胞膜上的表达

目的 构建与糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol,GPI)锚定序列相连的bcr/abl真核表达质粒,并检测其在COS-7细胞中基因和膜蛋白的表达.方法 以编码慢性粒细胞白血病bcr/abl融合蛋白全长序列的migP210质粒为模板,通过PCR扩增获得654 bp的bcr/abl融合基因片段,双酶切后定向插入真核表达载体pBudCF4.1中,经鉴定获得重组质粒pBB.同时用RT-PCR扩增人外周血淋巴细胞CD24分子中的GPI获得约243 bp的锚定序列,双酶切后克隆人pBB质粒中与ber/abl基因下游羧基端相连,获得重组质粒pBBG.在多聚阳离子介导下将pBBG质粒转染COS-7细胞,采用RT-PCR和Western blot检测bcr/abl融合基因和蛋白的表达.结果 经酶切和测序鉴定证实,由GPI锚定连接的ber/abl融合基因插入片段正确;RT-PCR检测到转染细胞中有bcr/abl融合基因,Western blot检测到转染细胞膜上有hcr/abl融合蛋白的表达.结论 成功构建由GPI锚定修饰的bcr/abl重组质粒pBBG,并能在COS-7细胞膜上表达出bcr/abl融合蛋白.     

腺病毒载体介导的大鼠DNA多聚酶β重组体的构建及其在PC12细胞中的表达

【目的】为探讨DNA多聚酶β在神经细胞损伤中的作用与机制，构建其重组腺病毒载体，并在PC12细胞中表达。【方法】RT—PCR获取大鼠DNA多聚酶β（POLβ）的编码序列，TA克隆测序，酶切POLβ基因并连人穿梭质粒pAdTrack—CMV，电转至含腺病毒pAdeasy骨架质粒的大肠杆菌BJ5183。重组腺病毒质粒（pAd—polp）和Lipofectamine2000转染293细胞，用重组腺病毒感染PC12细胞。【结果】10个TA克隆中有3个克隆的序列与GENE BANK中大鼠POLβ cDNA序列完全一致，同源重组检测时30个克隆中有8个含目标条带。DNA序列正确的POLβ重组腺病毒质粒转染293细胞后，感染Ad—polβ的293及PC12细胞荧光显微镜下可见绿色荧光，重组腺病毒Ad—polβPCR鉴定含目标条带，Ad—polβ感染PC12细胞Western Blot检测到POLβ蛋白表达。【结论】成功构建了大鼠DNA多聚酶β的腺病毒重组体并在PC12细胞中表达     

大鼠DNA多聚酶β基因克隆及其腺病毒重组体构建

目的 构建大鼠DNA多聚酶β基因克隆及其腺病毒介导的表达载体。方法 提取大鼠脑组织总RNA．用逆转录PCR扩增DNA多聚酶β（POLB）的编码区，与T载体连接，作DNA测序后，酶切POLB基因并连入腺病毒穿梭质粒pAdTraek-CMV，电转至含腺病毒pAdeasy骨架质粒的大肠杆菌BJ5183。酶切鉴定，重组腺病毒质粒（pAd-polb）Lipofectamine2000转染293细胞，用293细胞扩增重组腺病毒。结果 8个TA克隆中有2个克隆的序列与GENE BANK中大鼠POLB cDNA序列完全一致。DNA序列正确的POLB重组腺病毒质粒Ad-polb转染293细胞后，荧光显微镜下可见绿色荧光。结论 用TA克隆和AdEasy系统，成功构建了大鼠DNA多聚酶β的腺病毒重组体。