西洋参β-香树脂合成酶基因的克隆和生物信息学分析

目的 克隆西洋参三萜皂苷生物合成途径关键酶β-香树脂合成酶（bAS）全长cDNA,为研究西洋参皂苷生物合成与次生代谢调控奠定基础。方法 采用大规模ESTs测序和cDNA末端扩增（RACE）技术克隆西洋参bAS基因。结果 获得了西洋参bAS基因全长cDNA,命名为PqbAS（GenBank注册号：JX185490）,其核苷酸序列长度为2 309 bp,含有1个开放阅读框,编码631个氨基酸多肽。保守结构域搜索显示PqbAS含有环氧角鲨烯环化酶（OSCs）共有的活性位点和保守基序。Singal P4.0分析表明PqbAS属于非分泌型蛋白,Tmhmm 2.0分析表明其为非跨膜蛋白。实时荧光定量PCR显示PqbAS基因在各个器官中均有表达,在花和幼茎中高表达,根和叶中表达量相对较低。结论 首次克隆了PqbAS基因全长序列,为研究其表达特性以及在三萜皂苷生物合成中的功能奠定了基础。     

实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞CD_(58)基因的表达

目的:应用实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)CD58基因的表达。方法:提取PBMC总RNA并逆转录为cDNA,实时荧光定量PCR法分别检测43例HBV感染者及11例正常对照的PBMCCD58基因的表达水平,同时检测血清ALT、AST水平。结果:乙型肝炎各组患者PBMCCD58mRNA表达水平较正常对照组明显增高,差异均有显著性。乙型肝炎患者PBMCCD58mRNA水平与血清ALT、AST呈显著正相关。结论:实时荧光定量PCR可以准确定量检测基因的表达;乙型肝炎患者PBMCCD58基因表达水平与疾病严重程度及肝细胞损伤严重程度有关。     

重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体,为淋巴瘤基因治疗的实验研究奠定基础.方法 设计引物扩增获得目的基因小鼠MIP-1α和B7-1基因的全长编码序列cDNA,将目的基因与经酶切线性化的慢病毒载体进行定向连接,其产物转化感受态细胞,对长出的阳性克隆进行PCR鉴定和直接测序序列分析.MIP-1α和B7-1目的基因质粒转染293T细胞,观察绿色荧光蛋白(GFP)表达,采用Western Blot法检测其蛋白表达,实时荧光定量PCR,检测慢病毒浓缩液的滴度.结果 成功构建了重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体,实时荧光定量PCR证实MIP-1α、B7-1基因重组慢病毒载体的滴度均达2.00E+8 TU/mL.结论 本研究成功构建并包装出高滴度的小鼠MIP-1α和B7-1基因重组慢病毒载体,为淋巴瘤基因治疗的实验研究奠定了基础.     

实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞CD58基因的表达

目的：应用实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)CD58基因的表达。方法：提取PBMC总RNA并逆转录为cDNA，实时荧光定量PCR法分别检测43例HBV感染者及11例正常对照的PBMC CD58基因的表达水平，同时检测血清ALT、AST水平。结果：乙型肝炎各组患者PBMC CD58 mRNA表达水平较正常对照组明显增高，差异均有显著性。乙型肝炎患者PBMC CD58mRNA水平与血清ALT、AST呈显著正相关。结论：实时荧光定量PCR可以准确定量检测基因的表达；乙型肝炎患者PBMC CD58基因表达水平与疾病严重程度及肝细胞损伤严重程度有关。     

荧光实时定量PCR检测老年人外周血淋巴细胞β1和β2肾上腺素能受体基因mRNA表达

目的建立荧光实时定量PCR法检测老年人外周血淋巴细胞β1和β2肾上腺素能受体（AR）基因mRNA表达。方法随机选择ASAⅠ-Ⅱ级老年患者30例,分离外周静脉血淋巴细胞,采用荧光实时定量PCR法检测β1和β2-AR基因mRNA表达,并与半定量PCR检测结果进行比较。结果30例患者外周血淋巴细胞荧光实时定量PCR均检出β1和β2-ARmRNA表达,不同性别组同-基因表达量无显著差异（P〉0.05）;荧光实时定量PCR检测β2-AR mRNA表达量显著高于β1—AR mRNA（P〈0．001）,而半定量PCR随着循环次数增加,β1和β2-ARmRNA表达差异减小。结论所建立的荧光实时定量PCR成功检测老年人外周血淋巴细胞β1和β2-AR基因mRNA表达,有较高的灵敏性及特异性;半定量PCR扩增平台期影响试验结果判断。     

多花黄精多糖对STZ诱导的Ⅰ型糖尿病小鼠影响作用研究*

目的研究多花黄精多糖对Ⅰ型糖尿病小鼠血糖、存活率及肝保护等的影响。方法采用连续腹腔注射链脲佐菌素（STZ），建立雌性C57BL/6c小鼠Ⅰ型糖尿病模型。实验分四组：空白对照组、模型组、多花黄精多糖低剂量组（450 zmg·kg-1）和高剂量组（900 mg·kg-1）。实验中检测各组小鼠存活率、体重以及血糖变化。实验结束后，分离小鼠肝脏，采用HE染色法评价肝脏病理变化，实时定量PCR（qPCR）法检测肝脏中白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）、胰岛素受体底物1（IRS-1）mRNA水平。结果雌性C57BL/6c小鼠连续5天腹腔注射STZ，一周后可使血糖明显升高。在高血糖状态下，模型组小鼠死亡率急剧上升，多花黄精多糖高剂量显著提高模型小鼠的存活率；多花黄精多糖低、高剂量可显著增加模型小鼠体重；同时，多花黄精多糖高剂量有一定程度降低血糖的作用。HE染色结果显示，模型小鼠肝脏病变明显：出现大量的单核炎症细胞浸润，肝细胞发生变性明显。并且，肝细胞结构紊乱。而多花黄精多糖高剂量能够改善模型小鼠肝脏炎症浸润、肝细胞变性以及肝脏结构紊乱等病变。qPCR结果显示多花黄精多糖能显著降低糖尿病肝脏中IL-6，IL-1β mRNA的水平，显著升高IRS-1 mRNA的水平。结论多花黄精多糖显著降低Ⅰ型糖尿病小鼠的死亡率，可能与其改善小鼠体重、降低血糖、肝保护等相关。     

Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应标准品的制备及应用研究

目的:制备用于Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)的标准品。方法:提取胚胎上颌突组织总RNA,行逆转录反应获得第一链的cDNA,再通过PCR回收获得预期Satb2基因片段;通过T-A克隆将该片段插入pGMT质粒载体;大量提取质粒,定量后进行标准曲线的制作和实时荧光定量PCR。结果:重组质粒经PCR扩增及序列测定表明,pGMT/Satb2基因已成功克隆。结论:所构建的pGMT/Satb2基因实时荧光定量PCR检测标准品应用Taqman荧光探针技术建立的标准曲线线性关系好,灵敏度和特异性高,准确可靠,此法可作为实时荧光定量PCR检测Satb2基因的标准方法。     

实时荧光定量PCR检测核糖体蛋白S13基因在NK/T细胞淋巴瘤中的表达

目的应用实时荧光定量PCR技术检测NK／T细胞淋巴瘤核糖体蛋白S13（RPS13）基因的表达。方法提取石蜡包埋NK／T细胞淋巴瘤组织总RNA，逆转录为cDNA。应用实时荧光定量PCR技术检测NK／T细胞淋巴瘤RPS13表达水平。结果20例NK／T细胞淋巴瘤RPS13表达水平明显低于对照．结论RPS13基因表达水平明显低于正常人外周血淋巴细胞，这可能在NK／T细胞淋巴瘤发生、发展中起到一定作用。     

BMPR-Ⅱ基因mRNA荧光定量PCR检测标准品的构建

目的构建检测BMPR-Ⅱ基因mRNA表达水平差异的标准品。方法以人胚肺成纤维细胞的总RNA为模板、O ligo(dT)18为引物逆转录产生cDNA,用该cDNA为模板PCR扩增人BMPR-Ⅱ基因相应的cDNA片断,构建pMD-18-BMPR-Ⅱ重组质粒,经鉴定测序,用荧光定量PCR制作标准曲线。结果成功克隆了人BMPR-ⅡcDNA,并以其为标准制作出荧光定量PCR标准曲线。结论成功构建了BMPR-Ⅱ基因荧光定量PCR标准质粒,为今后BMPR-ⅡmRNA的荧光定量PCR检测打下了基础。     

实时荧光定量PCR检测传代培养细胞Grb10的表达

目的 建立一种可靠的Grb10印迹基因实时荧光定量PCR方法,检测传代培养鼠尾成纤维样细胞中Grb10表达的差异.方法通过实时荧光PCR,选择合适的"相对标准品"绘制相对标准曲线,检测传代培养细胞中印迹基因Grb10的表达水平.结果相对标准曲线有较好的线性(r=0.999及0.984);实时荧光定量PCR方法检测出随着细胞培养代数的增加印迹基因Grb10表达水平上升.结论双标准曲线的实时荧光定量PCR法用于检测Grb10的表达准确可靠;传代培养可能影响鼠尾成纤维样细胞中印迹基因Grb10的表达水平.     

药用黄精种质的变迁

始载于《名医别录》的黄精,包含有多种黄精属植物。南北朝时期黄精来源于黄精属植物中根状茎结节状类群。到了唐宋时期,黄精属植物中轮叶类群被推崇,其中又以黄精Polygonati sibiricum Delar．ex Redoute为胜,并形成了嵩山、茅山的道地产区。这种情况一直持续到明朝。清朝,互生叶类群开始逐渐与轮生叶类群并列,并成为黄精类药材的主流品种。到了民国时期,互生叶类群的多花黄精演变为药用黄精的主流,最终形成了现在两种类群兼有的用药情况。     

重组真核表达载体pEGFP-N1/PDGF-A的构建及真皮干细胞的转染

目的克隆血小板衍生生长因子A链(plateletderivedgrowthfactorAchain,PDGFA)基因,以增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)载体pEGFPN1为骨架,携带PDGFA基因进入真皮间充质干细胞(dermisdrivedmesenchymalstemcells,DMSCs),为采用转入PDGFA基因的DMSCs修复创面奠定基础。方法采用RTPCR二步分离法,以人肝癌细胞系(SMC7721)的总RNA为模板,扩增PDGFA基因的全长cDNA编码序列,克隆入载体pMD18T,随后又将PDGFA基因亚克隆入pEGFPN1载体中,构建PDGFA基因的真核表达载体pEGFPN1/PDGFA,并采用Fugene6介导转染技术将PDGFA基因导入DMSCs。结果克隆到PDGFA基因的全长cDNA序列,经测序验证,其序列与GenBank所报告的该基因的序列完全一致。结论成功地将PDGFA基因克隆到pEGFPN1载体中,并实现了PDGFA基因在DMSCs的表达。     

Cloning of the Eukaryotic Expression Vector with Nerve Growth Factor in Rats and Its Effects on Proliferation and Differentiation of Mesencephal Neural Stem Cells of Fetal Rats

The eukaryotic expression vector containing full-length cDNA sequence of rate nerve growth factor （NGF） β subunit was constructed and its effects on proliferation and differentiation of neural stem cells were observed. By using PCR, full-length cDNA sequence of NGF β subunit in rats was cloned and ligated into the eukaryotic expression vector pEGFP-N1-NGF. The recombinant plasmid pEGFP-N1-NGF was transfected into the mesencephal neural stem cells of embryonic rats by Lipofectamin and transiently expressed. MTT method was used to determine the effects of NGF on proliferation of neural stem cells, and under phase-contrast microscopy, the effects of NGF on growth of nervous processes following differentiation of neural stem cells were observed. Sequence analysis indicated that the cloned full-length cDNA sequence of rat NGF β was identical to that of published sequence encoding NGF in gene GeneBank. The transfection of recombinant plasmid pEGFP-N1-NGF into mesencephal neural stem cells of embryonic rats could obviously promote proliferation of neural stem cells and faciliate the growth of neural stem cells-derived nerve cells. It was suggested that neural stem cells could be used as a vehicle of gene transfer, and the expression of NGF β subunit in the neural stem cells could promote the growth of nerve cells derived from neural stem cells.     

胃癌中microRNA-218调控BMI1基因表达的作用及机制

目的  探讨胃癌中microRNA-218（miR-218）调控BMI1基因表达的作用及机制。方法  应用实时定量聚合酶链反应（real-time PCR）检测胃癌及癌旁组织中miR-218及BMI1基因的表达。将miR-218的前体（miR-218 precursor）转染胃癌BGC823细胞,Western blot检测BMI1蛋白的表达。应用荧光素酶实验分析miR-218是否与BMI1基因3’非翻译区（3’-UTR）结合。结果  RT-PCR结果显示,相对癌旁组织,胃癌组织中miR-218的表达下调显著,而BMI1在胃癌组织中的表达则呈现明显的上调,miR-218与BMI1在胃癌及癌旁组织中的表达均为明显的负相关。在转染miR-218 precursor的胃癌BGC823细胞中,BMI1的蛋白表达显著下调。荧光素酶实验结果证实miR-218能够特异性地结合BMI1基因的3’-UTR,并与其表达呈负相关。结论  miR-218与BMI1基因的表达异常与胃癌的发生相关,BMI1基因是miR-218的靶基因,miR-218在胃癌细胞中能够靶向沉默BMI1基因。

     

多花黄精‘丽精1号’营养成分与海拔、郁闭度相关性研究

[目的]通过探究多花黄精新品种‘丽精1号’营养成分与海拔、林分郁闭度的相关性,筛选出适宜多花黄精道地栽培的条件。[方法]开展多花黄精新品种‘丽精1号’不同海拔和林分郁闭度的对比试验,采用双变量相关计算方法分析评价‘丽精1号’中5种一般营养成分、7种矿物质元素、15种氨基酸含量及其与海拔、林分郁闭度的相关性。[结果]多花黄精‘丽精1号’3年生根茎具有丰富的营养成分,其中黄精多糖11.31%~16.58%、蛋白质7.25%~7.87%、脂类3.00%~4.10%,矿物质元素钾3125~6160μg·g^-1、钙3412~3820μg·g^-1、镁452~526μg·g^-1,含有7种必需氨基酸和8种非必需氨基酸,并具有“谷氨酸含量最高、蛋氨酸含量最低”的特点。多花黄精‘丽精1号’根茎的一般营养成分、矿物质和氨基酸含量与海拔、林分郁闭度具有相关性,其中钠(r=0.902,P=0.001)、锌(r=0.862,P=0.003)、谷氨酸(r=0.863,P=0.003)、脂类(r=0.683,P=0.043)与海拔呈正相关,黄精多糖(r=-0.812,P=0.009)、镁(r=-0.916,P=0.001)、蛋白质(r=-0.718,P=0.027)、7种必需氨基酸(r=-0.719,P=0.029)与海拔呈负相关;黄精多糖(r=0.936,P=0.000)、铁(r=0.778,P=0.013)与林分郁闭度呈正相关,锌(r=-0.907,P=0.001)、钠(r=-0.846,P=0.004)、谷氨酸(r=-0.679,P=0.044)与林分郁闭度呈负相关。[结论]多花黄精新品种‘丽精1号’根茎营养成分丰富。选择海拔400~770m、林分郁闭度0.6~0.7的林分套种多花黄精‘丽精1号’,更有利于黄精多糖、蛋白质、必需氨基酸等营养成分的积累。     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测前列腺癌抗原3mRNA表达水平

目的采用SYBR Green I实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,建立检测前列腺癌抗原3(DD3)mRNA的标准,定量检测人体不同组织中该基因的表达水平。方法从LNCaP细胞中采用RT- PCR法扩增特异性DD3基因片段,将其与pMD18-T载体连接,转化宿主菌JM109,对质粒标准进行聚合酶链反应(PCR)检测及测序。纯化后检测质粒拷贝浓度,制备梯度浓度标准品。应用LightCycler荧光定量PCR仪对标准品进行检测。取正常人乳腺组织、膀胱、结肠、尿道、肺、睾丸、精囊、卵巢、正常前列腺组织、前列腺增生及前列腺癌组织,定量检测DD3 mRNA表达。结果建立稳定的检测DD3 mRNA的标准,正常人乳腺、膀胱、结肠、尿道、肺、睾丸、精囊、卵巢中无DD3 mRNA表达,在正常前列腺及前列腺增生组织中低表达,两者间差异无显著性 (P>0．05);在前列腺癌中高表达(P<0．05)。结论应用SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR技术检测 DD3 mRNA表达水平简便、可行、经济。DD3基因的表达具有良好的前列腺癌特异性。     

苦参查尔酮异构酶的基因克隆与表达分析*

目的为明晰苦参查尔酮异构酶（sfCHI）的结构基因信息及其在苦参黄酮类化合物生源路径中的表达调控机理。方法 本实验以苦参为研究对象，基于其转录组学数据，克隆sfCHI基因并针对该cDNA序列展开生物信息学分析，采用半定量PCR方法检测安徽产苦参不同组织中sfCHI基因表达情况。结果 结果显示苦参sfCHI基因的cDNA序列长度为1 265 bp，含有630 bp的开放式阅读框(ORF)，编码209个氨基酸；序列分析表明sfCHI与狭叶羽扇豆查尔酮异构酶基因相似性最高，达89.95%；进化树分析该基因与大豆、野大豆等植物的亲缘关系较近；半定量PCR结果显示sfCHI基因在苦参根中表达量最低，在叶、叶柄与茎中的表达未见明显差异。结论 本研究通过对苦参查尔酮异构酶的基因克隆与不同组织间的表达分析，初步明确了该基因的序列信息与理化特征，这对进一步研究苦参黄酮类物质生物合成机制将起到积极的推动作用。     

miR-26a在Y79视网膜母细胞瘤细胞系内下调抑癌基因Rb1表达

目的探讨视网膜母细胞瘤细胞系内抑癌基因Rb1表达下调的分子机制。方法本研究利用real-time PCR和Western blotting等方法分别检测miR-26a和Rb1基因的表达。结果本研究结果显示在人视网膜母细胞瘤组织细胞与正常人视网膜血管内皮细胞间比较,miR-26a表达差异有统计学意义（P〈0.005）。miR-26a可以通过与Rb1基因的3＇UTR作用而导致人视网膜母细胞瘤细胞内Rb1基因表达下降。结论在Y79 Rb细胞内miR-26a下调抑癌基因Rb1的表达。     

肝细胞癌候选相关基因IDD01的克隆与鉴定

目的鉴定表达序列标签(EST)在肝细胞癌(HCC)和癌旁非癌组织表达,扩增其全长.方法采用半定量RT-PCR方法,对21例HCC患者的癌组织和癌旁非癌组织EST mRNA的表达情况进行检测,通过cDNA末端快速扩增(RACE)技术扩增、测序获得全长,Blast检索GenBank.结果此EST在HCC癌组织中高表达,癌旁非癌组织中低表达(P＜0.05);序列全长为1 333 bp,含有完整开放阅读框(ORF)和Poly(A)尾;Blast检索为一功能未知基因.结论获得一个和HCC相关候选新基因,为进一步研究其功能打下基础.     

大鼠骨髓间充质干细胞Pdx-1基因表达水平的调控及意义

目的:将含有胰腺十二指肠同源盒-1(pancreatic duodenal homeobox-1,Pdx-1)的真核表达载体转染大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),并测定转染MSCs中Pdx-1基因的拷贝数.方法:将本实验室构建的含Pdx-1的真核表达载体pcDNA3.1-P...