16S rRNA基因克隆文库用于菌群分析的效能研究和评价

目的建立16S rRNA基因克隆文库进行菌群相对定量的方法,评价其对细菌的检测效率以及对混合菌群中低含量细菌的分析能力。方法取脆弱类杆菌等9种细菌以相同及级差比例制备细菌悬液,分别用或不用变溶菌素处理后,用试剂盒提取核酸,16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增、纯化、连接、克隆和测序,建立16S rRNA基因克隆文库,将序列与数据库进行比对分析。结果相同比例制备的菌悬液,加或不加变溶菌素提取的核酸,掺入的9种细菌均可检出。级差比例制备的菌悬液,加变溶菌素提取核酸,掺入的9种细菌均可检出;不加变溶菌素提取核酸,数量少难裂解的革兰阳性菌双歧杆菌未能检出。混合菌悬液中各种细菌的比例与文库反映的各种细菌的比例有数量对应关系,但不是线性对应关系。结论16S rRNA基因序列分析是一种较好的细菌菌群分析方法,它可以同时检出多种细菌,并能对混合细菌标本进行菌群相对定量,反映菌群中各种细菌的丰度,但不能准确定量菌群中各种细菌的数量。     

儿童近端空肠菌群的分子分析

目的研究儿童近端空肠菌群分布。方法取儿童近端空肠粘膜活检组织,提取总DNA,经PCR扩增后对16SrRNA基因扩增片段克隆,并对克隆片段进行DNA序列测定,根据序列结果分析细菌组成。结果16SrRNA基因测序结果表明儿童近端空肠菌群包括6个细菌门类,厚壁菌门、变形菌门和放线菌门占总细菌的89.3%;拟杆菌门、梭杆菌门、TM7和未分类细菌占10.7%。链球菌属和奈瑟菌属为儿童近端空肠粘膜相关菌群的主要菌属,韦荣菌属、孪生菌属、放线菌属、罗氏球菌属、嗜血菌属、普雷沃菌属和颗粒链菌属占较高比例。结论儿童近端空肠具有独特的菌群分布。     

16SrRNA实时荧光定量PCR检测肠道菌群的研究

目的：应用细菌的16SrRNA序列设计双歧杆菌（Bifidobacterium）、乳酸杆菌（Lactobacillus）、大肠杆菌（E.coli）、肠球菌（Enterococcus）的引物并对肠道的这4种细菌菌属进行定量测定,绕过分离培养环节,以微生物rRNA/rDNA基因作为种属鉴别序列,确定肠道菌群的情况。方法：采用腹腔注射链脲菌素（STZ）的方法建立小鼠糖尿病模型,分别检测小鼠肠道主要的菌群。结果：造模成功小鼠血糖升高（〉12.3mmol/L,P〈0.05）时,肠道益生菌（双歧杆菌,乳酸杆菌）数量降低（P〈0.05）,而大肠杆菌、肠球菌数量增加（P〈0.05）。结论：小鼠糖尿病模型可引起肠道菌群失调,荧光定量PCR是一种特异性高、敏感性强的定量方法,可正确定量肠道中的细菌菌群数量。     

1例痰液戈登菌致血流感染误诊中毒性红斑病例分析

目的 通过对1例痰液戈登菌致血流感染误诊为中毒性红斑病例的回顾性分析,为微生物室工作人员和临床医生提供诊疗经验。方法 患者入院后进行痰培养和血培养,血培养有细菌生长,根据血培养结果改用美罗培南联合阿米卡星抗感染治疗。血培养分离菌用杭州滨河微量生化管,梅里埃VITEK2的NH试条,梅里埃VITEK MS和16SrRNA基因测序进行细菌鉴定。结果 痰培养报告有呼吸道正常菌群生长。血培养检出生长缓慢、革兰阳性、弱抗酸性棒状杆菌。氧化酶阴性,触酶阳性。梅里埃VITEK2的NH试条检测提示为无法鉴定的细菌; VITEK MS质谱仪鉴定为戈登菌属;16SrRNA基因测序结果显示该菌与痰液戈登菌的相似度为99%（GenBank登录号为KY319045.1）。临床最终明确诊断为痰液戈登菌性血流感染,应用美罗培南联合阿米卡星治疗10 d,患者症状消除、血培养转阴。结论 痰液戈登菌可引起血流感染,应用美罗培南联合阿米卡星治疗有效。该病可出现发热咳嗽伴红色片状皮疹的症状,临床应注意与中毒性红斑鉴别。痰液戈登菌用常规微生物鉴定仪无法鉴定,质谱仪只能鉴定到戈登菌属,建议积极进行16SrRNA基因测序,以便早日诊断和治疗。     

牙周炎患者龈沟液细菌培养的结果分析

目的对牙周炎患者龈沟液细菌培养的结果进行分析。方法以无菌操作技术采集80例牙周炎患者的龈沟液于运送培养基中,经充分震荡混匀后定量接种;厌氧环境培养并对细菌鉴定到种,并对药物替硝唑和甲硝唑的抑菌浓度进行检测。结果不同年龄段人群培养细菌的种类和数量均不同,青年人群及老年人群的感染菌群数量较高,分别为106～1010CFU/ml和106～1012CFU/ml,而中年人的菌群数量相比稍低一些为106～109CFU/ml。结论牙周炎患者龈沟液为多种细菌的混合感染,以厌氧菌为主要致病菌。对替硝唑和甲硝唑的作用而言,前者的治疗效果较佳。     

2型糖尿病患者与健康个体间肠道双歧杆菌的差异

目的研究2型糖尿病患者与健康个体之间肠道双歧杆菌是否存在差异。方法收集50例2型糖尿病患者和30例健康志愿者的粪便样品,提取样品中细菌总DNA,根据细菌的16SrRNA序列设计双歧杆菌总菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌的属种特异性引物,并应用实时荧光定量PCR技术对两组人群粪便样品中的以上细菌进行定量检测和分析。结果 2型糖尿病患者组肠道双歧杆菌总菌和青春双歧杆菌的数量较健康对照组均显著减少(P<0.05)。结论 2型糖尿病患者肠道双歧杆菌数量减少。     

脑脊液病原菌16S rRNA微型寡核苷酸芯片检测方法的初步研究

目的 初步建立一种脑脊液标本中常见病原菌的快速检测方法。方法 根据病脊液标本中常见病原菌16SrRNA基因保守区的序列设计用于基因扩增的通用引物，制备细菌的通用探针、革兰阳性和阴性菌通用探针，以及肠杆菌科属、嗜血杆菌属和脑膜炎奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肺炎链球菌、产单核李斯特菌的属或种特异性探针，将探针加尾后固定于尼龙膜上制成寡核苷酸芯片。提取标本中病原菌DNA后用通用引物行PCR扩增．扩增过程中用生物素标记；将产物变性后分别与点有各种探针的尼龙膜反向杂交．检测脑脊液中细菌的感染情况。结果 所有探针均只与其相应的细菌DNA扩增产物反应产生杂交信号。结论建立的脑脊夜病原菌寡核苷酸芯片能够准确、敏感、快速、高效地检测脑脊液标本中病原菌的感染情况。     

饮水中地塞米松污染对小鼠肠道菌群的影响

目的探讨水环境地塞米松污染对小鼠肠道菌群的影响。方法将20只Balb/c小鼠随机分为对照组和实验组,每组5只。
实验低剂量组灌喂含0.035 ng地塞米松磷酸钠的饮用水,中剂量组为0.225 ng、高剂量组为2.25 ng,对照组灌喂不含地塞米松磷
酸钠的饮用水。每日观察小鼠行为、皮毛、大便等的变化。灌喂第36 d 处死小鼠,取回盲部组织提取细菌基因组DNA,扩增
16S rDNA V6可变区,扩增产物变性凝胶梯度电泳（DGGE）后分析。切取DGGE图谱上的优势条带,扩增、纯化后克隆测序,其
序列BLAST比对分析。结果各实验组小鼠均出现性情暴躁、斗殴打架、咬断尾部等现象。DGGE图谱聚类分析表明各组小鼠
回盲部均具有较稳定的菌群;主成分分析表明各组的优势菌群存在一定差异;菌群多样性分析表明,与对照组相比,低剂量组菌
群的种类和数量明显增加（P<0.05）;中、高剂量组种类和数量显著增加（P<0.01）。16S rDNA V6区序列分析显示实验组和对照
组具有共有菌属15种、差异菌属2种,优势菌种类和比例发生了改变。对照组有乳杆菌属的细菌定植,而中、高剂量实验组乳杆
菌属的细菌消失,却出现志贺菌属的细菌。结论饮水地塞米松污染可影响小鼠神经系统,使小鼠肠道内细菌的种类、数量及优
势菌所占的比例发生改变,菌群多样性增加;抑制肠道益生菌的定植,利于肠道致病菌的入侵。
     

三种小鼠RNA病毒样品储运条件对核酸检测的影响

目的分析实验动物小鼠三种肠道病毒MHV、Reo-3、MNV生物样品的储运条件对病原核酸检测结果的影响。方法将MHV、Reo-3、MNV三种RNA病毒与小鼠盲肠内容物混合制备参考品;保存剂包括RNA提取试剂裂解液(Buffer AVL)及生理盐水,存储温度为4℃及室温(22℃~25℃);在保存1、2、3、7、14 d时间点提取各样品核酸,采用实时荧光定量PCR方法检测病毒样品量的变化。结果生理盐水作为保存剂核酸样品检出量低于RNA提取试剂裂解液组,且检出量下降明显;Buffer AVL组样品储于4℃条件的样品检出量优于室温25℃的条件;4℃-buffer AVL组的三种病毒参考品在3 d时间点的病毒检出量在50%以上,在7 d时间点仍有检出,但14 d时已检测不到。结论三种小鼠RNA病毒样品储运条件优选使用RNA提取试剂裂解液,并在低温条件下储运,最好在3 d内完成核酸检测。     

PCR-变性梯度凝胶电泳技术分析肺炎儿童下呼吸道菌群多样性

目的：初步探讨PCR-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)检测肺炎儿童下呼吸道菌群多样性的作用。方法收集10份培养阳性的患儿肺泡灌洗液2~5 mL,经细菌DNA提取、16S rDNA-PCR后进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析,对优势条带进行测序。结果经培养10份标本中7份鉴定为一种菌感染,3份培养出两种病原菌;经PCR-DGGE分析8份标本出现多条明显条带,2份得到一条条带,共筛选出12个优势条带;DGGE法得到的细菌种类多于培养法。结论 PCR-DGGE可较好地鉴定混合细菌感染性肺炎病原菌并能检测到培养法没有检出的细菌;儿童肺炎主要以肺炎链球菌、大肠埃希菌、草绿色链球菌等病原菌为主。     

高通量测序分析结肠腺瘤患者肠道黏膜菌群的构成变化

目的 探讨结直肠癌发展早期肠道菌群的变化规律.方法 通过结肠镜活检收集31例结肠腺瘤患者的腺瘤组织以及20例健康志愿者的肠道黏膜,提取基因组DNA,对细菌16SrRNA基因序列V3～V4高变区进行PCR扩增,lluminaMiSeq平台上高通量测序分析.结果 结肠腺瘤患者的肠道黏膜菌群多样性比健康对照人群显著增高(P＜0.01),腺瘤组黏膜菌群结构和健康对照者相比差异显著.门水平上:结肠腺瘤组变形菌门明显增多(P＜0.01),厚壁菌门/拟杆菌门比值下降.属水平上:结肠腺瘤组乳球菌属、链球菌属和假单胞菌属增多(P＜0.01),而肠球菌属,杆菌属丰度明显下降(P＜0.01).不同病理类型腺瘤比较发现:结肠高级别和低级别上皮内瘤变组肠道黏膜菌群整体结构相似,埃希菌-志贺菌属在高级别上皮内瘤变组呈现上升趋势,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论 结肠腺瘤患者肠道菌群多样性和构成与正常健康人存在明显差异,腺瘤患者黏膜菌群结构发生明显失衡,形成了易于肿瘤生长的肠道微生态环境.     

反相杂交技术在常见社区获得性肺炎致病菌基因诊断研究中的应用

目的：采用核酸反相杂交技术检测常见社区获得性肺炎致病菌。方法：用16SrRNA基因通用引物扩增细菌371bP片段，将通用探针和特异探针固定于硝酸膜上，通过反相杂交技术对肺炎锭球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌进行诊断，并与常规痰培养结果比较。结果：100份合格痰标本中检出细菌75株，革兰阳性菌31株，革兰阴性菌44株，其中肺炎链球菌15株，流感嗜血杆菌9株，卡他莫拉菌4株，均优于传统的痰培养方法。结论：反相杂交技术对致病菌的诊断准确可靠，经济快速，是临床诊断的可靠工具。     

Caco-2细胞与肠道菌共培养初建体外模拟肠道共生模型

 【目的】构建体外模拟肠道共生系统,用于评价食源性抗菌药及其耐药菌作用于肠道菌群时对人体健康造成的危害风险。【方法】21d体外培养构建Caco-2细胞三维肠上皮,分成无菌对照组、混合的正常菌群组、沙门氏菌组、混合菌群-沙门氏菌组4组,制备混悬液,各组分别单独和混合培养4h,荧光定量PCR法测试共培养前后各菌16SrDNA菌量变化,电阻仪测试跨膜上皮电阻(TEER)数量;免疫荧光染色观察紧密连接蛋白ZO-1变化,评价三维肠上皮屏障功能的改变。【结果】 在体外共培养模型内,4种肠道菌混合培养4h后同单独培养组间比较,细菌量增长无统计学差异（P＞0.05)）;需氧菌的增长速度明显高于厌氧菌(P＜0.01),厌氧菌:需氧菌浓度比接近100:1,厌氧菌仍为优势菌。TEER和ZO-1免疫荧光染色结果均提示混合肠道菌群对Caco-2细胞三维肠上皮无明显破坏,侵入性沙门氏菌可显著降低TEER值,并观察到模型的ZO-1结构受到破坏。这种破坏作用在混合肠道菌群加沙门氏菌群组较轻。【结论】 Caco-2细胞三维肠上皮同乳双歧杆菌、植物乳酸杆菌、大肠杆菌和粪肠球菌组成的混合菌群体外共培养能建立稳定的体外肠上皮模型,并具有生物学活性;正常肠道菌群对侵入性沙门氏菌有拮抗作用。该模型可进一步完善作为食源性抗菌药、耐药菌与肠道系统相互作用研究模型的基础。     

树鼩粪便细菌分离培养与鉴定

目的 了解人工饲养树鼩粪便菌群多样性,为树鼩的正常饲养繁殖和微生物质量控制标准化提供依据。方法 随机采集10份树鼩粪便样品,利用有氧及厌氧培养基进行细菌分离培养,提取细菌基因组DNA后PCR扩增16SrRNA基因并测序鉴定。结果 本实验从树鼩粪便样品中,经有氧培养分离鉴定出25株、12种细菌,经厌氧培养分离鉴定出25株、10种细菌,包括变形杆菌属、肠球菌属、埃希菌属、志贺菌属、葡萄球菌属、气单胞菌属、拉恩氏菌属、拉乌尔菌属、微小杆菌属、链球菌属、明串珠菌属。结论 树鼩肠道好氧菌及厌氧菌具有丰富的种属多样性,普通变形杆菌群、费格森埃希菌群和屎肠球菌群可能是树鼩肠道的主要寄生菌群。     

伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株16SrRNA基因的检测与分析

目的 探讨伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株的菌种相关性或亲缘性.方法 分离提取伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株及其亲代细菌型的染色体DNA,采用16SrRNA基因引物进行PCR扩增,对扩增的16SrDNA产物进行琼脂糖凝胶电泳和碱基序列测定.结果 经PCR扩增后伤寒沙门菌细胞壁缺陷突变株及其亲代细菌型均获得了大小约230 bp的特异性片段,其产物经琼脂糖凝胶电泳可见在230 bp处出现与其亲代细菌型一致的DNA条带,碱基序列测定显示具有同其亲代细菌型一致的核苷酸序列.结论 伤寒沙门菌的细胞壁缺陷突变株虽然丧失了常规细菌学可检测的绝大多数表型特征,但检测16SrRNA基因能快速、灵敏地对其进行菌种相关性或亲缘性的分析与鉴定,并且也有利于对各种不能自发返祖的细菌稳定L型进行菌种相关性或亲缘性的分析与鉴定.     

第二代测序技术用于全膝关节置换术后假体周围感染诊断的临床价值

目的探讨第二代测序技术（NGS）用于全膝关节置换术后假体周围感染（PJI）诊断的临床价值。方法收集2017年1月1日至2019年12月1日温州医科大学附属第三医院就诊的全膝关节置换术后临床怀疑为PJI的15例患者的关节液,进行细菌培养和NGS检测。NGS检测经DNA提取、文库构建及测序,最后进行数据处理与分析来寻找病原菌,并与细菌培养结果进行比较分析。结果15例患者的关节液细菌培养阳性10例,阴性5例。NGS检测15例患者关节液中均发现细菌,10例患者细菌菌属与细菌培养结果一致,其中9例的优势菌群（丰度最高）与细菌培养结果一致。关节液细菌培养阳性的10例标本中,NGS检测细菌属种类（15种）多于细菌培养检出的细菌属种类（10种）,差异有统计学意义（P=0.042）。细菌培养阴性的5例标本NGS均检出细菌。结论NGS检测是一种PJI快速、准确的诊断方法,能检出常规细菌培养以外的细菌,特别对于细菌培养阴性的标本更具诊断意义。     

北京海淀区128例细菌性痢疾的病原学研究

目的：明确细菌性痢疾致病菌的种类分布比例，了解海淀区细菌性痢疾的菌群特点。方法：对128例临床诊断细菌性痢疾便标本检测志贺菌属、致泻性大肠埃希菌属、副溶血性弧菌、变形杆菌、沙门菌及金黄色葡萄球菌。结果：128份菌痢病人便标本中共检测出细菌33株，其中，志贺菌属16株，致泻性大肠埃希菌属8株，变形杆菌属5株，副溶血性弧菌属4株，未检出沙门菌及金黄色葡萄球菌。结论：海淀区痢疾患者致病菌以福氏志贺菌较多。     

细菌性眼内炎的病原分子诊断研究

目的 以16S rRNA部分基因直接测序为基础分析细菌性眼内炎中的病原菌,建立眼内标本病原菌非培养检测方法.方法 收集50例患者房水或玻璃体液标本,提取细菌DNA,16SrRNA基因通用引物PCR,扩增产物直接测序,通过核酸序列比对微生物种属鉴定,同时与传统方法进行比较.结果 50例标本中,直接涂片阳性22例(44%),细菌培养阳性13例(26%),PCR检测阳性28例(56%),成功测序22例,序列鉴定率为44%.16S rRNA基因序列鉴定与培养鉴定结果不完全吻合.结论 分子诊断对明确细菌性眼内炎感染有指导意义.     

不同龋敏感儿童牙菌斑内口腔链球菌的PCR-DGGE分析

目的 应用PCR-变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术,分析不同龋敏感儿童牙菌斑内口腔链球菌菌群及其菌种组成的多样性.方法 牙菌斑组织取自45例学龄前儿童,根据乳牙龋失补牙面(dmfs)指数分为无龋(dmfs=0)、中龋(dmfs=4～6)和高龋(dmfs＞8)(n=15).分别提取细菌总DNA,进行链球菌属rnp B特征序列的PCR扩增及DGGE分析,克隆、测序并与核酸序列数据库的序列进行比对.结果 无龋儿童菌斑中口腔链球菌菌群的基因型分布均显著高于中龋和高龋儿童(P＜0.05);变异链球菌群是高龋组中的优势菌群.结论 PCR-DGGE技术结合rnp B基因克隆文库分析可较灵敏、直观地反映牙菌斑中链球菌属各菌群及其菌种的组成情况.     

不同龋敏感儿童牙菌斑内口腔链球菌的PCR-DGGE分析

目的应用PCR-变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术,分析不同龋敏感儿童牙菌斑内口腔链球菌菌群及其菌种组成的多样性。方法牙菌斑组织取自45例学龄前儿童,根据乳牙龋失补牙面(dmfs)指数分为无龋(dmfs=0)、中龋(dmfs=4~6)和高龋(dmfs>8)(n=15)。分别提取细菌总DNA,进行链球菌属rnp B特征序列的PCR扩增及DGGE分析,克隆、测序并与核酸序列数据库的序列进行比对。结果无龋儿童菌斑中口腔链球菌菌群的基因型分布均显著高于中龋和高龋儿童(P<0.05);变异链球菌群是高龋组中的优势菌群。结论PCR-DGGE技术结合rnp B基因克隆文库分析可较灵敏、直观地反映牙菌斑中链球菌属各菌群及其菌种的组成情况。