eNOS对大鼠颈动脉球囊损伤后平滑肌细胞增殖的影响

目的 研究内皮型一氧化氮合酶(eNOS)对大鼠球囊损伤后平滑肌细胞增殖的影响.方法 构建腺病毒-eNOS(AdCMV-eNOS)质粒,以脂质体介导转染293细胞,扩增后转染SD大鼠球囊损伤后平滑肌细胞(实验组),以转染Ad-LacZ重组质粒的平滑肌细胞作为对照组.RT-PCR技术观察转染后平滑肌细胞eNOS mRNA的表达;细胞计数法分别检测实验组、对照组、正常组和单纯球囊损伤组平滑肌细胞的增殖能力..结果 RT-PCR检测发现实验组平滑肌细胞表达eNOS mRNA,而对照组无表达.各时间点细胞计数结果显示,正常组均明显少于单纯球囊损伤组(P＜0.05),而实验组均明显少于单纯球囊损伤组和对照组(P＜0.05).结论 重组腺病毒表达载体构建正确;eNOS可以抑制平滑肌细胞增殖.为eNOS预防经皮腔内冠状动脉成形术术后再狭窄基因转染奠定了基础.     

反义Smad3阻断TGF-β1信号转导对血管平滑肌细胞增殖能力的影响

目的 观察反义Smad3腺病毒载体转染增生型血管平滑肌细胞(VSMC)后对其增殖能力的影响.方法 构建大鼠颈总动脉急性球囊损伤模型.取损伤处血管组织,组织块贴壁法培养增生型VSMC,反义Smad3腺病毒载体转染(实验组).以空载病毒作为阴性对照组,以无病毒载体作为空白对照组.抽提转染后细胞总RNA,RT-PCR检测转染后各组Smad3 mRNA表达;MTT比色法检测转染后细胞增殖能力的变化.结果 与阴性对照组和空白对照组比较,转染后实验组Smad3 mRNA表达明显减少;转染后第2、3、5天,实验组细胞增殖能力明显降低(P<0.05),转染后第7天各组细胞增殖能力差异无统计学意义(P>0.05).结论 反义Smad3腺病毒载体转染对增生型VSMC具有增殖抑制作用,为通过基因修饰阻断TGF-β1信号转导从而预防增生性血管病变奠定了基础.     

Adenine translocase 1gene transfection induces apoptosis of vascular smooth muscle cells in rats with carotid balloon injury

目的 通过腺病毒载体在体转染大鼠颈总动脉球囊损伤模型,研究过表达腺嘌呤核苷酸转位酶-1( adeninenucleotide translocase 1,ANT1)对血管平滑肌细胞凋亡的影响.方法 将72只雄性SD大鼠随机分为正常组、单纯损伤组、Ad-GFP转染组、Ad-ANT1转染组,每组18只.用携带ANT1的腺病毒载体(Ad-ANT1)或空载体腺病毒载体(Ad-GFP)局部感染大鼠颈总动脉球囊损伤动物模型,在损伤后7、14、28 d,取大鼠损伤侧颈动脉RT-PCR检测ANT1mRNA表达,West-ern blot以及免疫组化检测BAX和Bcl-2表达,TUNEL法原位检测新生内膜及中膜VSMCs凋亡率.结果 Ad-ANT1腺病毒转染后大鼠颈动脉ANT1大量表达,在14 d达到高峰,显著高于Ad-GFP转染组及单纯球囊损伤组(P＜0.01),至28 d时仍有表达.在7、14 d时,Ad-ANT1转染组BAX阳性表达率显著高于Ad-GFP转染组及单纯损伤组(P＜0.05);Bcl-2阳性表达率高于正常血管,但与Ad-GFP转染组和单纯损伤组无显著差异(P＞0.05);Ad-ANT1转染组新生内膜及中膜平滑肌细胞凋亡率显著高于其他各组(P＜0.05);在14、28 d时,Ad-ANT1转染组新生内膜及中膜面积比(IA/MA)小于Ad-GFP转染组及单纯损伤组(P＜0.05).结论 腺病毒载体介导过表达ANT1可诱导大鼠颈总动脉球囊损伤动物模型新生内膜及中膜VSMC的凋亡,其作用可能通过上调促凋亡蛋白BAX的表达实现.     

转染ANT1基因诱导颈动脉球囊损伤大鼠血管平滑肌细胞凋亡

目的通过腺病毒载体在体转染大鼠颈总动脉球囊损伤模型,研究过表达腺嘌呤核苷酸转位酶-1(adeninenucleotide translocase 1,ANT1)对血管平滑肌细胞凋亡的影响。方法将72只雄性SD大鼠随机分为正常组、单纯损伤组、Ad-GFP转染组、Ad-ANT1转染组,每组18只。用携带ANT1的腺病毒载体(Ad-ANT1)或空载体腺病毒载体(Ad-GFP)局部感染大鼠颈总动脉球囊损伤动物模型,在损伤后7、14、28 d,取大鼠损伤侧颈动脉RT-PCR检测ANT1 mRNA表达,West-ern blot以及免疫组化检测BAX和Bcl-2表达,TUNEL法原位检测新生内膜及中膜VSMCs凋亡率。结果 Ad-ANT1腺病毒转染后大鼠颈动脉ANT1大量表达,在14 d达到高峰,显著高于Ad-GFP转染组及单纯球囊损伤组(P<0.01),至28 d时仍有表达。在7、14 d时,Ad-ANT1转染组BAX阳性表达率显著高于Ad-GFP转染组及单纯损伤组(P<0.05);Bcl-2阳性表达率高于正常血管,但与Ad-GFP转染组和单纯损伤组无显著差异(P>0.05);Ad-ANT1转染组新生内膜及中膜平滑肌细胞凋亡率显著高于其他各组(P<0.05);在14、28 d时,Ad-ANT1转染组新生内膜及中膜面积比(IA/MA)小于Ad-GFP转染组及单纯损伤组(P<0.05)。结论腺病毒载体介导过表达ANT1可诱导大鼠颈总动脉球囊损伤动物模型新生内膜及中膜VSMC的凋亡,其作用可能通过上调促凋亡蛋白BAX的表达实现。     

体内转染eNOS基因抑制损伤后动脉内膜新生的实验研究

目的 研究体内转染eNOS(内皮型一氧化氮合酶)基因对损伤后血管内膜新生的抑制作用.方法 2F球囊导管损伤大鼠颈总动脉内膜后,随机分成空白对照组、pcDNA3、1(-)组和pcDNA3.1-eNOS组,分别以PBS、脂质体Fugene 6介导pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1-eNOS体内转染至损伤后血管段,2周后对转染后血管平滑肌细胞行RT-PCR鉴定eNOS基因mRNA表达;转染1个月和2个月后对各组颈总动脉行免疫组化染色,计算机图像分析计算新生内膜面积(1)、新生内膜/中膜面积比值(I/M).结果 pcDNA3.1-eNOS体内转染组的颈总动脉血管平滑肌细胞有效表达eNOS基因mRNA.转染后1个月和2个月,eNOS基因体内转染组血管新生内膜面积、I/M比值均比PBS对照组、空载体pcDNA3.1(-)转染组显著减少(0.01).结论 eNOS基因体内转染损伤后动脉能有效抑制血管内膜新生,防止损伤后血管再狭窄.     

磁性壳聚糖纳米介导eNOS基因转染受损平滑肌细胞初探

目的:探讨磁性壳聚糖(后简称磁聚糖)纳米载体对血管平滑肌细胞的毒性及介导内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因对受损血管平滑肌细胞的转染效率、表达及对细胞增生的影响。方法:原位共沉淀法制备磁聚糖并耦合eNOS质粒;MTT法检测磁聚糖对血管平滑肌细胞生长的毒性;分别以重组腺病毒表达载体(AdCMV-eNOS)、磁聚糖-eNOS和磁聚糖空载体在外加磁场下转染受损血管平滑肌细胞,免疫荧光染色及RT-PCR测定eNOS表达,流式细胞术检测转染效率及血管平滑肌细胞周期和凋亡情况。结果:在浓度低于20 mg.ml-1时,磁聚糖对血管平滑肌细胞的生长无明显毒副作用;磁聚糖-eNOS组转染效率[(58.7±3.6)%]较AdCMV-eNOS组[(78.1±2.5)%]低,但两组均检测到eNOS mRNA和蛋白表达,且两组受损血管平滑肌细胞G0/G1期细胞较磁聚糖空载体组明显增多(P<0.01),S/G2-M期细胞减少(P<0.01),3组的细胞凋亡无显著差异(P>0.05)。结论:正常浓度的磁聚糖对血管平滑肌细胞生长无抑制作用,该载体能成功介导eNOS基因的转染,延缓受损后血管平滑肌细胞增生周期。     

腺病毒介导的eNOS基因转移对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的 :探讨腺病毒载体介导的内皮型一氧化氮合酶 (eNOS)基因转染血管平滑肌细胞 (VSMC)的效率及其对冠状动脉旁路移植术后再狭窄基因治疗的可行性。方法 :构建带有eNOS基因的复制缺陷型重组腺病毒转染体外培养的VSMC ,应用聚合酶链 (PCR)、逆转录PCR(RT PCR)技术和免疫组化法检测外源基因转染及表达效率 ;应用MTT法和流式细胞仪检测eNOS基因对VSMC的抑制作用。结果 :外源性eNOS基因成功导入了VSMC ;VSMC中有eNOS基因mRNA的表达 ;外源性eNOS蛋白呈高效表达。eNOS基因重组腺病毒载体转染细胞后 ,可显著抑制VSMC的生长 ,DNA合成减少。结论 :腺病毒介导的eNOS基因可高效地转染VSMC ,并可有效抑制细胞生长。     

腺病毒介导eNOS转染高肺血流肺动脉高压大鼠模型的研究

目的 观察腺病毒介导的内皮型一氧化氮合酶基因(eNOS)转染对高肺血流肺动脉高压大鼠模型肺动脉高压形成的影响.方法 随机将40只大鼠分为假手术组、手术组、实验组和对照组,每组10只.手术组、实验组和对照组采用套管连接法建立左向右分流肺动脉高压模型,实验组采用气管吸入法转染重组腺病毒AdCMVeNOS,采用免疫组化法观察eNOS蛋白表达,采用比色法测定肺组织eNOS活性,测量各组大鼠平均肺动脉压(mPAP)、右心室平均压(mRVP)、平均颈动脉压(mCAP)、右心肥厚指数(RVHI),采用HE染色观察肺动脉形态学改变,计算管壁厚度与血管外径比值(WT%).结果 实验组免疫组化染色可见全层血管壁内棕黄色颗粒,eNOs表达强度明显高于对照组(P<0.05),假手术组eNOS表达的阳性细胞介于实验组与对照组之间.手术组和对照组的eNOS活性比假手术组明显降低(P<0.05);实验组的eNOS活性显著高于对照组,且较假手术组亦明显升高(P<0.05).手术组和对照组大鼠的mRVP、mPAP、RVHI和WT%均明显高于假手术组(P<0.05).与对照组相比,实验组大鼠mRVP、mPAP、RVHI和WT%均显著降低(P<0.05);手术组与对照组各值之间差异不明显.结论 腺病毒介导的eNOS基因转染能够上调高肺血流肺动脉高压大鼠肺组织中eNOS表达及其活性,延缓肺动脉高压的发展和肺血管的重塑.     

腺病毒介导的eNOS基因转移时血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的：探讨腺病毒载体介导的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因转染血管平滑肌细胞（VSMC）的效率及其对冠状动脉旁路移植术后再狭窄基因治疗的可行性。方法：构建带有eNOS基因的复制缺陷型重组腺病毒转染体外培养的VSMC，应用聚合酶（PCR），逆转录PCR（RT－PCR）技术和免疫组化法检测外源基因转染及表达效率；应用MTT法和流式细胞仪检测eNOS基因对VSMC的抑制作用。结果：外源性eNOS基因成功导入了VSMC；VSMC中有eNOS基因mRNA的表达；外源性eNOS蛋白呈高效表达。eNOS基因重组腺病毒载体转染细胞后，可显著抑制VSMC的生长，DNA合成减少。结论：腺病毒介导的eNOS基因可高效地转染VSMC，并可有抑制细胞生长。     

壳糖体外介导血管平滑肌细胞内皮型一氧化氮合酶基因转移的初步研究

目的探讨壳糖作为非病毒载体介导质粒体外转染哺乳动物平滑肌细胞的可行性、转染效率及影响转染效率的因素。方法用壳糖包被携带绿色荧光蛋白(GFP)基因和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因的质粒PAdTrack-CMV-eNOS,制备壳糖/质粒复合体(CPC-eNOS),在不同条件下将其和Wistar大鼠血管平滑肌细胞孵育,通过检测靶细胞是否表达GFP和eNOS,评价壳糖介导质粒转染的效率。并以裸质粒PAdTrack-CMV- eNOS和重组腺病毒表达载体Ad-eNOS分别作为对照。结果荧光显微镜下472nm观察,CPC-eNOS和重组腺病毒表达载体Ad-eNOS孵育的血管平滑肌细胞均观察到绿色荧光,Western印迹法检测均有eNOS蛋白表达,但裸质粒PAdTrack-CMV-eNOS组均为阴性。CPC-eNOS中氨基/磷酸基比值(N/P比值)为5、pH值为7.0时,对平滑肌细胞的转染效率最高。结论CPC-eNOS能够体外介导转染哺乳动物的血管平滑肌细胞。转染效率与CPC-eNOS的N/P比值和转染介质pH值有关。     

内皮型一氧化氮合酶基因转染在兔颈静脉移植血管桥中的表达

目的:研究腺病毒载体介导的人内皮型一氧化氮合成酶基因在兔自体移植颈静脉中的表达,寻找预防移植血管再狭窄的方法.方法:建立兔颈外静脉颈总动脉旁路移植模型,18只兔随机等分为3组,A:对照组,B:空载腺病毒液感染组,C:eNOS基因转染组.在兔颈外静脉颈总动脉旁路移植术中,分别应用空载腺病毒液或AdCMVeNOS血管桥内注入法感染移植静脉1 h.术后4 wk,应用多聚寡核苷酸探针原位检测方法检测外源性基因mRNA的表达;免疫组织化学染色方法检测eNOS蛋白的定位;HE及弹力纤维染色后,应用计算机图像分析系统检测移植静脉内膜、中膜增生情况.结果:人内皮型一氧化氮合成酶基因在自体移植静脉中表达出相应的mRNA和蛋白质;术后4wk,与对照组相比,空载腺病毒液感染组移植静脉内膜和中膜厚度无明显变化;eNOS基因转染组移植静脉内膜和中膜厚度分别减少42.3%,13.5%,内膜厚度/中膜厚度比值(I/M)减少34.6%.结论:腺病毒载体介导的人内皮型一氧化氮合成酶基因成功转染兔自体移植颈静脉中并有效表达,eNOS基因具有防治移植静脉内膜增生作用.     

RhoA/ROCK信号系统对血管外膜炎症介导的大鼠颈动脉平滑肌细胞增殖和表型变化的影响

 目的 探讨RhoA/ROCK信号系统在血管外膜炎症介导的大鼠颈动脉平滑肌细胞（VSMC）增殖和表型变化中的作用机制。 方法 将20只Wistar大鼠按随机数字表法均分为模型组（用硅胶管包裹大鼠颈动脉1周,造成血管外膜的慢性炎性损伤）和对照组,取材后HE染色,分别观察2组血管形态学变化,采用RT-PCR和Western blot检测血管组织中SM α-actin 与ROCK2的表达。 结果 与对照组相比,模型组颈动脉血管外膜增厚,炎性细胞浸润,中膜平滑肌细胞增生,排列紊乱,VSMC中SM α-actin mRNA水平和蛋白表达水平均增高,ROCK2 mRNA水平与对照组相比无显著差异,蛋白表达水平均明显增高。 结论 RhoA/ROCK信号系统可能参与血管外膜炎症介导的大鼠颈动脉VSMC增殖和表型变化的调控。     

VEGF165真核表达载体的构建及其在鼠膀胱平滑肌细胞的表达

目的 构建血管内皮生长因子(VEGF165)真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165,转染鼠膀胱平滑肌细胞并检验其生物学活性.方法 将VEGF165 cDNA克隆于真核表达载体pcDNA3.1(-),构建真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165;并转染入鼠膀胱平滑肌细胞,采用RT-PCR和免疫荧光染色检测VEGF165基因在鼠膀胱平滑肌细胞中的表达,并用MTT法检测转染后细胞上清液中VEGF165的生物学活性.结果 和结论将构建的真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165转染入鼠膀胱平滑肌细胞后,VEGF的表达增高,转染后细胞上清液具有促使内皮细胞增殖的生物学活性.     

一氧化氮对血管平滑肌细胞增殖的影响及与细胞周期调节的关系

目的 :评价NO供体 (DETANO)抑制血管平滑肌细胞增殖的效应及其抗增殖效应与细胞周期抑制蛋白P2 7kip1的关系。方法 :将DETANO(10 -5～ 10 -3 mol·L-1)、DETA(10 -3 mol·L-1)及阴性对照 (DMSO)作用于体外培养的血管平滑肌细胞 ,观察不同处理因素的抗增殖效应。应用蛋白杂交方法分析G0 期、增殖期和DETANO作用的平滑肌细胞中P2 7的表达水平。结果 :DETANO能抑制血管平滑肌细胞的增殖 ,以 10 -3 mol·L-1浓度的DETANO效果最显著 ,而单纯DETA对细胞增殖无抑制效应。而且DETANO和DETA无细胞毒性效应。蛋白印迹分析表明处于G0期的细胞P2 7高水平表达 ,给予 10 %胎牛血清刺激 2 4h后 ,P2 7水平迅速下降。若预先给予DETANO(10 -3 mol·L-1)干预 ,则P2 7蛋白水平下调的效应减弱。结论 :DETANO能抑制血管平滑肌细胞增殖 ,其抗增殖机制与细胞周期调控和上调P2 7kip1相关。     

PTEN基因重组腺病毒对人气道平滑肌细胞增殖的影响及其作用机制

目的 观察携带野生型PTEN基因的重组腺病毒(Ad-PTEN)体外转染人气道平滑肌细胞(HASMC)后的表达,研究其对HASMC增殖的影响,并对其作用机制作初步的探讨.方法 利用pAdxsi载体系统构建携带PTEN基因的腺病毒载体,体外转染HASMC,荧光显微镜观察Ad-PTEN的转染效率.RT-PCR及Western blotting检测PTEN在HASMC中的表达.采用MTS/PMS法检测细胞增殖,流式细胞仪测定细胞周期分布.Western blotting检测Akt及p-Akt的表达,RT-PCR检测P2lmRNA的表达.结果 外源性野生型PTEN基冈经腺病毒介导成功转入HASMC,当感染复数MOI为100时,体外转染效率高达98%以上.Ad-PTEN感染HASMC后,能有效地引起细胞内过度表达PEEN.上调PTEN表达能显著提高G0/G1期细胞的比例,抑制细胞的增殖.上调PTEN表达能显著降低p-Akt及提高P21的表达水平.结论 成功构建了过度表达PTEN的原代培养HASMC模型,该模型能有效地引起细胞内过度表达PTEN.上调PTEN表达能有效抑制HASMC的增殖,可能是通过对P13K/AKt信号通路的抑制及上调P21的表达而起作用的.     

一氧化氮合酶蛋白和基因在肝肺综合征大鼠肺组织中的表达

目的　探讨一氧化氮 (NO) 在肝肺综合征 (HPS) 发生机制中的作用。方法　采用 Wistar大鼠行胆总管结扎术 (CBDL) 制备HPS动物模型, 应用免疫组化方法观察内皮型一氧化氮合酶 (eNOS) 和诱导型一氧化氮合酶(iNOS) 蛋白在肺血管的表达和分布特点, 采用RT PCR方法检测肺组织中eNOS、iNOS mRNA的表达。结果　CB- DL组肺血管eNOS染色强度较假手术组显著升高 (P<0 .01), 而 iNOS表达在两组间差异无显著性意义 (P>0 .05);CBDL组大鼠肺组织eNOS mRNA的表达较对照组增高 (P<0. 01), 两组iNOS mRNA的相对表达量差异无统计学意义; 相关分析表明, 肺组织中eNOS mRNA水平与肺泡动脉氧分压差 (A- aDO2) 显著相关 (r=0. 920 1, P<0. 01)。结论　HPS时内皮细胞eNOS表达增强可能是肺血管NO增多的主要原因。     

RNA干扰抑制血管平滑肌细胞MT1-MMP基因表达的实验研究

目的 探讨膜型基质金属蛋白酶-1(MT1-MMP)shRNA真核表达载体(pGenesil-1-MT1-MMP)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)MT1-MMP基因mRNA表达及蛋白表达的影响.方法 构建质粒表达载体pGenesil-1-MT1-MMP和pGenesil-1-HK;实验分为3组:空白对照组,阴性对照组(加入pGenesil-1-HK),RNA干扰(RNAi)组(加入pGenesil-1-MT1-MMP).用脂质体瞬时转染VSMC,48 h后通过荧光显微镜观察转染效果,流式细胞仪检测转染效率.于转染后72 h采用RT-PCR方法检测MT1-MMP mRNA表达水平,用Western blot方法检测MT1-MMP蛋白质表达水平.结果 瞬时转染VSMC 48 h后通过流式细胞仪检测转染效率高达85.5%,转染pGenesil-1-MT1-MMP质粒72 h后,RNAi组MT1-MMP mRNA及蛋白质水平明显下调(P<0.05).结论 靶向MT1-MMP的短发夹RNA质粒能够高效地转染入VSMC,并能有效下调MT1-MMP基因mRNA和蛋白的表达.