补肾活血方干预高糖高脂诱导的小鼠脑微血管内皮细胞损伤的研究

目的在细胞水平探索补肾活血方干预高糖高脂诱导的小鼠脑微血管内皮细胞损伤的研究。方法在体外实验中采用高糖高脂刺激小鼠脑微血管内皮细胞。实验分组为:空白对照组、模型组[25 mmol/L葡萄糖(HG),200μmol/L棕榈酸(PA)]、补肾活血方30、60、120 mg/L组。CCK-8细胞增殖实验方法检测补肾活血方对高糖高脂诱导的细胞存活率的影响;采用试剂盒检测各组细胞部分氧化应激因子[活性氧(ROS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、一氧化氮(NO)、血管内皮生长因子(VEGF)]、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)和部分炎症因子[IL-6、细胞黏附因子1 (ICAM-1)、TNF-α、转化生长因子β1(TGF-β_1)]的含量变化。采用实时荧光定量PCR法检测iNOS和TNF-αmRNA表达。结果 (1)与空白对照组(100%±2.3%)比较,模型组细胞的细胞存活率显著降低(62.6%±0.5%,P0.01);与模型组比较,补肾活血方30、60、120 mg/L组细胞的存活率显著升高[(70.5%±4.0%),(76.3%±2.8%),(80.5%±2.7%),P0.05,P0.01]。(2)与空白对照组比较,模型组细胞的部分氧化应激因子(ROS、iNOS、NO、VEGF)、MMP-2、MMP-9、TIMP-1以及炎症相关因子(IL-6、ICAM-1、TNF-α、TGF-β_1)含量显著上升(P0.05,P0.01)。与模型组比较,补肾活血方30、60、120 mg/L组作用后各检测因子的表达降低(P0.05,P0.01)。(3)荧光定量PCR结果显示,与空白对照组比较,模型组iNOS和TNF-αmRNA表达均增加(P0.01),与模型组比较,BSHX 120 mg/L组iNOS mRNA表达及BSHX 60、120 mg/L组TNF-αmRNA表达均降低(P0.05,P0.01)。结论高糖高脂能够促进ROS、iNOS、NO、VEGF、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和部分炎症因子等相关指标的表达,使细胞活力降低,而补肾活血方可以改善高糖高脂诱导的小鼠脑微血管内皮细胞的损伤。     

活血解毒方对糖尿病大鼠坐骨神经AGEs-RAGE-NF-κB途径的影响

目的观察活血解毒方对糖尿病大鼠坐骨神经中糖基化终产物(Glycation end products,AGEs)-糖基化终产物受体(Glycation end product receptor,RAGE)-核因子-κB(nuclear factor-B,NF-κB)途径的影响。方法雄性SD大鼠分为正常组、模型组、甲钴胺组、活血解毒方高、低剂量组。链脲佐菌素(streptozocin,STZ)腹腔注射65mg/kg造模,免疫组化法检测坐骨神经中AGEs、RAGE、NF-κB蛋白的表达。结果与正常组比较,模型组大鼠坐骨神经内AGEs、RAGE、NF-κB水平升高;与模型组比较,活血解毒方组大鼠坐骨神经内AGEs、RAGE、NF-κB表达降低。结论活血解毒方可能是通过抑制AGEs-RAGE-NF-κB途径从而防治糖尿病神经病变。     

基于内质网应激探讨淫羊藿苷对TM4细胞损伤的保护作用

目的:基于内质网应激(ERS)探讨淫羊藿苷对D-半乳糖(D-Gal)诱导的小鼠睾丸支持细胞株TM4细胞损伤的保护作用。方法:将TM4细胞分为正常对照组、模型组及淫羊藿苷低(0.5μmol/L)、高(1.0μmol/L)浓度组。Western blot法检测TM4细胞紧密连接相关蛋白Occludin、Claudin-1及内质网应激相关蛋白GRP78、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、p-IRE1、XBP1、ATF6表达水平。结果:Western blot结果显示,与正常对照组比较,模型组细胞紧密连接相关蛋白Occludin、Claudin-1及内质网应激相关蛋白GRP78、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、p-IRE1、XBP1、ATF6表达显著降低(P0.01),给予淫羊藿苷干预后上述蛋白表达均显著升高(P0.05或P0.01)。结论:淫羊藿苷可减轻D-Gal诱导的TM4细胞损伤,其机制可能与上调内质网应激信号通路有关。     

马钱苷对糖基化终末产物致肾系膜细胞内质网应激的保护作用机制

目的探讨山茱萸环烯醚萜苷特征性成分马钱苷对糖基化终末产物(AGEs)刺激肾小球系膜细胞(GMCs)内质网应激的保护作用及其机制。方法体外培养GMCs,并设对照组、模型组、马钱苷(0.1、1.0、10.0μmol/L)组,氨基胍(0.1、1.0、10.0μmol/L)组作为阳性对照。加入药物预孵1 h后,用AGEs(200 mg/L)刺激,24 h后采用MTS法检测马钱苷对GMCs增殖的影响;Western blotting法检测GMCs中糖基化终末产物受体(RAGE)、内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、抑制物阻抗性酯酶(IRE1)、X盒结合蛋白1(XBP1),炎症相关因子核转录因子-κB(NF-κB)、环氧合酶-2(COX-2)及前列腺素E_2(PGE_2)的表达。结果马钱苷能够抑制AGEs导致的GMCs增殖,下调RAGE蛋白的表达,改善GMCs亚细胞器损伤,降低内质网相关蛋白GRP78、IRE1的表达,减少XBP1蛋白分化,降低炎症相关蛋白NF-κB、COX-2表达,降低细胞上清中PGE2水平。结论马钱苷可改善AGEs致GMCs的内质网应激,减轻其引起的炎症反应及细胞器损伤,其作用机制与降低RAGE蛋白表达、抑制IRE1通路有关。     

益气补肾调脂方对非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝脏内质网应激相关基因mRNA的影响

目的:观察中药复方益气补肾调脂方对高脂高果糖饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠的肝脏内质网应激相关基因m RNA的影响。方法:高脂高果糖饮食诱导16周,建立NASH小鼠模型,在造模第5周开始,分别予以益气补肾调脂方高、中、低三种剂量干预12周,在16周末处死小鼠。采用ELISA法检测血清游离脂肪酸(FFAs)的水平,real time-PCR法检测肝组织内质网应激相关基因mRNA的表达水平。结果:模型组血清FFAs、肝组织葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、激活转录因子6(ATF6)、CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)mRNA的表达水平较正常组升高(P0.05,P0.01),肝组织X-盒结合蛋白1(XBP1)mRNA的表达水平较正常组下降(P0.05)。经益气补肾调脂方干预后,小鼠血清FFAs水平、肝组织GRP78、ATF6、CHOPmRNA较模型组下降(P0.05),肝组织XBP1mRNA表达较模型组有所上升(P0.05)。结论:益气补肾调脂方可能通过改善肝脏内质网应激来发挥抗NASH的作用。     

高糖环境下不同浓度黄芪注射液对肾小管上皮细胞凋亡及NF-κB表达的影响

目的观察不同浓度黄芪注射液对高糖环境下肾小管上皮细胞(HK-2)凋亡和核转录因子κB (NF-κB)蛋白表达的影响,探讨黄芪注射液浓度与细胞凋亡率、NF-κB蛋白表达间的关系。方法肾小管上皮细胞用无血清培养基同步化24 h后随机分为低糖组、高糖组、高糖+2μg/m L黄芪注射液组、高糖+20μg/m L黄芪注射液组、高糖+200μg/m L黄芪注射液组,每组设3个复孔。细胞培养48 h和72 h后收集细胞及细胞上清液,用流式细胞仪测定各组细胞凋亡率,Western blot方法测定各组NF-κB蛋白表达量,分析黄芪注射液浓度、细胞凋亡率、NF-κB蛋白表达之间的相关性。结果细胞培养48 h和72 h,低糖组和黄芪注射液各干预组细胞凋亡率及NF-κB蛋白表达量均明显低于高糖组(P均0. 05)。黄芪注射液各干预组间细胞凋亡率及NF-κB蛋白表达量比较差异均有统计学意义(P均0. 05),高糖+200μg/m L黄芪注射液组最低。黄芪注射液浓度与细胞凋亡率、NF-κB蛋白表达量呈负相关,NF-κB蛋白表达量与细胞凋亡率呈正相关。结论黄芪注射液能抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡和NF-κB蛋白表达,黄芪注射液浓度、细胞凋亡率、NF-κB蛋白表达之间有显著相关性。     

益智汤对APP695转基因小鼠行为学及脑组织LRP-1和RAGE表达的影响

目的:观察益智汤对淀粉样蛋白前体蛋白(APP)695转基因小鼠行为学及脑组织低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP-1)和高糖基化终产物受体(RAGE)表达的影响,探讨益智汤治疗阿尔茨海默病(AD)的作用机制。方法:13月龄APP695转基因小鼠随机分为模型组、益智汤组、同月龄同背景转基因阴性小鼠正常组。益智汤组小鼠每天根据体质量以益智汤(1mL/100g)灌胃,模型组和正常组给予等体积蒸馏水。中药治疗3个月后,使用电迷宫检测各组小鼠学习记忆能力,使用免疫组化和Western Blot技术观察各组小鼠大脑LRP-1和RAGE的表达情况。结果:电迷宫检测发现模型组小鼠学习记忆能力低于正常组(P0.01),益智汤组小鼠学习记忆能力较模型组小鼠明显改善(P0.01)。免疫组化和Western Blot结果提示:与正常组相比,模型组小鼠脑组织LRP-1的表达降低,RAGE的表达增加(P0.01);益智汤治疗90d后,与模型组相比,益智汤组小鼠脑组织各LRP-1的表达增强,RAGE的表达降低(P0.05)。结论:APP695转基因小鼠脑组织LRP-1和RAGE的表达改变,益智汤通过调整LRP-1和RAGE的表达来改善其学习记忆能力。     

基于GRP78/PERK/ATF4的泽泻汤改善脂质诱导肝细胞内质网应激作用机制研究

目的:基于GRP78/PERK/ATF4通路探讨泽泻汤改善肝细胞内质网应激的潜在机制。方法:采用油酸(OA)及高脂饮食诱导高脂细胞及动物内质网应激(Endoplasmic reticulum stress, ERS)模型。ER与Ca²⁺荧光共定位观察泽泻汤对ER-Ca²⁺稳态的调节情况；流式细胞术及Tunel法检测泽泻汤对凋亡的影响；Q-PCR检测ER核心信号1(Ern1)、转录激活因子6(Atf6)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein,Chop)、Grp78、Perk、X-盒结合蛋白1(Xbp1)、热休克蛋白90β1(Hsp90β1)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10B(Tnfrsf10b)的mRNA表达；Western bolt法检测葡萄糖调节蛋白78/B细胞免疫球蛋白结合蛋白(GRP78/BIP)GRP78、类PKR的内质网激酶(PERK)、p-PERK和转录激活因子4(ATF4)的蛋白表达。结果:与正常对照组相比，模型对照组ER-Ca     

丹参酮ⅡA减轻棕榈酸诱导的心肌细胞凋亡及内质网应激

【目的】 探讨丹参酮ⅡA对棕榈酸诱导心肌细胞脂毒性损伤模型内质网应激凋亡的影响。【方法】 将对数期H9c2细胞分6组,即对照组,棕榈酸（400 μmol/L）组,丹参酮 ⅡA 20 μmol/L组和棕榈酸+丹参酮 ⅡA（5、10、20 μmol/L）组,另外引入棕榈酸+CCT020312组与棕榈酸+CCT020312+丹参酮ⅡA 20 μmol/L组考察通路激活状态。细胞计数试剂盒8（CCK-8）法测定H9c2细胞活力;流式细胞术测定细胞凋亡情况;实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）法检测细胞内质网应激相关分子葡萄糖调控蛋白78（GRP78）、转录激活因子4（ATF4）和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）的mRNA表达水平;蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测细胞 GRP78、ATF4、CHOP、Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12、蛋白激酶 RNA 样内质网激酶（PERK）、磷酸化PERK（p-PERK）、真核生物翻译起始因子2α（eIF2α）、磷酸化eIF2α（p-eIF2α）的蛋白表达水平。【结果】与对照组比较,棕榈酸组细胞存活率显著降低（P < 0.01）,GRP78、ATF4、CHOP mRNA 和蛋白表达水平均显著升高（P <0.01）,H9c2 细胞的凋亡率升高,p-PERK/PERK 和 p-eIF2α/eIF2α 比例也显著增大（P < 0.01）,凋亡相关分子 Caspase-3、Caspase-9和Caspase-12蛋白表达水平均显著升高（P < 0.01）。不同浓度丹参酮 ⅡA作用后,与棕榈酸组比较,棕榈酸+丹参酮 ⅡA（5、10、20 μmol/L）组细胞存活率显著升高（P < 0.01）,GRP78、ATF4、CHOP mRNA 和蛋白表达水平均显著降低（P < 0.01）,H9c2细胞的凋亡率降低,p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α比例也显著减小（P < 0.01）,Caspase-3、Caspase-9和Caspase-12蛋白表达水平显著降低（P < 0.01）,均具有剂量依赖性,且棕榈酸+丹参酮 ⅡA 10 μmol/L组（P < 0.05）和棕榈酸+丹参酮 ⅡA 20 μmol/L 组（P < 0.05）变化显著。加入 PERK 通路激活剂 CCT020312 作用后,与棕榈酸组比较,棕榈酸+CCT020312组的p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α比例,细胞凋亡率,GRP78、ATF4、CHOP 的mRNA和蛋白表达水平均显著升高（P < 0.05）;再经过丹参酮ⅡA处理,与棕榈酸+CCT020312组比较,棕榈酸+CCT020312+丹参酮ⅡA组的p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α比例,细胞凋亡率,GRP78、ATF4、CHOP 的mRNA和蛋白表达水平均显著回降（P < 0.05）。【结论】 丹参酮ⅡA可减轻心肌细胞脂毒性损伤,其机制与其通过抑制PERK信号通路活化来减轻棕榈酸诱导的心肌H9c2细胞凋亡,并且控制内质网应激反应有关。     

黄芪桂枝五物汤对糖尿病周围神经病变大鼠模型AGEs/RAGE/NF-κB信号通路的影响

目的:研究黄芪桂枝五物汤对糖尿病周围神经病变大鼠模型晚期糖基化终产物(AGEs)/晚期糖基化终产物受体(RAGE)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路的影响,探讨黄芪桂枝五物汤减轻糖尿病周围神经病变的作用机制。方法:以高脂饮食加腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导法,制作糖尿病周围神经病变大鼠模型。造模成功后,按照随机数字表法分成模型组、黄芪桂枝五物汤高、中、低剂量组、甲钴胺组,共5组,另设正常组,自第5周开始黄芪桂枝五物汤干预,采用黄芪桂枝五物汤高、中、低剂量组(19. 40,4. 85,2. 43 g·kg-1·d-1)连续灌胃12周;甲钴胺组采用甲钴胺0. 25 mg·kg-1·d-1灌胃。实验结束后,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒检测糖尿病周围神经病变大鼠血清白细胞介素-1β(IL-1β),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测坐骨神经组织中RAGE,NF-κB p65 mRNA含量;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测坐骨神经组织中RAGE,NF-κB,磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)蛋白的表达变化。结果:与正常组比较,模型组大鼠血清IL-1β,TNF-α含量,坐骨神经组织RAGE,NF-κB p65 mRNA含量,RAGE,NF-κB p65及p-NF-κB p65蛋白表达显著增加(P0. 01),p-NF-κB p65/NF-κB p65升高,p-NF-κB p65蛋白表达显著升高(P0. 01)。经黄芪桂枝五物汤干预后,与模型组比较,各给药组血清IL-1β,TNF-α含量,RAGE,NF-κB p65 mRNA含量,RAGE,NF-κB p65及p-NF-κB p65蛋白表达量均显著降低(P0. 01),黄芪桂枝五物汤高剂量组p-NF-κB p65/NF-κB p65显著降低(P0. 01),且呈剂量相关性,随黄芪桂枝五物剂量增加而效果明显。结论:黄芪桂枝五物汤可减轻糖尿病周围神经病变,其机制可能与阻断AGEs/RAGE/NF-κB信号通路中组织细胞表面RAGE的表达、抑制NF-κB激活及其引发TNF-α触发的氧化应激和过度炎症反应,从而避免细胞受损和功能紊乱有关。     

黄芪汤对高糖诱导足细胞损伤的保护作用及机制研究

目的观察黄芪汤对高糖诱导足细胞损伤的影响及作用机制。方法实验分为5组:对照组足细胞采用5.5 mmol/L葡萄糖培养液培养,模型组足细胞采用30 mmol/L葡萄糖培养液培养,黄芪汤30μg/mL组、黄芪汤100μg/mL组、黄芪汤300μg/mL组分别采用30 mmol/L葡萄糖培养液和相应浓度黄芪汤进行培养。细胞培养48 h后,采用CCK-8法检测各组细胞存活率,采用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,采用免疫荧光法检测各组细胞标记蛋白podocin表达情况,采用Western blot检测各组细胞内质网应激通路蛋白[葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶(p-PERK)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、磷酸化真核起始因子2α(p-eIF2α)、真核起始因子2α(eIF2α)]及其介导的凋亡相关蛋白[增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)]表达情况。结果模型组细胞存活率明显低于对照组(P<0.05),细胞凋亡率明显高于对照组(P均<0.05);黄芪汤各组细胞存活率均明显高于模型组(P均<0.05),细胞凋亡率均明显低于模型组(P均<0.05),且呈浓度依赖性。模型组podocin表达荧光强度明显弱于对照组,黄芪汤各组随着药物浓度升高podocin表达荧光强度明显增强。模型组GRP78、p-PERK、p-eIF2α、CHOP表达水平均明显高于对照组(P均<0.05);黄芪汤各组GRP78、p-PERK、p-eIF2α、CHOP表达水平均明显低于模型组(P均<0.05),且黄芪汤各组随药物浓度的升高GRP78、p-PERK、p-eIF2α表达水平均逐渐降低(P均<0.05)。模型组Bcl-2表达水平明显低于对照组(P<0.05);黄芪汤100μg/mL组、黄芪汤300μg/mL组Bcl-2表达水平均明显高于模型组(P均<0.05);黄芪汤100μg/mL组与黄芪汤300μg/mL组Bcl-2和CHOP表达水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论黄芪汤可呈浓度依赖性的抑制高糖诱导的足细胞损伤,其作用可能与抑制PERK介导的内质网应激途径有关。     

丹芍化纤胶囊对大鼠肺纤维化内质网应激相关蛋白GRP78及NF-κB表达的影响

目的:观察内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)及核因子-κB(NF-κB)在盐酸博来霉素诱导的肺纤维化中的变化及中药丹芍化纤胶囊对其表达的影响。方法:选取SD大鼠30只,随机分为正常组、肺纤维化模型组和丹芍化纤胶囊治疗组,每组各10只。正常组气管内滴注生理盐水,模型组和丹芍组气管内一次性灌注盐酸博来霉素5mg/kg诱导肺纤维化,丹芍组于造模第2天给予丹芍化纤胶囊混悬液灌胃(0.8g.kg-1.d-1)治疗,正常组及模型组则给予等量生理盐水灌胃。实验第28天称大鼠体质量,处死各组大鼠,称肺湿重并收集肺组织,行HE和Masson染色观察肺组织病理变化;采用免疫组织化学的方法检测肺组织中GRP78及NF-κB蛋白的表达情况。结果:与正常组比较,模型组大鼠肺组织中GRP78及NF-κB表达明显升高(P<0.01);经丹芍化纤治疗后,大鼠肺组织中GRP78及NF-κB蛋白表达显著降低(P<0.01)。结论:GRP78及NF-κB可能参与了盐酸博来霉素诱导的肺纤维化过程。丹芍化纤胶囊对肺纤维化的干预机制可能与抑制肺组织中GRP78及NF-κB的表达,减轻内质网应激所引起的损伤有关。     

芍药苷配伍小檗碱对 TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞NF-κB/YY1 信号通路的影响

目的基于NF-κB/YY1信号通路探讨芍药苷配伍小檗碱对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)炎症反应的影响。方法体外培养HUVECs,分别设空白对照组、模型组(TNF-α20 ng/m L)、芍药苷组(PF 160μmol/L)、小檗碱组(BBR 20μmol/L)、配伍组(160μmol/L芍药苷+20μmol/L小檗碱组)。采用CCK8法检测各组细胞活力;LDH毒性实验检测细胞上清液中LDH释放量;ELISA法检测细胞上清液中IL-6和IL-8含量;RT-PCR检测NF-κB、YY1基因表达;Western Blot法检测NF-κB、YY1蛋白表达。结果与空白对照组比较,模型组细胞活力减弱,LDH漏出率增加,IL-6和IL-8含量增加,NF-κB和YY1基因及蛋白表达上调(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,芍药苷组、小檗碱组及配伍组干预后细胞活力增强,LDH漏出率减少,IL6和IL-8含量降低,NF-κB和YY1基因及蛋白表达下调,且芍药苷和小檗碱配伍组较单体组干预后效果更明显(P<0.05,P<0.01)。结论TNF-α可激活HUVECs NF-κB/YY1信号通路,诱导炎症反应,加重内皮损伤。芍药苷配伍小檗碱较单药使用可更有效地抑制NF-κB/YY1信号通路,减轻炎症反应进而起到血管内皮保护作用。     

补肾活血方冻干粉对低氧诱导HTR-8/SVneo滋养细胞HIF-1α及VEGFA表达的影响

目的:探讨补肾活血方冻干粉对HTR-8/SVneo滋养细胞小管形成、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子A(VEGFA)表达的影响及其作用机制。方法:体外常规培养HTR-8/SVneo滋养细胞,采用CoCl2法诱导低氧环境,实验分为空白组、低氧模型组和补肾活血方冻干粉低、中、高剂量组。Tube formation法检测各组细胞小管形成能力,实时定量PCR及Western blotting检测各组细胞HIF-1αmRNA、VEGFA mRNA及其蛋白的表达。结果:小管形成实验结果显示,空白组、低氧模型组和补肾活血方冻干粉低、中、高剂量组形成的小管分支点数分别为12.35±1.25、27.76±1.79、31.61±0.82、33.24±1.22和38.84±1.68。Real-time PCR和Western blotting结果显示,与空白组比较,低氧模型组和补肾活血方冻干粉低、中、高剂量组VEGFA mRNA,以及补肾活血方冻干粉高剂量组HIF-1αmRNA表达均升高(P<0.05);与低氧模型组比较,补肾活血方冻干粉中、高剂量组VEGFA mRNA和补肾活血方冻干粉高剂量组HIF-1αmRNA表达均升高(P<0.05)。与空白组、低氧模型组比较,补肾活血方冻干粉低、中、高剂量组的HIF-1α、VEGFA蛋白表达均升高(P<0.05);与补肾活血方冻干粉低剂量组比较,补肾活血方冻干粉高剂量组HIF-1αmRNA、VEGFA mRNA和蛋白表达均升高(P<0.05);与补肾活血方冻干粉中剂量组比较,补肾活血方冻干粉高剂量组HIF-1α蛋白表达升高(P<0.05)。结论:补肾活血方冻干粉可以提高滋养细胞HTR-8/SVneo小管形成能力,其治疗复发性流产的机制可能与上调HIF-1αmRNA、VEGFA mRNA和蛋白表达相关。     

滋补脾阴方药对脾阴虚糖尿病大鼠大脑皮质内质网应激的影响

目的观察脾阴虚糖尿病大鼠大脑皮质磷酸化(p)RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(PERK)、真核起始因子2α-亚单位(eIF2α)、p-eIF2α、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的变化,探讨脾阴虚糖尿病相关认知下降发病机制及滋补脾阴方药的作用机制。方法将大鼠随机分为对照组、糖尿病组、脾阴虚组、脾阴虚糖尿病组(病证组)、脾阴虚糖尿病+滋补脾阴方药组(治疗组)。采用高脂喂养4周联合小剂量链脲佐菌素注射方法建立2型糖尿病模型。在此基础上采用饮食不节、劳倦过度及灌服伤阴药方法建立脾阴虚糖尿病模型。治疗组给予滋补脾阴方药灌胃,其余各组给予等体积生理盐水灌胃,连续15 d,取大脑皮质。采用Western Blot、RT-PCR方法观察PERK、eIF2α、p-eIF2α、GRP78表达变化。结果糖尿病组、脾阴虚组、病证组PERK、p-eIF2α蛋白表达及GRP78 mRNA表达较对照组增强(P0.05),糖尿病组、病证组GRP78蛋白表达较对照组增强(P0.05),治疗组上述分子表达较糖尿病组、病证组均减弱(P0.05)。结论内质网应激参与脾阴虚糖尿病相关认知下降的发病,滋补脾阴方药通过减轻内质网应激改善学习记忆障碍。     

基于NF-κB/TGF-β1/Smad3信号通路研究通腑活血方防治肠粘连作用机制

目的:观察通腑活血方对肠粘连模型大鼠盲肠组织中核转录因子-κB(NF-κB)/转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad3通路中相关因子表达的影响,探讨通腑活血方防治术后肠粘连的作用机制。方法:雄性SD大鼠48只,按照随机数字法分为四组:对照组、模型组、通腑活血方组和几丁糖组,每组12只,除对照组外,其余大鼠采用Ellis法制备肠粘连模型,分别给予各组大鼠相应处理。苏木素-伊红(HE)染色观察盲肠组织病理学变化,酶联免疫吸附法检测血清白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量,Western blot和RT-PCR法检测盲肠NF-κB/TGF-β1/Smad3信号通路中关键因子的蛋白和mRNA表达水平。结果:与对照组比较,模型组大鼠组织病理学出现显著变化,血清IL-6、TNF-α含量显著升高(P<0.01),盲肠组织中IL-6、TNF-α、p-NF-κBp65、TGF-β1、Smad3 mRNA和蛋白相对表达水平升高(P<0.01),基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白相对表达水平升高(P<0.01),核转录因子-κB抑制蛋白(IκB)、基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)蛋白表达水平显著降低(P<0.01); 与模型组比较,通腑活血方组和几丁糖组大鼠血清IL-6、TNF-α含量显著降低(P<0.01),盲肠组织中IL-6、TNF-α、p-NF-κBp65、TGF-β1、Smad3 mRNA和蛋白相对表达水平降低(P<0.01)、MMP-9蛋白相对表达水平降低(P<0.01),IκB、TIMP-1蛋白表达水平升高(P<0.01),且盲肠组织病理学均有显著改善,其中以通腑活血方组改善更显著。结论:通腑活血方可有效防止术后肠粘连的发生,其作用机制可能是通过抑制NF-κB/TGF-β1/Smad3信号通路活化,减少炎症因子的释放,调节TIMP-1/MMP-9平衡,防止肠粘连。     

止麻消痰活血汤治疗大鼠无复流心肌梗死实验研究

目的:探讨止麻消痰活血汤对心肌梗死无复流大鼠的治疗效果。方法:选择健康雄性大鼠60只,随机分为对照组、模型组和止麻消痰活血汤组,各20只。除对照组外,其他两组通过冠状动脉结扎方法建立心肌梗死无复流模型,自造模之日起,对照组和模型组给予生理盐水灌胃,止麻消痰活血汤组给予止麻消痰活血汤干预。造模成功4周后,观察各组心功能情况; ELISA法检测各组血清中IL-6、CRP、TNF-α水平情况,采用Western blot法检测心肌组织中NF-κB p65蛋白及其磷酸化水平情况。结果: 实验4周后,与对照组相比,模型组和止麻消痰活血汤组的LVESd及LVEDd明显增加,LVEF及LVFS明显降低,且模型组比对照组更明显(P<0.05); 实验4周后,模型组和止麻消痰活血汤组IL-6、CRP、TNF-α水平高于对照组,且模型组高于止麻消痰活血汤组(P<0.05)。NF-κB p65及phospho-NF-κB p65蛋白水平表达情况:对照组<止麻消痰活血汤组<模型组(P<0.05)。 结论:止麻消痰活血汤可通过抑制心肌梗死无复流大鼠NF-κB依赖的机制,抑制心脏重塑,改善其心功能,降低心肌炎症因子水平,从而改善无复流现象。     

白杨素调控NF-κB/Twist 1信号通路抑制Ⅱ型肺泡上皮细胞间质转分化的机制研究

研究白杨素(ChR)是否通过影响核转录因子κB(NF-κB)/Twist 1信号通路,进而抑制Ⅱ型肺泡上皮细胞间质转分化(EMT)而产生抗肺纤维化作用。动物实验设对照组、博莱霉素组(BLC)、BLC+ChR(50 mg·kg^-1)和BLC+ChR(100 mg·kg^-1)剂量组,每组动物15只。气管注射BLC(7500 U·kg^-1)诱导肺纤维化大鼠模型,造模后连续灌胃给药28 d。细胞实验设对照组、转化生长因子-β1(TGF-β1)(5 ng·mL^-1)组、TGF-β1+ChR(1,10,100μmol·L^-1)组,Ⅱ型肺泡上皮细胞先用TGF-β1处理24 h,再用TGF-β1和(或)不同剂量ChR处理48 h。肺组织病理变化和胶原沉积情况分别采用HE染色、Masson染色和免疫组化法进行观察。肺组织和细胞内Ⅰ型胶原(collagenⅠ)、E钙粘蛋白(E-cadherin)、紧密连接蛋白-1(ZO-1)、波形蛋白(vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、核转录因子κB抑制因子α(IκBα)、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65(p-p65)和Twist 1 mRNA及蛋白表达分别采用qPCR和(或)Western blot法检测。动物实验结果显示,与BLC组相比,ChR给药28 d后,大鼠肺纤维化程度明显减轻;肺组织collagenⅠ表达明显下降(P<0.05或P<0.01);肺组织肺泡上皮细胞EMT程度明显受到抑制[ZO-1和E-cadherin的表达明显升高,α-SMA和vimentin的表达明显降低(P<0.05或P<0.01)];肺组织细胞浆内IκBα和p65磷酸化水平、胞核内NF-κB p65和Twist 1的表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01)。细胞实验结果表明,不同剂量ChR能够明显减轻TGF-β1诱导的collagenⅠ的表达(P<0.05或P<0.01),显著抑制细胞EMT[E-cadherin和ZO-1的表达明显升高,vimentin和α-SMA的表达明显降低(P<0.05或P<0.01)],同时能够明显抑制TGF-β1诱导的细胞浆内IκBα和p65磷酸化水平并降低细胞核内NF-κB p65和Twist 1的表达(P<0.05或P<0.01)。综上结果推测ChR能够逆转肺泡Ⅱ型上皮细胞EMT、缓解肺纤维化,其机制可能与其降低细胞内IκBα磷酸化水平、抑制NF-κB p65的磷酸化和其核转移,进而下调Twist 1的表达有关。     

活血补肾祛风方对佐剂性关节炎大鼠白细胞介素1、肿瘤坏死因子-α及血清免疫球蛋白的影响

目的观察活血补肾祛风方对佐剂性关节炎(AA)大鼠白细胞介素1(IL-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及血清免疫球蛋白的影响,并探讨其作用机制。方法将32只SD大鼠随机分为4组,即空白对照组、模型对照组、雷公藤组和活血补肾祛风方组,各8只。除空白对照组外,其余各组均用弗氏完全佐剂0.1mL注入大鼠右后足跖皮下进行致炎,在致炎1周后进行第2次注射,8～12d产生超敏反应性炎症,制成AA模型。活血补肾祛风方组予活血补肾祛风方水溶液(3.1g/kg)灌胃,雷公藤组予雷公藤多甙片水溶液(30mg/kg)灌胃,空白对照组、模型对照组给予等量蒸馏水灌胃。每日1次,连续灌胃8周。观察各组大鼠关节炎指数(AI)及血清TNF-α、IL-1、免疫球蛋白(Ig)G、IgM的含量。结果雷公藤组、活血补肾祛风方组治疗后AI均较本组治疗前降低(P0.05),较模型对照组治疗后降低(P0.05)。活血补肾祛风方组治疗后AI较雷公藤组降低(P0.05)。模型对照组TNF-α、IgG、IgM、IL-1较空白对照组升高(P0.01),造模成功;雷公藤组、活血补肾祛风方组TNF-α、IgG、IgM、IL-1较模型对照组降低(P0.05);活血补肾祛风方组TNF-α、IgG、IgM、IL-1低于雷公藤组(P0.05)。结论活血补肾祛风方可降低AA大鼠AI及血清TNF-α、IL-1、IgG、IgM含量,可能是其治疗RA的作用机制。     

基于STAT3通路探讨补肾活血方抑制骨细胞凋亡

目的探讨补肾活血方通过信号转导与转录激活子3(STAT3)通路抑制骨细胞的凋亡对骨质疏松的治疗作用。方法选取SPF级健康雌性C57BL/6小鼠75只,随机分为正常对照组11只及造模组64只。造模组采用去势法建立骨质疏松症模型,正常对照组仅暴露双侧卵巢而不切除。将造模成功的小鼠随机分为模型组、补肾活血方低、中、高剂量组及阳性对照组,各12只。模型组和正常对照组分别灌胃给予蒸馏水5 mL·kg^-1,1次/d;补肾活血方低、中、高剂量组分别灌胃给予1.79、3.57、7.14 g·mL^-1补肾活血方药液5 mL·kg^-1,1次/d;阳性对照组灌胃给予0.14 mg·mL^-1尼尔雌醇混悬液5 mL·kg^-1,1次/d。各组小鼠均治疗12周。检测比较各组骨形态参数,骨细胞凋亡指数(AI),以及骨组织B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Janus激酶2(JAK2)、STAT3表达水平。结果与模型组比较,各组小鼠骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)及骨密度(BMD)值较高,骨组织Bcl-2蛋白表达水平较高,且补肾活血方低剂量组<补肾活血方中剂量组<补肾活血方高剂量组和阳性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,各组小鼠骨组织AI较低,骨组织Bax蛋白表达水平较低,骨组织JAK2、STAT3表达水平较低,且补肾活血方低剂量组>补肾活血方中剂量组>补肾活血方高剂量组和阳性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论补肾活血方能剂量依赖性的增加骨质疏松小鼠骨密度,增加骨小梁厚度和数量,抑制骨细胞凋亡,其作用可能与抑制STAT3信号通路,调节凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达有关。