miRNA-21对乳腺癌细胞放射敏感性的影响及其机制

目的：观察miRNA-21对乳腺癌细胞放射敏感性的影响,并初步探讨其作用机制。方法：乳腺癌T47D和MDA-MB-361细胞分别给予0.0、2.5和5.0 Gy γ射线照射,CCK8法检测细胞存活率,流式细胞术分析细胞周期进程,实时定量PCR法检测72 h内细胞中miRNA-21表达水平。T47D和MDA-MB-361细胞分别转染anti-miRNA-21序列（anti-miRNA-21组）和阴性对照序列（阴性对照组）,并设置未转染细胞为空白对照组,实时定量PCR法检测各组细胞中miRNA-21表达水平;经0.0和5.0 Gy γ射线照射后,CCK8法检测细胞存活率,流式细胞术分析细胞周期进程。结果：经5.0 Gy γ射线照射后,T47D细胞存活率明显高于MDA-MB-361细胞（P<0.05）;与0.0 Gy照射组比较,5.0 Gy照射组T47D和MDA-MB-361细胞G₂/M期细胞百分率均明显升高（P<0.05）,miRNA-21表达水平均明显升高（P<0.05）。与空白对照组比较,anti-miRNA-21组T47D和MDA-MB-361细胞中miRNA-21表达水平均明显降低（P<0.05或P<0.01）;给予5.0 Gy γ射线照射后,anti-miRNA-21组T47D和MDA-MB-361细胞存活率均明显降低（P<0.05或P<0.01）,T47D细胞G₂/M期细胞百分率明显降低（P<0.05）,而subG₁期细胞百分率明显升高（P<0.05）。结论：miRNA-21表达下调能够增强乳腺癌细胞的放射敏感性,其机制可能与抑制细胞周期G₂/M期阻滞有关。     

利用RNAi技术抑制Bcl 2基因表达增强肺腺癌A549细胞放射敏感性

目的利用RNAi技术抑制Bcl 2基因的表达,观察其对肺腺癌A549细胞凋亡和放射敏感性变化的影响。方法构建Bcl 2基因的干扰质粒pBcl 2 siRNA,稳定转染人肺腺癌A549细胞,同时设立转染无意义链组、空载体组和未转染组。采用Real time RT PCR和Western blot方法, 观察Bcl 2基因在mRNA和蛋白水平表达的变化。采用流式细胞术和克隆形成方法,检测RNA干扰对A549细胞放射敏感性的影响。结果成功构建bcl 2 siRNA质粒,转染A549细胞,获得稳定转染细胞株A549/Bcl2 Ins;Bcl 2mRNA、 Bcl 2蛋白表达明显降低;A549/Bcl2 Ins凋亡率［（10.11±0.92）%］明显高于对照组,6Gy X线照射后凋亡率［（28.81±1.10）%］明显高于对照组及未照射组;A549/Bcl2 Ins的D0和Dq值分别为1.399和1.298,明显低于转染无意义序列细胞株A549/Bcl2 Neg(1.695和2.480)、转染空载体细胞株A549/SD (1.706和2.227)和空白对照细胞A549(1.816和2.777)。结论RNAi技术可以有效抑制肺腺癌A549细胞Bcl 2基因的表达,增强A549细胞对X线的放射敏感性。     

BRCA1基因对不同肺癌细胞放射治疗敏感性的影响

目的探讨乳腺癌和卵巢癌易感基因BRCA1对不同肺癌放射治疗敏感性的影响。方法采用脂质转染方法将pcDNA3-BRCA1表达质粒转染到人肺腺癌细胞获得BRCA1高表达转染细胞,将BRCA1 siRNA转染到7种人肺腺癌细胞获得BRCA1基因沉默的转染细胞;采用Western blot方法检测BRCA1蛋白表达水平的变化;γ射线照射后,采用细胞克隆形成方法检测BRCA1高表达对两种肺癌细胞放射敏感性的影响。结果不同肺癌细胞的放射治疗敏感性与其所含的BRCA1表达水平成负相关。与＂空＂pcDNA3质粒细胞和无转染母细胞的对照组相比,提高BRCA1表达水平可导致肺癌细胞对放射治疗的敏感性明显下降（P〈0.05）。BRCA1诱导的细胞耐辐射现象可以在A-549和HTB58两种肺癌细胞系观察到。而转染BRCA1 siRNA的NIH-H2170肺癌细胞导致BRCA1基因沉默的转染细胞则放射治疗敏感性明显增加（P〈0.05）。结论该研究首次发现,BRCA1表达水平与肺癌细胞的放射敏感性有着密切的关系,并首次证实改变BRCA1的表达水平可以明显影响肺癌细胞的放射治疗敏感性。     

骨桥蛋白基因沉默对乳腺癌细胞HIF-1和VEGF表达及其放疗敏感性影响的探讨

[摘要]目的 探讨siRNA转染乳腺癌细胞MDA-MB-231抑制骨桥蛋白(OPN)表达对HIF-1和VEGF表达及其放疗敏感性的影响。方法 采用重组OPN mRNA干扰质粒转染MDA-MB-231细胞,将新建的OPN沉默细胞株命名为MDA-MB-343进行乏氧和放射处理。RT-PCR、蛋白质印迹法从mRNA和蛋白水平检测乳腺癌细胞OPN表达量的变化及其对HIF-1和 VEGF表达的影响。侵袭试验和划痕试验检测OPN下调对细胞侵袭和迁移的影响。流式细胞仪检测照射后细胞凋亡率。细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测照射后细胞衰老进程。克隆形成试验检测细胞对放射线的敏感性。 结果 与MDA-MB-231细胞相比,转染细胞株MDA-MB-343 OPN mRNA和蛋白的表达均显著下调,乏氧处理后对照组OPN的表达增加,转染组受到抑制。放疗对转染组蛋白表达的影响无统计学意义。转染组经乏氧处理后与放疗抗拒相关的HIF-1和VEGF的表达均显著下调。细胞凋亡率转染组由3.61%提高到4.91%,2Gy照射后对照组和转染组对应的凋亡率分别为13.9%和24.07%。Transwell试验穿过聚碳酸酯膜的细胞MDA-MB-231、阴性对照和干扰组分别为46.20±5.13/HP 、47.64±4.61/HP、 35.86±4.79/HP,侵袭力降至75.27%。2Gy照射后分别为38.93±4.91/HP ,40.87±4.57/HP,21.87±5.06/HP,侵袭力进一步降至45.9%。衰老实验结果显示转染组放疗后细胞的衰老进程明显加剧。转染组细胞克隆存活率为对照组的39%（p=0.000）。2Gy照射后对照组和转染组的克隆存活分数分别为0.6和0.45。对应的1%克隆存活剂量分别为5.60Gy和4.94Gy。 结论 乏氧上调乳腺癌细胞OPN的表达。OPN RNA干扰在常氧和乏氧状态下均有效抑制MDA-MB-231细胞OPN的表达,从而抑制了HIF-1和VEGF的表达,同时加速了细胞凋亡,提高了MDA-MB-231细胞的放射敏感性。OPN有望成为增强乳腺癌放射治疗效果的靶点。     

转染节律基因mPeriod2对小鼠正常细胞放射损伤的影响

目的评价mPeriod2（mPer2）基因转染后过表达对小鼠肺成纤维细胞NIH3T3放射损伤的影响。方法采用脂质体介导法将roPer2基因转染人NIH3T3细胞中，以空质粒pcDNA3.1和空白组为对照，采用流式细胞术检测mPer2基因在NIH3T3细胞中的表达，经过^60Co—γ射线放射处理后，用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期分布，采用平板克隆形成试验检测细胞增殖情况。结果射线照射后，与pcDNA3．1空质粒组和空白对照组相比，pcDNA3．1-mPer2转染组凋亡率下降，S期细胞所占比例增高，克隆形成率明显增高。结论节律基因mPer2过表达会使γ射线照射后的NIH3T3细胞凋亡下降，增殖加快，减弱了细胞的放射损伤。     

对乙酰氨基酚联合外照射对脑胶质瘤细胞照射后代增殖的影响

目的 观察对乙酰氨基酚联合外照射对脑胶质瘤SHG-44细胞株照射存活后代增殖的影响,探讨对乙酰氨基酚作为复发性恶性脑胶质瘤放射治疗增敏剂的可能性.方法 培养人脑胶质瘤SHG-44细胞株经6 MV X线DT10 Gy照射后的存活后代细胞(SHG-44-10细胞),测定其群体倍增时间;在培养SHG-44-10细胞中加入对乙酰氨基酚,进行集落形成实验和流式细胞仪检测,分析其放射敏感性和细胞周期的变化.结果 与SHG-44细胞相比较,SHG-44照射后代细胞克隆形成率降低,倍增时间延长,对放射的敏感性明显降低.而加入对乙酰氨基酚培养后,SHG-44照射后代细胞对放射的敏感性可增加.SHG-44照射后代细胞再次照射后12 h,G2/M相细胞比例增高,24 h比例下降,而加入对乙酰氨基酚培养后G2/M相细胞12 h、24 h均维持较高的比例.结论 (1)SHG-44细胞照射后存活后代细胞增殖延缓,放射敏感性下降.(2)小剂量对乙酰氨基酚可提高SHG-44细胞照射后存活后代细胞的放射敏感性,其可能的机制为诱导细胞阻滞在对放射敏感的G2/M期并能诱导它的凋亡.(3)对乙酰氨基酚有可能成为治疗复发性脑胶质瘤的放射增敏剂.     

抑制 DBC2 基因启动子甲基化促进乳腺癌细胞凋亡的研究

研究抑癌基因 DBC2 在乳腺癌的表达与甲基化状态之间的联系,及其对乳腺癌细胞系T-47D 细胞增殖和凋亡的影响。方法 体外培养 3 种乳腺癌细胞株（T-47D、MCF-7、MDA-MB-23）和正常乳腺细胞株（MCF-10）,检测 4 种细胞中 DBC2 基因的表达及其启动子区甲基化状况;5-Aza-CdR 处理T-47D 细胞后,检测 5-Aza-CdR 对 T-47D 细胞 DBC2 启动子甲基化状态和其表达的影响,并通过 MTT 和Annexin-V/PI 双染法分别检测处理前后 T-47D 细胞增殖和凋亡的变化。结果DBC 2 在 T-47D 细胞表达缺失,乳腺癌细胞DBC 2 启动子发生甲基化;5-Aza-CdR 成功逆转了 T-47D 细胞DBC 2 的甲基化状态,并使DBC2 mRNA 表达恢复（ <0.05）;不同浓度的 5-Aza-CdR 处理 T-47D 细胞后,T-47D 细胞增殖下降（ <0.05）,凋亡率增加（ <0.05）。结论 DBC2 启动子甲基化导致 T-47D 细胞 DBC2 表达沉默,激活DBC2 表达可抑制 T-47D 细胞增殖并促进其凋亡。     

干扰RNA抑制EGFR对乳腺癌细胞放射敏感性的影响

目的采用干扰RNA技术(small interfering RNA,siRNA)抑制SKBR-3,即HER-2(+++),EGFR(+++)乳腺癌细胞EGFR的表达,研究EGFR受抑制后HER-2过表达细胞对X线敏感性的变化.方法质粒转染及鉴定:将细胞随机分为实验组、阴性对照组和空白组,重组质粒EGFR-siRNA和Neg-siRNA分别被转染入实验组及阴性对照组;Western blot检测各组细胞EGFR的表达水平;6MV射线照射4 Gy后0,24 h,48 h收集细胞,流式细胞术检测细胞凋亡率;克隆形成实验检测细胞D0,SF2和α等值.结果质粒转染SKBR-3细胞,Western分析表明转染EGFR-siRNA的阳性细胞株在蛋白质水平受到明显抑制;X线照射24 h及48 h后,EGFR表达受抑制细胞凋亡率均高于转染阴性质粒组和空白对照组(P分别为0.045及0.039);EGFR受抑制的细胞D0值和SF2值分别为1.218和0.376,α值为0.335.结论运用RNAi技术可以有效抑制EGFR的表达从而提高SKBR-3细胞对X线的放射敏感性,EGFR是一个较理想的肿瘤分子治疗靶点.     

BTG1在HK-2和786-O细胞株中的表达及其对细胞周期和细胞凋亡的影响

目的：探讨B细胞易位基因1（ BTG1）在人肾小管上皮细胞株（ HK-2）和肾透明细胞腺癌细胞株（786-O）中的表达及BTG1基因对HK-2和786-O细胞周期、细胞凋亡的影响。方法：采用Western blotting方法检测BTG1蛋白在HK-2、786-O细胞株中的表达,构建BTG1表达质粒转染786-O细胞,合成BTG1干扰RNA转染HK-2细胞,通过流式细胞仪（ FACS）观察BTG1对HK-2、786-O细胞周期和细胞凋亡的影响。结果：Western blotting检测显示,BTG1蛋白在HK-2中的表达高于786-O。786-O中高表达BTG1蛋白能够促进其凋亡,增加其G0/G1期比率;HK-2中低表达BTG1蛋白能够抑制其凋亡,减少其G0/G1期比率。结论：BTG1可能通过对细胞凋亡及细胞周期的调控抑制肾细胞癌的生长。     

肝细胞癌中 BTG2基因的表达及其对肝细胞癌细胞增殖和凋亡影响的研究

目的：研究肝细胞癌中BTG2基因的表达以及BTG2基因对肝细胞癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响。方法荧光定量PCR测定47例肝细胞癌组织中BTG2基因的表达情况。构建表达载体pcDNA-BTG2,转染HepG2细胞。转染后,蛋白质印迹法检测转染后BTG2蛋白的表达,MTT法测定细胞生长抑制率,双标流式细胞法检测细胞凋亡率。结果与癌旁组织相比,BTG2 mRNA在肝细胞癌组织中表达明显下调（P＜0．01）。且BTG2的表达与肝细胞癌的分级相关,随着分化程度的升高呈逐渐增加的趋势,但与肝细胞癌的分期及淋巴结转移、远处转移无关。转染表达载体pcDNA-BTG2能够显著上调HepG2细胞中BTG2蛋白的表达,同时,细胞生长抑制率及凋亡率明显增加（ P＜0．01）。结论在肝细胞癌中BTG2基因表达下调,其表达上调能够抑制肝癌细胞增殖并促进凋亡。     

PRL促进乳腺癌细胞增殖及与microRNA表达谱变化的相关性研究

目的:探讨基于催乳素(prolactin,PRL)反应的人乳腺癌细胞microRNA (miRNA)表达谱变化,以了解其在乳腺癌发生和发展中的潜在作用?方法:人重组PRL处理高表达催乳素受体(PRLR)的人乳腺癌T-47D细胞系,MTT法检测细胞增殖能力变化,流式细胞术检测细胞周期和凋亡变化情况?利用Solexa高通量测序技术检测PRL处理组和未处理组的T-47D细胞 miRNAs表达谱,荧光定量PCR法进行初步验证,同时进行相关的生物信息学分析?结果:PRL作用于T-47D细胞后,MTT结果显示细胞增殖能力增强,细胞周期检测结果表明PRL处理后,G1期的细胞比例减少,S期的细胞比例升高,而G2/M期没有变化?细胞凋亡分析结果则显示PRL可抑制细胞凋亡,导致细胞凋亡率下降?通过Solexa高通量测序技术成功检测了PRL处理和未处理组的人乳腺癌T-47D细胞miRNA表达谱,两组中分别检测到821个和798个miRNAs成熟体,其中428个共表达,42个为两组间明显差异表达?选取的4个miRNAs分子经荧光定量PCR法证实其细胞内的表达与测序结果一致?两组miRNA表达谱中同时也检测到86个和115个novel miRNAs 成熟体,其中46个novel miRNAs在两组细胞中共表达?结论:在初期实验明确PRL对人乳腺癌T-47D细胞产生促增殖作用的基础上,利用Solexa高通量测序技术检测两类T-47D细胞miRNAs表达谱,获得了一系列与PRLR信号通路高度相关的miRNAs分子,为进一步研究miRNAs分子在人乳腺癌发生发展中的作用奠定重要的研究基础?     

谷胱甘肽S转移酶π高水平表达抑制人类宫颈癌HeLa细胞的生长、转移和浸润

目的研究胎盘型谷胱甘肽S转移酶π（GSTπ）在宫颈癌细胞中的高表达对其生物学特性的影响。方法通过脂质体介导转染,在人类宫颈癌HeLa细胞建立GSTπ基因高表达稳定转染株;采用细胞计数和MTT法测定细胞的生长;采用划痕法和Boyden小室法检查细胞的转移、浸润能力;采用RT-PCR和Western blot技术检测宫颈癌细胞中相关mRNA和蛋白的表达水平。结果成功构建了GSTπ高表达和空质粒转染的HeLa细胞株;GSTπ基因高表达明显地抑制HeLa细胞的生长、转移和浸润。结论GSTπ可以明显抑制HeLa细胞的生长、转移和浸润,为GSTπ作为一种新的抑癌基因提供了临床前实验数据和依据。     

外源性PTEN基因诱导人乳腺癌MDA468细胞凋亡

目的 研究外源性PTEN基因依赖其磷酸酶活性诱导人乳腺癌MDA468细胞凋亡。方法 应用分子克隆技术构建重组质粒pcDNA3．1-PTEN,以脂质体转染法转染人乳腺癌细胞株MDA468,对照组为pcDNA3．1(-)空载体质粒转染组和未转染组。应用RT-PCR、Western印迹法分析目的基因的表达;在表皮生长因子(EGF)的诱导下,采用Western印迹方法检测转染后磷酸化蛋白激酶B(PKB／Akt)的表达及细胞在黏附和失黏附状态下的黏着斑激酶的表达;膜联蛋白V-FITC和P1双染流式细胞术检测细胞凋亡。结果 RT-PCR、Western印迹显示pcDNA3．1-PTEN转染组有PTEN mRNA及PTEN蛋白表达,且在EGF的诱导下,p-Akt及p-FAK蛋白表达下调。流式细胞术则显示其凋亡率达21．68％。结论 外源性PTEN基因依赖其磷酸酶活性可诱导人乳腺癌MDA468细胞凋亡。     

山慈菇水煎剂对人乳腺癌T-47D细胞增殖和迁移的影响

目的:探讨山慈菇水煎剂对人乳腺癌T-47D细胞增殖、迁移的影响。方法:利用细胞培养技术对人乳腺癌T-47D细胞进行培养;利用MTT法比较不同浓度山慈菇水煎剂组和对照组对T-47D细胞生长增殖情况的影响;利用细胞划痕实验,检测不同浓度的山慈菇水煎剂对T-47D细胞迁移的影响。结果:不同浓度的山慈菇水煎剂(50 g·L~(-1)、100 g·L~(-1)、200 g·L~(-1),400 g·L~(-1)、600 g·L~(-1)、800 g·L~(-1))对T-47D细胞的生长抑制率分别为-0.60%、-17.10%、-0.60%、65.08%、81.15%、82.80%,400~800 g·L~(-1)质量浓度山慈菇水煎剂对乳腺癌T-47D细胞的增殖有明显抑制作用;划痕实验结果显示200 g·L~(-1)、300g·L~(-1)山慈菇水煎剂作用24h和48h后,与对照组比较,乳腺癌T-47D细胞的划痕距离较大,划痕未见明显愈合,差异有统计学意义(P0.05)。结论:一定浓度的山慈菇水煎剂对T-47D细胞生长增殖具有抑制作用,低浓度(200 g·L~(-1))的山慈菇水煎剂对T-47D细胞的生长增殖无影响,即无细胞毒性;高浓度(200 g·L~(-1))的山慈菇水煎剂对乳腺癌T-47D的增殖有明显的抑制作用;一定浓度的山慈菇水煎剂可以抑制T-47D细胞的迁移运动。     

DHRS7对人乳腺癌细胞MCF-7细胞周期的影响及其在乳腺癌组织中的表达

［摘 要］目的：探究 DHRS7基因过表达和DHRS7特异性短发夹RNA(shRNA)重组质粒对人乳腺癌细胞MCF-7细胞周期的影响及DHRS7与乳腺癌浸润癌的关系,阐明DHRS7在乳腺癌发生、发展中的作用。方法：利用RT-PCR技术将DHRS7基因全长克隆入真核表达载体pcDNA3.1( + )质粒中,构建pcDNA3.1-DHRS7重组真核表达质粒。实验分为pcDNA3.1-DHRS7组、阴性对照组(pcDNA3.1组)、空白对照组和DHRS7-shRNA-pGenesil组,用Fugene HD转染试剂将各种质粒转染MCF-7细胞,采用RT-PCR和Western blotting法检测各组MCF-7细胞中DHRS7的表达情况,流式细胞术分析细胞周期变化,免疫组织化学SP法检测乳腺原位癌和乳腺浸润癌组织中DHRS7蛋白的表达情况。结果：成功构建pcDNA3.1-DHRS7重组表达质粒。PCR和Western blotting结果显示,pcRNA-DHRS7组蛋白的表达量高于空白对照组（P<0.05）,DHRS7-shRNA-pGenesil组蛋白的表达量低于空白对照组,差异均有统计学意义（P<0.05）。流式细胞术显示,DHRS7表达上调使MCF-7细胞S期细胞增多（P<0.05）,DHRS7的表达下调使处于G2期的细胞增多（P<0.05）。免疫组织化学染色显示,DHRS7蛋白在原位癌中高表达,阳性表达率为100%（37/37）;在乳腺浸润癌的表达明显降低,阳性率为18.9%（7/37）,两者比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论：DHRS7基因参与了MCF-7细胞细胞周期的调控过程,可以抑制细胞增殖,DHRS7蛋白的表达丢失可能促进乳腺癌浸润。     

三苯氧胺诱导乳腺癌细胞凋亡过程中ERα和SMRT的表达变化

目的：观察三苯氧胺（tamoxifen，TAM）作用前后乳腺癌细胞株T-47D和MDA—MB-231中雌激素受体α（estrogenreceptor alpha，ERα）、共抑制因子SMRT的表达变化，寻找更佳的指导乳腺癌内分泌治疗指标。方法：采用四氮甲基唑蓝（MTT）观察乳腺癌细胞T-47D和MDA-MB-231的生存状况，以筛选最佳的药物作用浓度和时间。流式细胞仪法（FCM法）检测细胞凋亡。细胞免疫组化法及Westernblot法观察TAM作用前后细胞中ER-α、SMRT的表达情况。结果：MTT法测得经0．10mmoI／LTAM作用48h后T-47D和MDA-MB-231细胞增殖率下降，与对照组相比有显著性差异（P〈0．05）。特别对T-47D效果更强。FCM法检测两种细胞均出现低于G，期DNA含量的亚二倍体凋亡峰，与MDA-MB-231相比，T-47D细胞株凋亡率更高。细胞免疫组化法及Westernblot法检测T-47D细胞，ERα、SMRT表达阳性，ERα阳性细胞比例减少，SMRT阳性细胞比例增多；MDA-MB-231细胞SMRT阴性，出现少量ER阳性及SMRT阳性细胞。结论：TAM可以通过诱导细胞凋亡途径抑制乳腺癌细胞增殖，对ERα阳性细胞T47D效果更为显著。     

Chk1和Chk2高表达人胃癌BGC823细胞的建立与鉴定

细胞周期检测点Chkl和Chk2在参与G2/M期起着重要作用,本研究构建Chk1/2的真核表达载体和建立高表达Chk1/2基因人胃癌BGC823细胞,进一步证明Chk1/2高表达对BGC823细胞G2/M期的影响。根据NCBI GenBank Chk1/2基因全序列,在cDNA两端各设计一条对应引物,并引入各自的酶切位点。从人胃癌细胞中提取mRNA作为模板合成Chk1/2 cDNA第一链,并扩增目的基因全表达序列片断,双酶切后定向克隆至pcDNA3.1真核表达载体,经氨苄青霉素筛选阳性重组质粒,菌液PCR及测序对重组质粒进行鉴定。用脂质体将重组质粒转染BGC823细胞,经G418筛选后,RT-PCR及Western blot检测表达产物。结果显示,菌落特异性PCR表明克隆的基因片断分别为1.4 kb和1.6 kb,经测序与NCBIBLAST分析证实为Chk1和Chk2基因。稳定转染空载体pcDNA3.1 的细胞克隆株和稳定转染重组质粒的BGC823细胞,经RT-PCR及Western blot鉴定,Chk1/2在BGC823细胞中的表达较对照组与空载体组明显增加(P<0.05)。流式细胞术检测显示,Chk1转染组G2/M细胞较对照组与空载体组明显增加 (P<0.05),而Chk2转染组G2/M细胞无明显差异 (P>0.05)。上述结果表明,成功构建pcDNA3.1/Chk1与pcDNA3.1/Chk2真核表达载体和Chk1与Chk2高表达的BGC823细胞,Chk1高表达可阻滞BGC823细胞于G2/M。     

Egr1介导的人截短型凋亡诱导因子表达载体的构建及其在乳腺癌MCF-7细胞中的辐射诱导表达规律

目的: 克隆人截短型凋亡诱导因子（AIF）cDNA序列,并构建早期生长反应因子1（Egr1）介导的重组表达载体pcDNA3.1-Egr1-AIFΔ1-480（pEgr1-AIFΔ1-480）,观察其在人乳腺癌MCF-7细胞中的辐射诱导表达规律。方法: 以人白血病Jurkat细胞mRNA为模板,RT-PCR法扩增获得人AIFΔ1-480,与pMD18T载体连接后行全自动测序,限制性内切酶切取pMD19T-Egr1中Egr1片段,并利用基因重组技术构建Egr1启动子介导的人AIFΔ1-480表达质粒pEgr1-AIFΔ1-480。实验分为对照组、 pcDNA3.1组、pAIFΔ1-480组和 pEgr1-AIFΔ1-480组。各组质粒分别转染MCF-7细胞,Western blotting法检测AIF及AIFΔ1-480蛋白的辐射诱导表达时程-效应（2.0 Gy照射后0、2、4、12、24和48 h）和剂量-效应（0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 Gy照射后24 h）规律。结果: 经测序证实,RT-PCR获得的人AIFΔ1-480基因与预期一致,pEgr1-AIFΔ1-480经PCR和酶切鉴定完全正确;各组MCF-7细胞经2.0 Gy照射后0～48 h,AIF蛋白在各组中均有表达,从4 h开始显著增加,4、12、24和48 h各组AIF表达与0 h组比较差异有统计学意义（P<0.05）,48 h达到最大;而在pAIFΔ1-480和pEgr1-AIFΔ1-480组,AIFΔ1-480从2 h开始表达,4、12、28和48 h各组AIFΔ1-480表达与2 h比较差异有统计学意义（P<0.05）,24 h达到峰值;而且24和48 h时pEgr1-AIFΔ1-480组AIFΔ1-480表达较pAIFΔ1-480组显著增加（P<0.05）。各组MCF-7细胞经0～5.0 Gy照射后24 h,各组均有AIF蛋白表达,而AIFΔ1-480只在pAIFΔ1-480和pEgr1-AIFΔ1-480组表达,二者均随着剂量增加而增加,0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 Gy照射后各组AIF表达与0 Gy比较差异有统计学意义（P<0.05）,在5.0 Gy照射时达到最大,相同照射剂量pEgr1-AIFΔ1-480组AIFΔ1-480表达高于pAIFΔ1-480组。结论: 成功构建Egr1介导的人截短型AIF重组表达载体pEgr1-AIFΔ1-480, AIF和AIFΔ1-480蛋白在MCF-7细胞中的表达随照射时间延长和照射剂量增加而增加。