BDNF的酵母双杂交诱饵载体的构建和初步鉴定

目的：构建和转化脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的酵母诱饵重组质粒,为通过酵母双杂交研究BDNF的功能及作用机制奠定基础。方法：用PCR扩增BDNF基因cDNA中编码完整开放阅读框的基因片段;将该基因片段与plexA载体定向重组;用酶切和测序鉴定重组质粒;将核苷酸序列正确的重组质粒转化人EGY48(p8op-LacZ)酵母菌株。结果：成功构建pLexA-BDNF重组质粒。转化有重组质粒和pLexA空载体的两种EGY48(p8Op—LacZ)酵母都能在SD／Gal／Raf／-His／-Ura培养基中长成白色菌落(同时,转化pLexA-pos阳性对照质粒的酵母菌在相同条件下长成蓝色菌落),但都不能在SD／-His／-Leu／-Ura培养基中生长,在SD／-His／-Ura液中培养16h后,OD_(600)均值均为0.9±0.1。这表明重组质粒表达的融合蛋白没有激活LEU2和lacZ酵母报告基因表达的活性,电没有酵母毒性作用。结论：构建的诱饵重组质粒可以用于下一阶段的人胎脑cDNA文库筛选。     

重组人白介素1受体Ⅰ型细胞外基因在毕赤酵母的表达

目的 构建白介素1受体Ⅰ型细胞外基因(可溶性白介素1受体Ⅰ型,sIL-1R Ⅰ)的pPICZαA-sIL-1R Ⅰ重组表达载体,利用毕赤酵母表达技术表达sIL-IR Ⅰ蛋向.方法 采用RT-PCR技术扩增基因sIL-1R Ⅰ.经酶切连接构建重组质粒pPICZαA-sIL-IR Ⅰ,转化E.coli Stb13;阳性克隆经测序成功后,把pPICZαA-sIL-IR Ⅰ重组质粒电转入毕赤酵母菌株GS115,PCR对阳性克隆进行鉴定,以及对GS115转化子表型筛选.确定表型后,对重组菌株进行甲醇诱导蛋白表达.提取菌体蛋白和上清液进行Western blotting检测以鉴定蛋白表达属于菌内表达还是分泌表达.结果 pPICZαA-sIL-IR Ⅰ重组质粒构建成功;pPICZαA-sIL-IR Ⅰ成功电转入酵母菌GS115:转化子表型筛选结果为甲醇诱导缓慢型Muts:对培养上清和菌体蛋白进行Western blotting检测结果:上清没有检测到蛋白,在菌体内检测到蛋白.结论 成功运用毕赤酵母表达体系表达sIL-1R Ⅰ蛋白,为sIL-IR Ⅰ的研究和应用提供实验基础.     

高通量端粒酶抑制剂筛选模型融合表达载体的构建及转化

目的 构建含不同结构域的人端粒酶逆转录酶(hTERT)酵母三杂交系统融合蛋白表达载体并转化酵母.方法 采用PCR法从pCLXSN-hTERT质粒中提取不同的hTERT cDNA片段,纯化分离定向克隆到pYESTrp3质粒,构建包含不同hTERT蛋白结构域的编码序列的重组质粒,转化大肠杆菌,经PCR、酶切、测序鉴定,将阳性重组质粒转化酵母菌,进行毒性和自激活检验.结果 经过测序验证,重组融合蛋白表达载体pYESTrp3-hTERT构建成功,转化酵母无毒性和自激活性.结论 成功构建能用于酵母三杂交系统的融合蛋白表达载体,可于酵母三杂交系统筛选端粒酶抑制剂及hTERT和hTR间的相互作用.     

细菌-酵母穿梭表达质粒pGBKT7-MIF的构建及转化

【目的】构建并转化能在酵母菌AH10 9中表达巨噬细胞游走抑制因子 (MIF)的穿梭表达质粒pGBKT7 MIF。【方法】用RT PCR方法从人T淋巴细胞中扩增MIF基因全外显子片段 ,并定向克隆入细菌 酵母穿梭表达质粒 pGBKT7中 ;用PEG/LiAC法将pGBKT7 MIF转化感受态酵母菌AH10 9。提取转化酵母菌的质粒DNA ,转化大肠杆菌并行质粒的酶切鉴定。【结果】扩增出人MIFcDNA片段 ,限制性内切酶酶切和DNA测序证实获得正确的重组质粒 pGBKT7 MIF ;获得可在色氨酸缺陷培养基 (SD/ trp)上生长含 pGBKT7 MIF的酵母菌克隆。酶切鉴定表明pGBKT7 MIF已转化入酵母菌AH10 9。【结论】成功构建穿梭质粒 pGBKT7 MIF ,并转化入酵母菌AH10 9。     

利用酵母双杂交系统筛选与FXR1P相互作用的蛋白

目的筛选FXR1P相互作用蛋白,探讨FXR1P生物学功能。方法应用酵母双杂交技术,构建诱饵表达载体pGBKT7/FXR1,转化酵母菌AH109,与转化了人胎脑cDNA文库的酵母菌Y187交配筛选阳性克隆并测序。结果重组表达载体pGBKT7/FXR1构建成功;从人胎脑cDNA文库中筛选出5个与FXR1P结合的蛋白基因,分别与5种已知的编码蛋白基因序列同源：胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸合成酶（CMAS）、铁蛋白重链多肽1（FTH1）、高尔基体自身抗原golgina亚类4（GOLGA4）、17-β羟类固醇脱氢酶1（HSD17B1）、绒毛膜生长催乳激素1（CSH1）。结论为进一步研究FXR1P的功能及脆性X综合征发病机制提供新的线索。     

Lactoferricin B基因与几种变异克隆的构建及其在酿酒酵母中的表达与鉴定

目的 构建牛乳铁多肽(Lactoferricin B)的真核表达质粒pYES2/Lactoferricin B,实现其在酿酒酵母S.cerevisiae中的表达,并初步检测其不同变异的体外抗菌活性.方法 通过分别合成Lactoferricin B基因两条单链的部分序列,让其互为模板、引物进行PCR扩增,得到Lactoferricin B与3种变异的基因序列.将它们克隆到穿梭质粒pYES2中,构建pYES2/Lactoferricin B 及3种变异基因重组质粒,转化到大肠杆菌Top10中,让其大量增殖.提取重组质粒经纯化后将其转化到S.cerevisiae中,通过营养缺陷型筛选获得重组酵母菌并通过半乳糖诱导使其表达目的蛋白.经离子交换柱纯化收集目的蛋白后,通过体外抑菌实验比较Lactoferricin B及3种变异重组蛋白的抗菌活性.结果 经PCR扩增检验、DNA测序表明成功构建pYES2/Lactoferricin B与3种变异基因重组质粒.提取诱导后的蛋白进行SDS-PAGE电泳及质谱检测,证实目的蛋白的存在,相对分子质量约为3.4×103.在大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌的抑菌实验中观测到Lactoferricin B和A17-Lactoferricin B产生了抑菌圈.结论 成功构建pYES2/Lactoferricin B及变异基因重组质粒,该重组质粒能在S.cerevisiae中诱导表达目的蛋白,为进一步研究其生物功能及抗菌活性奠定了基础.     

同源重组构建表皮葡萄球菌附属基因调节子（agr）阴性突变株（摘要）

目的构建表皮葡萄球菌agr阴性突变株，以期得到除agr基因以外相同遗传背景的突变株与野生株。方法首先构建同源重组质粒pBT2-Δagr，后电传入金黄色葡萄球菌RN4220，再转入表皮葡萄球菌3298。通过pBT2载体对温度敏感的特点，含重组质粒的表皮葡萄球菌3298在40℃多次传代，最终筛选出agr阴性的突变株。结果同源重组质粒pBT2-Δagr通过酶切鉴定证明构建成功，     

细菌—酵母穿梭表达质粒pGBKT7—MIF的构建及转化

目的：构建并转化能在酵母菌AH109中表达巨噬细胞游走抑制因子（MIF）的穿梭表达质粒pGBKT7-MIF。方法：用RT-PCR方法从人T淋巴细胞中扩增MIF基因全外显子片段，并定向克隆人细菌-酵穿梭表达质粒pGBKT7中；用PEG/LiAC法将pGBKT7-MIF转化感受态酵母菌AH109。提取转化酵母菌的质粒DNA，转化大肠杆菌并行质粒的酶切鉴定。结果：扩增出人MIFcDNA片段，限制性内切酶酶切和DNA测序证实获得正确有重组质粒pGBKT7-MIF；获得可在色氮酸缺陷培养基（SD/-trp）上生长含pGBKT7-MIF的酵母菌克隆。酶切鉴定表明pGBKT7-MIF已转化入酵母菌AH109。结论：成功构建穿梭质粒pGBKT7-MIF，并转化入酵母菌AH109。     

信号标签诱变突变体文库穿梭质粒构建

目的建立信号标签诱变突变体穿梭质粒,为构建信号标签诱变突变体文库及病原微生物毒力基因筛选打下基础。方法通过PCR扩增信号标签(signature tags,STs)片段,导入载体pC6,构建重组质粒pC6RS,转化到大肠杆菌CC118中,提取重组质粒后转化到大肠杆菌S17-1中。结果经过PCR、核苷酸序列测定鉴定,成功地构建了pC6RS质粒。     

小鼠Dnd1酵母双杂交系统诱饵载体的构建及自身激活检测

目的:构建用于酵母双杂交系统的诱饵载体pDBLeu-Dnd1,并检测其是否有自身激活作用。方法:设计引物引入SalⅠ、NotⅠ酶切位点,使用PCR方法从质粒pcDNA3.1-Dnd1中扩增小鼠Dnd1基因的编码区序列,连至pMD18-T载体。酶切验证及测序正确后,用SalⅠ,NotⅠ内切酶分别消化pMD-T-Dnd1及pDBLeu载体而后构建诱饵载体pDBLeu-Dnd1,并检测其在G IBCO/BRL公司的酵母双杂交系统中的自身激活作用。结果:成功构建诱饵载体pDBLeu-Dnd1,并证明其在该系统中无自身激活作用。结论:pDBLeu-Dnd1可应用该酵母双杂交系统筛选与之相互作用的蛋白。     

人类TSLC1基因克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆人类TSLC1基因并构建其真核表达载体pcDNA3.1( )/TSLC1.方法:从正常皮肤组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增TSLC1基因全长cDNA,克隆入pMD18-T载体并转化大肠杆菌JM109,经PCR、酶切鉴定均为阳性的克隆,进行核苷酸测序分析,再将TSLC1基因定向克隆入pcDNA3.1( )载体中构建表达载体.结果:RT-PCR扩增后的产物在约1413 bp处出现明显的特异性条带,TSLC1基因的cDNA片段被成功插入真核表达载体pcDNA3.1( )质粒的多克隆位点,经鉴定与GenBank收录的TSLC1 cDNA 序列一致.结论:TSLC1基因的cDNA片段被成功克隆,为以后的研究奠定了基础.     

糖皮质激素受体结合域诱饵表达载体的构建及鉴定

目的构建糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR）结合域的诱饵表达载体。方法RT—PCR扩增GR结合域，克隆入pMDl8-T，测序正确后，再亚克隆入诱饵载体pGBKT7中，再把构建好的诱饵载体pGBKT7．GR转化到酵母AHl09细胞中，并用Western blot分析诱饵蛋白的表达情况，同时检测诱饵蛋白的毒性和自激活作用。结果成功扩增了GR结合域，并分别成功克隆到pMDl8-T和pGBKT7中，测序结果正确。诱饵载体成功转化到酵母AHl09细胞中，无毒性和自激活作用，Western blot分析结果也证实了酵母细胞高表达诱饵蛋白。结论成功构建了GR结合域的酵母诱饵表达载体。     

先天性智力低下儿童脆性X综合征的基因分析

目的探讨先天性智力低下与脆性X综合征智力低下基因1(Fragile X mental retardation gene 1,FMR-1)关系.方法应用复式PCR一次性扩增FMR-1基因的(CGG)n的重复区,检测CGG重复序列的大小,分析FMR-1基因状态:正常、前突变、全突变,对脆性X综合征可疑患儿进行快速筛查.结果在253例不明原因的先天性智力低下患儿中,检出脆性X综合征携带者(FMR-1基因前突变者)14例(2男12女),脆性X综合征患者(FMR-1基因全突变者)9例,阳性率达9.09%.结论脆性X综合征是引起儿童先天性智力低下的重要病因之一,应对不明原因的智力低下儿童进行大面积筛查,尤其是对有智力低下家族史的孕妇进行产前筛查,防止患儿出生.     

H3N2流感病毒非结构蛋白-1真核表达载体的构建与表达及其对293T细胞增殖的影响

目的:构建甲型H3N2流感病毒非结构蛋白-1( nonstructal-1,NS1)真核表达载体并表达其编码蛋白;探讨NS1对细胞增殖的影响?方法:从江苏省甲型H3N2流感病毒毒株提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T Simple Vector中构建pMD18-T/NS1质粒,双酶切pMD18-T/NS1与pXJ40-HA后,构建真核表达载体pXJ40-HA-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过免疫印迹法鉴定NS1蛋白的表达?3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT]法检测NS1转染细胞后对细胞增殖的影响? 结果:经双酶切?测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功;免疫印迹法证实NS1蛋白的表达?MTT法证实转染NS1质粒后对细胞增殖有抑制作用?结论:成功克隆了NS1全长基因,构建了其真核表达载体,并初步验证了NS1蛋白过表达后能抑制细胞的增殖,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1的细胞模型和NS1蛋白对细胞增殖和凋亡作用机制的进一步研究提供了基础?     

HP450基因的克隆及其重组载体pMD18-HP450的构建与鉴定

目的构建HP450基因的克隆载体。方法用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术克隆HP450基因,T-A连接到pMD18-T载体。以菌液为模板做PCR、酶切和测序鉴定pMD18-HP450重组质粒载体。结果菌液PCR扩增出目的条带、重组体的酶切产物合理,测序显示目的基因与基因库中的H1基因100%同源。结论实现了HP450基因的克隆及其重组质粒载体pMD18-HP450的构建。     

人肥胖基因的克隆与原核表达载体的构建

目的：克隆人肥胖基因瘦素蛋白（leptin）编码区cDNA序列，并构建其原核表达载体。 方法：在人体脂肪组织中提取mRNA，利用RT-PCR扩增人肥胖基因，将其插入pMD18-T载体，经双酶切、鉴定后将肥胖基因片段亚克隆入pET-28a表达载体，提取质粒。将阳性重组质粒转化表达受体菌E.coliBL21(DE3)，经IPTG诱导肥胖基因表达产物,以聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测产物蛋白。 结果：经测序证实获得的肥胖基因序列与相关文献报道一致，其表达产物的相对分子质量约为20 000。 结论：利用pMD18-T克隆载体和pET-28a表达载体可以有效地在原核生物中表达重组人类瘦素蛋白。     

汉滩病毒西安分离株84FLi M片段的克隆

目的:克隆汉滩病毒84FLi株M片段的cDNA. 方法:提取病毒总RNA,反转录为cDNA模板,用高保真的Taq酶扩增出G1和G2两个糖蛋白编码的基因片段:84M2.0(1～2058)和84M1.6(1964～3616). 将这两个片段分别与T载体-pMD18-T连接,转化感受态大肠杆菌后获得两个分别为G1和G2编码的克隆pMD84M2.0和pMD84M1.6. 再利用酶切连接的方法获得M片段全序列的cDNA克隆. 结果:获得两个分别为G1和G2糖蛋白序列编码的克隆,进而酶切组装为含有M片段全序列的cDNA克隆. 结论:获得了84FLi株M片段全序列的cDNA克隆.     

人IL-18基因真核表达载体的构建

目的:通过克隆人的Interleukin-18基因,构建Interleukin-18基因的哺乳动物细胞真核表达载体。方法:把人基因组DNA通过PCR获得Interleukin-18,克隆载体pMD18-T/Interleukin-18,并将其转化到大肠杆菌里,最后进行重组真核表达载体pCDNA3.1/Interleukin-18的构建和鉴定。结果:以人总DNA为模板扩增出580 bp左右的特异性条带,测序结果与GeneBank测序结果相比,除两个碱基外,其余的完全一致,翻译成的氨基酸序列相同。对重组质粒pCDNA3.1/Interleukin-18进行双酶切鉴定并测序,结果也完全一致。结论:重组质粒pCDNA3.1/Interleukin-18由真核载体pCDNA3.1和Interleukin-18片段组成。且插入的Interleukin-18片段与已知序列完全相同。