呼吸道病毒分离培养检测技术的研究进展

急性呼吸道感染是世界范围内的常见疾病,呼吸道病毒是其主要的致病病原体。近年来,呼吸道病毒的检测方法日益广泛,培养法作为病毒检测方法中的"金标准",也有了多方面的发展。该文综述了传统呼吸道病毒培养法及新兴方法,如病毒离心培养法、Pre-CPE检测、混合细胞培养法及转基因细胞培养法。这些新方法提高了呼吸道病毒培养法的效率及灵敏度,提高了该方法的实用性,将促进新型呼吸道病毒的发现。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型在单层细胞培养中的增殖特征

目的：通过对HSV-1在BHK-2l单层细胞培养中的增殖特征的研究，得出获得较高病毒含量的条件，从而对基础研究以及今后即将开展的临床病毒培养进行指导。方法：使用不同滴度的HSV-1毒株接种不同浓度培养的BHK-2l单层细胞，病毒感染后用免疫荧光法及ELISA法检测病毒滴度，并绘制曲线。结果：在细胞传代时，较大浓度的细胞在长成单层细胞后对病毒敏感性较高，并随细胞浓度减少而逐渐下降，但如将病毒滴度控制在适当范围内，仍可得到较高的病毒含量。结论：如需获得较高滴度的病毒悬液，应将培养用单层细胞以较大浓度传代或使接种病毒滴度处于适当范围。     

实时荧光PCR法和病毒分离培养法在手足口病病毒检测中的应用分析

目的 筛选快速准确的检测方法,为手足口病监测与防控工作提供及时可靠的病原学依据。方法 采用病毒分离培养法和实时荧光PCR检测法对2014年牡丹江市手足口病监测哨点医院采集的手足口样病例标本进行检测,比较检测结果。结果 2014年采集的206份标本中,实时荧光PCR法检测肠道病毒EV 71型42例、Cox A16型9例、肠道病毒通用型37例,阴性118例。病毒分离培养法检测肠道病毒EV 71型4例、Cox A16型4例、肠道病毒通用型6例。实时荧光PCR法、病毒分离培养法检测阳性率分别为42.72%和6.80%;与实时荧光PCR法相比,病毒分离培养法灵敏度、特异度分别为15.91%、100.00%。结论 实时荧光PCR法比病毒分离培养法更灵敏快捷、特异性强、敏感度高等,适用于手足口病病原体的检测。     

实时荧光PCR法、胶体金快速检测法及病毒分离培养法在甲型流感病毒检测中的临床应用分析

目的：探讨实时荧光PCR法、胶体金快速检测法及病毒分离培养法检测甲型流感病毒的临床应用。方法采用实时荧光PCR法、胶体金快速检测法及病毒分离培养法同时检测210份临床流感样标本是否有甲流感病毒阳性反应,统计分析其方法灵敏度、特异性。结果实时荧光PCR法检测其阳性率最高,病毒分离培养法阳性率最低,三者阳性率有显著差异（P 〈0.05）。结论三种检测方法对甲型流感病毒检测均显效,胶体金快速检测法可用于流感病毒早期筛选,实时荧光PCR法用于确诊,病毒分离培养法用于实验室分析与疫苗的研究。     

3种流感病毒检测方法的比较

目的对病毒分离培养法、实时荧光PCR法和鸡胚培养法3种检测流感病毒的方法和结果进行比较研究,筛选快速准确的检测方法,为流感监测与防控工作提供及时可靠的病原学依据。方法同时采用病毒分离培养法、实时荧光PCR法和鸡胚培养法对2014年10月~2015年3月牡丹江市流感监测哨点医院采集的流感样病例咽拭子样本进行检测,比较检测结果。结果实时荧光PCR法的流感病毒核酸检测阳性率为15.52%,其中169份为季节性H3N2流感病毒,73份为B型Yamagata株;病毒分离培养法的阳性率为6.29%,分离出63株季节性H3N2流感病毒,35株B型Yamagata株;鸡胚分离培养法检出率为0.64%。3种方法中,实时荧光PCR法的阳性率最高,病毒分离培养法次之,鸡胚分离培养法阳性率最低。结论实时荧光PCR法比病毒分离培养法和鸡胚培养法灵敏快捷、特异性强、敏感度高,适用于流感病毒的快速检测。     

三种流感病毒检测方法的比较

目的对胶体金法、病毒分离培养法和荧光定量RT-PCR法等3种检测流感病毒方法和结果进行比较研究,筛选快速准确的检测方法,为流感监测与防控工作提供及时可靠的病原学依据。方法同时采用胶体金法、病毒分离培养法和荧光定量RT-PCR检测法对2012年深圳市龙岗区流感监测哨点医院采集的流感样病例样本进行检测,比较检测结果。结果荧光定量RT-PCR的流感病毒核酸检测阳性率为70.8%,其中98份为季节性H3N2流感病毒,51份为B型Victoria株,4份为B型Yamagata株;病毒分离培养法的阳性率为46.3%,分离出61株季节性H3N2流感病毒,35株B型Victoria株,4株B型Yamagata株;胶体金法检出率为3.7%。3种方法中,荧光定量RT-PCR的阳性率最高,病毒分离培养法次之,胶体金法阳性率最低。结论与病毒分离培养法和RT-PCR法相比,胶体金法并不适合单独用于诊断流感病毒感染,病毒分离培养法费时费力,荧光定量RT-PCR法有较高的敏感性和特异性,适用于流感疫情的病原学快速诊断。     

用共同培养法分离小鼠三叉神经节潜伏病毒的实验研究

本实验取BalB/C纯系小鼠角膜接种单纯疱疹病毒1型(HSV-_1SM_(44)),进入潜伏期(21天)后,分批解剖小鼠用共同培养法分离三叉神经节的潜伏病毒,病毒分离阳性率为94.5％。实验结果提示:共同培养法是一种有效的分离潜伏期病毒的方法。     

不同培养方式对HIV产量的影响

目的 为了探索HIV体外培养的最佳条件，培养毒力强，产量高的HIV，供与艾滋病相关的实验研究用。方法 观察了接种HIV后不做任何处理，接种3d分别补加MT4细胞悬液和只补加新鲜培养液3种不同培养方式，在不同的培养时间的CPE，HIV感染毒力及病毒产量。结果 发现后两组感染毒力及病毒产量高于不处理组，而后两组相互之间无明显判别结论 接种HIV第3天补加新鲜培养液，是3种培养方式中最经济实用，简单可行的方法。     

肾综合征出血热病毒对体外培养的人胚肾小球系膜细胞的影响

观察肾综合征出血热病毒Ａ９株（ＨＦＲＳＶ－Ａ９）对体外培养的人胚肾小球系膜细胞（ＭｓＣ）的影响以及病毒唑、磷甲酸钠对病毒感染的抑制作用。采用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）、间接免疫荧光法（ＩＦＡ）、免疫酶组化法和电镜等技术检测ＭｓＣ中病毒、抗原与培养上清液中的病毒滴度。结果：ＨＦＲＳＶ－Ａ９感染ＭｓＣ７天后细胞中便有病毒抗原表达；电镜下胞浆中见到病毒颗粒和包涵体：病毒唑与磷甲酸钠能降低病毒抗原表达     

丙型肝炎病毒JFH1在不同三维培养体系中复制水平的比较

目的：检测中空纤维丝、热可逆凝胶和低吸附培养板3种三维培养体系中丙型肝炎病毒（HCV）增殖水平，寻找效率较高的HCV体外培养系统。方法：利用中空纤维丝、热可逆凝胶及低吸附培养板培养永生化人肝细胞HuS-E/2，通过XTT法检测细胞增殖情况。以基因型为2a型的HCV病毒株JFH1进行感染，在感染后不同时间点收集细胞标本，利用实时PCR法检测细胞中HCV的滴度。结果：在中空纤维丝和热可逆凝胶中培养的HuS-E/2细胞增殖曲线为持续递增，至培养结束时细胞数为初始培养数的2～3倍，JFH1感染后中空纤维丝方法培养的细胞中HCV滴度为2.00×10³ copies/1 μg total RNA，热可逆凝胶培养的细胞中HCV滴度为2.95×103 copies/1 μg total RNA,低吸附培养板方法培养的细胞中HCV滴度为1.18×10³ copies/1μg total RNA。结论：与中空纤维丝及低吸附培养板比较，热可逆凝胶法为基础的JFH1体外培养系统细胞生长稳定，HCV复制效率较高。     

细胞培养与PCR法检测生殖器疱疹病毒的对比研究

目的:比较不同方法检测生殖器疱疹病毒感染的效率。方法:采用病毒培养和PCR法检测疑为生殖器疱疹病毒感染者标本60例,并用PCR作病毒分型。结果:根据病史及临床表现确诊的生殖器疱疹患者标本60例中,病毒培养法阳性36例,阳性率60%(36/60);PCR检测单纯疱疹病毒(HSV)阳性45例,阳性率75%(45/60),和病毒培养相比,差异非常显著(χ2=26.76,P<0.01);PCR分型结果显示阳性标本均为单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)。水疱和脓疱标本的病毒培养和PCR检测阳性率均较高(80.0%~93.3%),糜烂、结痂、斑丘疹标本检测中PCR阳性率(20.0%~66.7%)高于病毒培养(0~33.3%)。结论:对疑为生殖器疱疹患者作病原学诊断,采集水疱、脓疱标本进行病毒分离或PCR检测较佳。     

人内皮细胞体外培养及感染流行性出血热病毒的初步观察

用酶消化法自人脐带静脉分离内皮细胞,进行体外传代培养。观察EHI病毒在该细胞中的增殖和复制。结果表明,从第一代培养第7日起,在感染内皮细胞胞浆内可检出EHF病毒抗原;阳性细胞数及胞浆内病毒抗原含量随培养时间的延长和传代次数的增加而增多,而感染细胞未见明显病变。提示EHF病毒可侵入人血管内皮细胞增殖复制,参与EHF的发病过程。     

光化学法病毒灭活的模型病毒培养与滴定方法的建立

目的建立Sindbis和伪狂犬病毒的培养与滴定方法.方法以Vero细胞为病毒传代及滴度滴定指示细胞,Karher氏法计算滴定结果.结果 Sindbis病毒感染的Vero细胞以圆缩、脱落为主;伪狂犬病毒感染的Vero细胞以变圆、形成折光性强的合胞体为主,病变细胞晚期脱落.Sindbis病毒第一次滴定TCID50＞11,第二次滴度TCID50为9.5;伪狂犬病毒第一次滴定TCID50＞11,第二次滴定TCID50为7.2.结论 Vero细胞对两种模型病毒均较敏感,适合用于此两种病毒的培养与滴定.该方法的建立为光化学法灭活血小板中病毒的研究奠定基础.     

实时荧光PCR检测B型流感病毒方法的建立及病毒培养法验证

目的建立B型流感病毒实时荧光PCR检测(FQ-PCR)法,并与常规病毒培养法比较,判断二者结果的相关性,确定两种检测方法各自更适合的应用领域。方法建立FQ-PCR法并对76株经Quidel胶体金试纸条鉴定型别的流感病毒分离培养株进行检测,比较其敏感性和特异性。21～223梯度稀释的B型流感病毒分别用FQ-PCR法和病毒培养法进行检测,记录FQ-PCR的Ct值及培养物的血凝效价,并对FQ-PCR阳性但血凝无效价的梯度进行盲传,再次检测HA效价,比较二法的灵敏度及相关性。对临床采集的881份咽拭子标本做FQ-PCR检测,同时进行病毒培养并盲传、血凝试验及Quidel胶体金试纸条分型,综合比较两种检测方法之间的差异。结果在76株已知流感病毒标本中,FQ-PCR方法检出B型16份,与Quidel胶体金分型结果相符。FQ-PCR方法的灵敏度约高出常规培养法的25～26倍。FQ-PCR法对临床咽拭子的检测灵敏度高,无非特异性反应。结论流感病毒FQ-PCR法具有与组织培养法一致的特异性,前者操作简便快捷,灵敏度更高,在流感病毒临床快速检测和鉴定中具有更广阔的应用前景。     

接种滴度与培养时间对轮状病毒增殖的影响

本文报道了轮状病毒在MA-104细胞中的增殖周期约为14～18小时,在感染4小时后用ELISA法可测出病毒抗原,6小时后用PAGE银染法检出病毒核酸,16～18小时病毒增殖滴度达最高峰,病毒的接种滴度与最高增殖滴度间呈正相关线性关系,其回归方程为Y=0.149x+0.702,培养时间亦密切影响病毒收获滴度。增加接种滴度并及时收获,可获取高滴度轮状病毒收获物。     

苏拉明对黄病毒类NS3蛋白质合成的影响

寻找有效的抗黄病毒类药物，为临床应用提供理论依据。在病毒吸附培养细胞HepG2后加入不同浓度的苏拉明，48h后采取培养上清液及感染细胞，运用病毒滴度测算（plaque法）、Western blot法及RT－PCR法，检测其对病毒增殖的影响。结果显示用苏拉明50μg/ml处理后产生的病毒量是对照组的51.8%，同时显示病毒NS3蛋白质合成量减少，而对病毒RNA无任何影响。提示苏拉明抑制病毒复制作用主要是阻碍了病毒NS3蛋白质的合成。     

板蓝根对柯萨奇病毒抑制作用的研究

目的 探讨板蓝根对柯萨奇B4病毒(CB4V)抑制作用。方法 采用组织细胞培养法，观察人宫颈癌传代细胞(HeLa细胞)病变效应及通过抑制病毒复制指数反应抗病毒的效果。结果 板蓝根具有抑制HeLa细胞病变的作用；抑制CB4V复制指数为2．75。结论 板蓝根在细胞水平具有明显的抗CB4V的作用。     

溶血法培养在细菌L型检出中的应用

目的研究溶血培养法与细菌L型检出之间的关系。方法对本院2002-2004年210份肾病患者血液分别进行常规血培养与溶血培养法血培养，观察血培养的细菌L型的阳性率。结果常规法血培养中阳性率为1．4％（3／210）．溶血培养法阳性率为48．5％（102／210）（P〈0．05），差异有显著性。结论溶血培养法能提高细菌L型检出。     

猫病毒血清学检测方法的建立及初步应用

通过摸索猫鼻气管炎病毒、嵌杯状病毒、泛白缅胞减少症病毒的培养条件,制备兔抗猫IgG．建立二种检测猫病毒抗体血清学方法即免疫酶染色法(IEA)及免疫荧光法(IFA)．用两方法检测5份猫血清标本,IEA与IFA的阳性数均为4份,结果表明IEA和IFA都适用于猫病毒抗体的检查。     

抗原滴片法快速诊断巨细胞病毒感染

本文采用尿脱落细胞与人胚肺纤维母细胞（HEL）混合微量滴片法（也称Ag滴片法）短期培养代替“飞片法”进行巨细胞病毒（CMV）感染的早期诊断，且应用CMV单克隆抗体经间接免疫荧光法检测培养细胞中的CMV早期抗原（CMVEA），72小时可获满意结果。CMV感染细胞完整，荧光亮度较强，病毒抗原所形成的荧光团声在细胞内形态，位置清晰，且重复性好，与常规病毒分离及尿脱落细胞直接涂片检测病毒抗原作比较，抗原滴片法阳性结果与病毒分离相一致，较直接涂片法敏感。本法具有简便，快速，敏感，经济等优点，是一种较好的快速诊断方法。