小鼠胰岛微血管内皮细胞外泌体的提取和鉴定方法

目的：建立小鼠胰岛微血管内皮细胞来源的外泌体的提取和鉴定方法,为糖尿病胰岛微血管内皮受损的发病机制研究及重建胰岛微循环完整性的应用提供必要材料。方法选取小鼠胰岛微血管内皮细胞株（MS-1）细胞作为研究对象,取其培养上清液,经多步离心结合蔗糖／D2O垫超速离心方法获取提取物,然后采用透射电镜和Western blotting 法对提取物进行形态和蛋白成分分析,以确定其是否为外泌体。结果提取物呈形态均一的类圆形囊泡,有完整双层膜包绕,内部含有低电子密度物质。囊泡大小约为40～100 nm,可散在分布,也可聚集成团,提取物均阳性表达CD63、CD9和TSG101分子。结论经过形态和蛋白成分分析证实所提取到的物质正是MS-1细胞来源的外泌体,便于后续临床和基础研究工作的开展。     

多步离心法提取K526细胞外泌体

目的:探讨多步离心提取K526细胞外泌体的实验方法.方法:选用白血病细胞株K562细胞为研究对象,取其培养上清液,经多步骤离心获取提取物,然后进行形态和蛋白成分分析.结果:形态和蛋白成分分析证实所提取到的物质正是K526细胞外泌体.结论:多步离心是一种方便实用的提取外泌体的方法.     

淋巴瘤来源外泌体的提取方法比较与鉴定

目的比较淋巴瘤来源外泌体的3种提取方法[聚乙二醇（PEG）沉淀法、exoEasy试剂盒、超速离心法],并鉴定其形态及生物学特征。方法采用PEG沉淀法、exoEasy试剂盒、超速离心法提取外泌体,在透射电子显微镜下观察外泌体形态,利用Westernblot法检测3种方法提取的外泌体蛋白表达特点。结果PEG沉淀法、超速离心法提取的外泌体能表达特征蛋白CD63、CD81,具备外泌体的基本形态特征,其中超速离心法提取的外泌体特征更清晰;而exoEasy试剂盒提取的外泌体特征不明显。结论PEG沉淀法适合对外泌体产量需求大的实验,超速离心法适合外泌体的功能实验,exoEasy试剂盒适合外泌体前期预实验的探索使用。可根据不同研究目的选择不同的提取方法。     

口腔鳞癌细胞来源外泌体的提取与鉴定

目的 提取并鉴定口腔鳞癌细胞来源的外泌体。方法 超速离心法自口腔鳞癌CAL27细胞培养上清中提取外泌体,利用透射电镜观察其形态特征和大小,纳米粒度分析检测其粒径大小和分布,Western blot检测其外泌体特异性蛋白CD9、CD81和CD63的表达。结果 自口腔鳞癌CAL27细胞上清中分离出的外泌体,形态为具有膜结构的囊泡,直径约30-100 nm;粒径分析显示其粒径的主峰为127.0 nm,大小分布集中于(127.9±4.1)nm; Western blot结果显示其具有外泌体特异性蛋白CD9、CD81和CD63的表达。结论 利用超速离心法可成功提取口腔鳞癌CAL27细胞来源的外泌体,为后续探究外泌体调控口腔鳞癌发生发展的相关机制奠定实验基础。     

巨噬细胞来源外泌体的分离与鉴定

目的 分离并鉴定巨噬细胞来源的外泌体,为当前外泌体的提取研究提供一定参考,并为后续开展外泌体与牙周组织再生的相关研究奠定基础.方法 体外培养巨噬细胞RAW264.7,使用超速离心和超滤结合法提取其外泌体,通过BCA试剂盒测定外泌体的蛋白总量,透射电镜下观察其形态特征,粒径分析仪测定其粒径大小及浓度,免疫印迹法检测外泌体...     

脐带间充质干细胞外泌体修复骨质疏松大鼠颅骨缺损的研究

目的：探讨人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,HucMSCs）来源外泌体对骨质疏松大鼠颅骨缺损的修复作用。方法：提取HucMSCs来源外泌体,使用透射电镜及纳米颗粒追踪分析鉴定其形态及大小,使用Western blot鉴定其表面标志物;分离培养大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）并使用流式细胞术鉴定其表面标志物;将外泌体（空白对照、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL）与BMSCs共培养,检测不同浓度的外泌体对BMSCs增殖及成骨向分化的影响;选取SD大鼠通过卵巢切除术（ovariectomy,OVX）构建骨质疏松模型,在颅骨缺损模型建立的同时注射外泌体悬液,术后8周处死大鼠,取术区组织进行micro-CT扫描并进行骨量分析,HE染色后显微镜下观察骨缺损愈合情况,评价HucMSCs来源外泌体对骨质疏松大鼠颅骨缺损的修复潜能。结果：透射电镜及纳米颗粒追踪分析结果显示,提取的HucMSCs来源外泌体形态及大小符合要求,表面蛋白...     

结直肠癌细胞外泌体的制备及其促单核细胞增殖作用

目的：从结直肠癌细胞系中分离鉴定外泌体,初步研究结直肠癌来源的外泌体潜在的免疫学特性,为外泌体在结直肠癌免疫学治疗中的应用提供依据。方法： 超速离心法从HCT116和SW480 2种结直肠癌细胞系培养上清中分离提取正常细胞外泌体和热休克细胞外泌体,进一步用220 nm的滤膜进行纯化获得纯度较高的外泌体。采用透射电镜观察所提取外泌体表征形态,聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析细胞和外泌体的蛋白组成,检测外泌体促进外周血单个核细胞（PBMCs）的增殖功能。结果：透射电镜下正常的外泌体和细胞热休克获得的外泌体形态相近,均呈现典型的圆形或椭圆形外泌体结构,直径为50~100 nm。聚丙烯酰胺凝胶电泳,结直肠癌细胞裂解物与结直肠癌细胞系来源外泌体的蛋白组成不同,与未处理和经热休克处理的结直肠癌细胞比较,外泌体对PBMCs的增殖有更强的促进作用（P<0.05）,热休克作用可使外泌体诱导的PBMCs的增殖程度显著升高（P<0.05）。结论 ：超速离心法和滤膜过滤方法可有效地从结直肠癌细胞系中提取外泌体,细胞裂解物和外泌体的蛋白组成差异可能是造成免疫学特性差异的主要原因,将细胞经热休克处理可增强外泌体的免疫原性。     

青春期抑郁样行为小鼠脑组织外泌体miRNA测序分析

  目的  探索青春期抑郁样行为小鼠脑组织外泌体微RNA（microRNA, miRNA）差异表达情况。  方法  实验组为慢性社交挫败实验应激模型（chronic social defeat stress, CSDS）敏感型青春期小鼠,采用糖水偏好和旷场实验评估抑郁样行为。使用超速离心法提取脑组织外泌体,经透射电子显微镜、纳米流式检测技术以及蛋白质印记对外泌体形态、粒径大小和表面标志蛋白进行鉴定。采用高通量测序技术评估实验组和对照组小鼠脑组织外泌体miRNAs表达,基于生物信息学进行GO和KEGG通路富集分析。  结果  外泌体颗粒大小在50～100 nm之间、呈典型圆盘状的囊泡结构,检测到外泌体阳性蛋白TSG101和Syntenin。CSDS诱导抑郁样行为的青春期小鼠脑组织外泌体中有13个miRNA显著上调,4个miRNA显著下调,差异表达的miRNA在PI3K-Akt信号通路、轴突导向以及缺氧反应等显著富集。  结论  本研究发现脑组织外泌体miRNA可能参与胰岛素抵抗、神经可塑性、缺氧反应等生物过程调控大脑功能,从而产生抑郁样行为。     

间充质干细胞来源的外泌体缓解老年小鼠心脏成纤维细胞衰老的研究

目的 通过体外实验探索间充质干细胞来源的外泌体(mesenchymal stem cells-derived exosomes, MSCs-Exo)对老年小鼠心脏成纤维细胞衰老表型的调控作用,并初步探索发挥关键作用的外泌体蛋白。 方法 使用超速离心法提取人脐带来源间充质干细胞条件培养基中的外泌体,通过透射电镜、纳米颗粒跟踪分析及Western印迹法进行鉴定。分离18月龄老年小鼠与4周龄年轻小鼠的心脏成纤维细胞,分别作为衰老组和年轻组,加入外泌体干预后的衰老细胞作为治疗组。进行细胞衰老标志物β-半乳糖苷酶染色实验、细胞活力实验和细胞迁移能力实验,对结果做定量分析。基于公共数据库结果,对外泌体的蛋白质内容物进行质控后的GO富集、蛋白互作等生物信息学分析,筛选潜在关键内容物,并结合基因敲低实验与衰老标志物检测进行验证。 结果 间充质干细胞来源的外泌体可以显著减少老年小鼠的衰老心脏成纤维细胞衰老标志物β-半乳糖苷酶的表达（P＜0.001）,同时显著促进细胞活力与细胞迁移速度（P＜0.001）。生物信息学分析显示： 外泌体蛋白内容物中的P4HA2可能是GO富集程度最高的胶原纤维组织通路中的关键蛋白。敲低P4HA2显著下调MSCs-Exo缓解老年小鼠心脏成纤维细胞衰老的能力（P＜0.001）。 结论 间充质干细胞来源的外泌体能够对老年小鼠心脏成纤维细胞起抗衰老、促活力、促迁移的效果,而外泌体中的P4HA2蛋白可能是行使上述功能的核心成分。     

SACC-83来源的外泌体促进腺样囊性癌细胞的增殖

目的研究腺样囊性癌（ACC）肿瘤细胞来源的外泌体对自身肿瘤细胞增殖能力的影响。方法选取ACC细胞株SACC- 83,采用超滤管浓缩与试剂盒提取相结合的方法从SACC-83的培养上清中提取外泌体,通过透射电镜及蛋白免疫印迹法对所 提取的外泌体进行鉴定;将SACC-83来源的外泌体用荧光染料PKH67标记后与其分泌细胞共培养,采用激光扫描共聚焦显微 镜（LSCM）观察SACC-83对于自身来源的外泌体的摄取情况;采用MTT细胞增殖实验、细胞划痕实验及Western blot 法检测 SACC-83经自身外泌体作用后,其细胞增殖能力的变化情况以及ERK/P-ERK蛋白的表达变化。结果透射电镜及Western blot 的检测结果显示,SACC-83培养上清中所提取到的微囊泡直径为30~100 nm,且外泌体蛋白标记物CD9、CD63和TSG101的表 达为阳性;携带PKH67荧光标记的外泌体可被SACC-83摄取。MTT及细胞划痕实验结果示SACC-83来源的外泌体可促进自 身肿瘤细胞的增殖能力,Western blot结果显示P-ERK的表达上调,ImageJ软件行蛋白条带灰度值分析并统计显示实验组与对 照组具有显著统计学差异（P<0.05）。结论SACC-83来源的外泌体可被自身肿瘤细胞摄取,并可显著促进肿瘤细胞的增殖能 力,上调P-ERK的表达。该结果提示ACC可能通过外泌体途径促进肿瘤细胞的增殖能力,且ERK的活化以及MAPK/ERK信 号通路的激活可能是其促细胞增殖的潜在机制之一。     

枣仁益眠胶囊的制备工艺研究

目的:研究枣仁益眠胶囊的制备工艺。方法:酸枣仁用水提取,通过正交实验获得最佳工艺,水煎液喷雾干燥得到粉末与黑胡椒的细粉按比例混合均匀后制粒、装胶囊。结果:酸枣仁的水煎工艺为药材粗粉碎破壳后加水煎煮3次,每次1 h,加水量为10倍量。制粒成型时采用13%聚乙二醇6000的乙醇溶液为黏合剂。结论:所得工艺路线简单、操作容易,制剂成型性良好。     

间充质干细胞外泌体调控氧化应激减轻D 氨基半乳糖/脂多糖诱导的急性肝损伤

目的: 探讨小鼠间充质干细胞来源的外泌体(exosome, Exo)对D-氨基半乳糖(D-galactosamine hydrochloride, D-GalN)/脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)诱导的急性肝损伤治疗作用及可能机制。方法: 提取小鼠间充质干细胞,通过流式细胞术和细胞分化实验进行验证。超速离心法提取间充质干细胞外泌体,透射电镜和蛋白质免疫印迹对其鉴定,纳米颗粒追踪分析测定外泌体粒径电位。通过活性氧荧光探针考察外泌体减轻活性氧损伤的功能。CCK-8检测外泌体对肝细胞的保护作用。腹腔注射D-GalN/LPS制备急性肝损伤小鼠模型,考察外泌体对D-GalN/LPS诱导的急性肝损伤小鼠的治疗作用。结果： 原代间充质干细胞表达CD29和CD44两个标志蛋白,而不表达CD31和CD117,具有成骨分化能力。间充质干细胞外泌体为具有典型杯状结构的纳米囊泡,表达CD9和CD63两个标志性蛋白。与PBS组相比,干细胞外泌体能够减轻L02细胞内的活性氧水平,提高L02细胞活性,且外泌体本身对L02细胞活性没有影响。与PBS组相比,Exo治疗组能够改善肝脏组织损伤,降低转氨酶水平,调节丙二醛、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的水平。结论： 在细胞实验中,间充质干细胞外泌体能够减少活性氧,保护肝细胞的活性;在动物实验中,间充质干细胞外泌体能够下调氧化应激相关蛋白的表达,促进肝脏组织修复。     

弓形虫感染导致DC2.4细胞外泌体特征差异的研究

目的 分析小鼠树突状细胞（DC2.4）感染弓形虫后所分泌的外泌体及其富集的小RNA与piRNA的变化,为外泌体在弓形虫-宿主互作中的作用提供必要的信息。方法 DC2.4细胞分为2组（未感染组与感染组）,用含无外泌体血清的培养基培养。待细胞长满,感染组用弓形虫RH株速殖子感染28 h,未感染组则培养28 h。收集两组细胞的培养上请,采用超速离心法分别提取外泌体,通过透射电镜检测外泌体形态,并用纳米颗粒追踪仪检测外泌体的粒径大小以及颗粒密度。对外泌体进行小RNA高通量测序分析,用生物信息学方法分析感染组与对照组差异显著的piRNA,对并其靶基因及功能进行预测。结果 对弓形虫感染与未感染的DC2.4细胞分泌的外泌体进行形态学鉴定以及粒径大小和密度的比较,发现弓形虫感染会导致DC2.4分泌的外泌体密度增加;而通过外泌体小RNA测序,发现弓形虫感染会导致外泌体中 miRNA及piRNA数目增加,其中感染后显著升高的piRNA包括piR-mmu-159、piR-mmu-1526、piR-mmu-9082、piR-mmu-17405、和piR-mmu-25576。对上述piRNA靶基因的预测和KEGG分析,显示这些靶基因显著富集到MAPK、Ras、cAMP、actin细胞骨架调节、粘着斑形成、轴突导向等信号通路上。结论 弓形虫感染导致DC2.4细胞分泌的外泌体粒径尺寸峰值增大和密度增加,miRNA及piRNA数目增加,提示外泌体在弓形虫-宿主细胞互作中起着重要作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞exosome提取及其心肌细胞H9C2靶向作用的实验探索

目的 研究缺氧预处理条件下,骨髓间充质干细胞分泌的exosome的特征;探索心肌细胞H9C2是否骨髓间充质干细胞exosome作用的靶细胞之一,以及H9C2对骨髓间充质干细胞exosome的摄取是否随时间有一定的变化特征。方法 采用分步离心结合蔗糖/D2O垫超速离心方法分离提取干细胞分泌的exosome囊体颗粒。采用透射电镜和Western blotting法鉴定提取物是否为exosome。采用图像分析软件Image- Pro Plus 6.0 对透射电镜结果中exosome 数据进行采集,采用excel和统计软件Graph Pad 5.0对采集得到的exosome数据进行统计,以明确exosome的直径分布区间和平均半径等特征。采用绿色荧光染料PKH-67标记exosome,将标记的exosome与H9C2共孵育,观察exosome能否被心肌细胞H9C2摄取。将exosome与H9C2共孵育的不同时间段,观察H9C2对exosome的摄取随时间变化的特征。结果 提取物呈微型囊体结构,形态近似球形或者椭球形,大小均一,均匀分散的分布在视野中,提取物均阳性表达CD63和CD9分子,且较CD63分子,提取物更高表达CD9分子;缺氧预处理条件下,骨髓间充质干细胞exosome直径的集中分布范围是20～60nm, 半径为(17.03 ± 0.40) nm;exosome与心肌细胞H9C2共孵育结果显示,仅实验组H9C2细胞质内可见大量的exosome绿色荧光颗粒;H9C2摄取exosome的时间特征显示,对照组4个亚组中H9C2对exosomes的摄取情况无明显不同。实验组各亚组显示,exosome与H9C2共孵育1h,H9C2细胞质中即开始观察到标记的exosome;共孵育1.5～2.5h,H9C2细胞质中exosome绿色荧光颗粒数量较共孵育其他时间段的多,荧光强度较共孵育其他时间段的强。结论 成功分离提取到了缺氧预处理条件下的大鼠骨髓间充质干细胞exosome;心肌细胞H9C2是骨髓间充质干细胞exosome生物学作用的靶细胞;H9C2对骨髓间充质干细胞exosome的摄取情况随时间的延长有明显的变化。     

兔房水来源exosomes的分离与鉴定及其免疫抑制功能的研究

目的:探讨兔房水中是否能够分离得到具有脂质双分子层结构的纳米级小囊泡exosomes,并检测其是否表达免疫抑制相关分子,参与眼球免疫耐受状态的维持。方法:收集40只健康新西兰大白兔的房水,分级分离,超速离心制备exosomes,透视电镜对其形态进行鉴定;Western blot检测exosomes标志性蛋白以及免疫抑制相关分子TGF-β的表达情况;采用CCK-8细胞增殖检测方法判断兔房水来源的exosomes对经ConA诱导的兔子T淋巴细胞增殖情况的抑制功能。结果:40只新西兰大白兔收集到约8 ml的房水,从中获得200μg exosomes。经透射电镜鉴定:从房水中分离获得的exosomes直径主要集中在50～100 nm,具有典型的脂质双分子层结构;Westerblot结果表明,该exosomes表达热休克蛋白Hsp70、四次跨膜蛋白CD9以及内体相关蛋白Alix,不表达内质网蛋白Grp94,具有典型的exosomes蛋白表达谱。此外,该exosomes还表达免疫抑制相关分子TGF-β。体外抑制淋巴细胞增殖实验表明,房水来源的exosomes能够明显抑制T淋巴细胞的增殖。结论:兔房水中能够分离出具有免疫抑制功能的exosomes;该exosomes很有可能参与了眼球免疫耐受的维持。     

PEG6000沉淀结合差速离心方法浓缩水中脊髓灰质炎病毒

建立一种简便,有效的从细菌培养物中纯化ＰＶ１病毒的方法用于水病毒消毒实验。方法ＰＶ１Ｈｅｎａｎ株在Ｈｅｐ－２细胞中增殖后用聚乙二醇６０００沉淀结合差速离心的方法纯化病毒,ＲＴ－ＰＣＲ和透射电镜鉴定提纯病毒的形态学和分子生物学特性。结论ＰＥＧ６０００结合差速离心的方法较之蔗糖密度梯度区带离方法易于操作且比单独ＰＥＧ沉淀有更高的纯化系数,是一种简便,有效的方法。     

主动脉夹层患者尿液来源外泌体不同分离方法的比较

目的 探讨分离主动脉夹层患者尿液来源外泌体的适宜方案。方法 收集主动脉夹层患者尿液,采用超速离心法、透析超滤法和沉淀试剂盒法分离提纯尿液中的外泌体。在生物透射电子显微镜下观察尿液外泌体的形态,用纳米颗粒跟踪分析仪检测其粒径大小、颗粒分布与浓度。结果 经过表征,3种方法获得的尿液外泌体特征如下：（1）超速离心法获得的尿液外泌体具有半杯托状或凹陷的半球形结构;粒径较大,分布较均匀;粒径范围较宽,为（236.4±46.5）nm;浓度较低,为（2.82±0.21）×10¹²个/mL;（2）透析超滤法获得的尿液外泌体形态较好,且数量多;粒径较小,分布较集中;粒径范围较窄,为（128.7±6.3）nm;浓度较大,为（2.16±0.15）×10¹⁴个/mL;（3）沉淀试剂盒法获得的产物在生物透射电子显微镜下未见明显的外泌体结构。结论 主动脉夹层患者采用透析超滤法分离获得的尿液外泌体浓度较高,在对外泌体的纯度要求不是特别高的情况下比较适宜。     

持续ALT正常的慢性乙型肝炎患者外泌体miRNAs表达谱

目的：通过分析持续丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)正常的慢性乙型肝炎(以下简称慢乙 肝)患者外泌体miRNAs的表达情况,试图找出更好反映肝组织炎症的外泌体miRNAs。方法：收集持续ALT正常并行 肝活检的慢乙肝患者,选取肝组织炎症分级≥A2和相似文献   

采用高速离心及ExoQuick-TC法提取小鼠骨髓间充质干细胞来源外泌体比较及鉴定

比较及鉴定超高速离心法及ExoQuick-TC法提取小鼠骨髓间充质干细胞来源外泌体.采用BCA蛋白检测可见ExoQuick-TC法提取的外泌体蛋白含量高于超高速离心法提取的蛋白含量.Exosome Antibodies,Array & ELISA Kits检测可见ExoQuick-TC法提取外泌体的纯度优于超高速离心法提取的纯度.两种方法提取的外泌体电镜下形状无差异,随机选取3个电镜视野进行计数可见ExoQuick-TC法提取外泌体数量多于超高速离心法提取外泌体. ExoQuick-TC法提取的外泌体具有更高的产量及纯度.