多功能转录因子CTCF重组质粒构建及其表达鉴定

目的 构建人CTCF cDNA全长及N端、Zn指、C端3个片段的原核融合表达载体,纯化融合蛋白并进行鉴定.方法 以编码CTCF全长序列的质粒为PCR模板,分别构建GST融合表达重组质粒pGEX-4T-2-CTCF,pGEX-4T-2-CTCF-N,pGEX-4T-2-CTCF-Zn,pGEX-4T-2-CTCF-C,转化大肠杆菌BL21,酶切、测序鉴定;优化IPTG诱导表达条件,并对亲和层析纯化的GST融合蛋白CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF进行Far-West-ern blot鉴定.结果 重组质粒经双酶切和测序鉴定证实构建成功.GST融合蛋白CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF-C均在大肠杆菌中成功诱导表达,融合蛋白经亲和层析纯化获得纯化蛋白.各纯化蛋白经SDS-PAGE和Far-Western blot鉴定,均为诱导表达蛋白质.结论 成功构建了GST融合表达CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF-C的重组质粒,对融合蛋白表达条件进行了优化.获得了高效表达的GST融合蛋白.     

结核分枝杆菌RD1区PPE68/GST融合蛋白表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌PPE68/GST融合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌JM109中诱导表达. 方法: 利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Rv3873基因,并将其定向克隆pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873并转化E.coli JM109,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.采用GST蛋白纯化试剂盒进行重组融合蛋白纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组表达产物. 结果:成功构建原核表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873并表达出约Mr 63 000大小的PPE68/GST融合蛋白,占总菌体的40%. Western Blot检测该融合蛋白能和结核患者多价抗血清发生反应. 结论:成功地构建了原核表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873,并在大肠杆菌得到表达.     

GST-CTCF融合蛋白原核表达载体的构建及表达

目的构建人CCCTC结合因子(CCCTC-binding factor,CTCF)与谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase,GST)重组蛋白的原核表达载体,并进行诱导表达。方法以pEASY-T1-SIMPLE-CTCF为模板,设计引入限制性酶切位点的CTCF引物,PCR方法扩增目的片段,产物经限制性内切酶酶切后与原核表达载体pGEX-4T-1连接,构建成pGEX-4T-1-CTCF原核表达载体,转化至大肠埃希菌BL21中,经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)进行诱导,Western blot检测GST-CTCF融合蛋白的表达情况。结果经菌液PCR、质粒双酶切分析、基因测序分析证实重组表达质粒pGEX-4T-1-CTCF构建成功,GST-CTCF融合蛋白产物经Western blot鉴定为特异性表达。结论成功构建了pGEX-4T-1-CTCF原核表达质粒,获得特异性的GST-CTCF融合蛋白,为进一步研究转录因子CTCF的功能奠定了基础。更多还原     

受精抗原-1基因的克隆和GST融合表达

目的：克隆和原核表达小鼠受精抗原-1(FA-1)基因。方法：自行设计引物，用RT-PCR从小鼠睾丸组织总RNA扩增FA-1基因的编码序列。将扩增产物克隆至GST融合表达载体pGEX-2T。以IPTG诱导GST融合FA-1的表达。结果：凝胶电泳显示PCR扩增产物的分子量与预期的508bp-致。重组质粒经BamHI／EcoR I双酶切后产生一个约500bp的片段。对重组质粒的序列测定表明，插入片段的序列与发表的FA-1基因编码序列相符。在IPTG的诱导下，BL21重组菌高效表达出一个分子量与43kDa相近的产物(预期44.2kDa)。该产物可通过GST融合蛋白纯化试剂盒得到纯化。结论：小鼠FA-1编码序列已被成功地克隆至GST融合表达载体pGEX-2T。     

人睾丸前列腺素D合成酶的原核表达

目的：将获得纯化的重组人睾丸前列腺素D合成酶（L－PGDS）用于基础和临床研究,方法：在原核表达系统中,用异丙基-β-D－硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组质粒pGEX-2T／htL-PGDS的表达,用谷胱甘肽琼脂糖珠亲和并纯化重组融合蛋白GST／htL-PGDS,再用凝血酶裂解融合蛋白,从而获得纯化的重组L－PGDS。对表达纯化重组蛋白的质粒进行DNA测序,并对重组蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）分析,鉴定其是否为所需目的蛋白。结果：用IPTG诱导重组质粒pGEX-2T／htL-PGDS表达的最佳浓度为1mmol/L最佳时间为4h。在此基础上获得的融合蛋白用凝血酶裂解后获得单一纯化的重组蛋白L-PGDS,最佳裂解时间为2h。SDS－PAGE和DNA测序证实,所获的重组蛋白确系所需目的蛋白,结论：用上述方法可获得纯化的人睾丸L－PGDS。     

迁移侵袭抑制蛋白 MIIP 基因 K167E 位点突变体的构建和表达

目的构建人迁移侵袭抑制蛋白（MIIP）蛋白K167E突变体的原核表达载体pGEX-4T-1-MIIP（K167E）并进行表达和纯化,为MIIP的后续功能研究提供有效工具。方法以pGEX-4T-1-MIIP重组质粒为模板,PCR扩增得到人MIIP基因（K167E）突变体的eDNA全长,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建获得pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体,经酶切鉴定及测序验证完全正确后,将其转化至大肠杆菌B121细胞中诱导表达,纯化获得GST—MIIP（K167E）融合蛋白。结果酶切鉴定和测序结果显示,pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体表达载体构建成功。经诱导表达及纯化后,成功获得的GST—MIIP（K167E）融合蛋白。结论成功构建了pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体表达载体,并获得了GST—MIIP（K167E）融合蛋白。     

迁移侵袭抑制蛋白MIIP的GST融合蛋白表达及生物学活性鉴定

目的构建人MIIP蛋白与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达及生物学活性鉴定。方法 RT-PCR扩增得到人MIIP基因全长编码序列,采用重组DNA技术将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建获得重组原核表达载体pGEX-4T-1-MIIP,经酶切鉴定及测序验证完全正确后,将其转化至大肠杆菌BL21细胞中,用异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经纯化获得目的蛋白,用Western blot鉴定所得融合蛋白。结果构建了pGEX-4T-1-MIIP原核表达载体,在大肠杆菌中表达获得了GST-MIIP融合蛋白,经Glutathione Agarose纯化和Western blot检测,证实所得GST-MIIP融合蛋白具有生物学活性。结论成功获得了有生物学活性的GST-MIIP融合蛋白。     

生精相关基因mTSARG3的原核表达和抗体制备

目的 构建小鼠生精相关基因pGEX-KG/mTSARG3重组载体,进行原核表达和多克隆抗体制备.方法 应用RT-PCR从小鼠睾丸cDNA文库中扩增mTSARG3的开放阅读框,T-A克隆后将mTSARG3插入到原核表达载体pGEX-KG中,经测序鉴定后将重组质粒转入宿主菌E.coliBL21,IPTG诱导表达GST/mTSARG3融合蛋白,采用SDS-PAGE和Westernblotting对融合蛋白进行分析和鉴定.以融合蛋白为免疫原免疫家兔,制备抗mTSARG3多克隆抗体并进行Westernblotting鉴定.结果 成功构建了pGEX-KG/mTSARG3重组质粒,测序结果与预期一致;转化重组质粒的E-coliBL21经IPTG37℃诱导4h后高效表达GST/mTSARG3融合蛋白:Westernblotting实验结果显示制备抗体可与原核表达融合蛋白特异性结合.结论 成功进行了mTSARG3基因的原核表达和多克隆抗体制备,为下一步的功能研究奠定基础.     

小鼠可溶性PD-1的克隆、原核表达及活性分析

目的：小鼠可溶性PD-1（sPD-1）原核表达载体的构建、表达、纯化及其生物学效应初步研究。方法：应用小鼠脾细胞总RNA,采用RT-PCR克隆sPD-1基因,将其重组到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达载体pGEX-4T-1-sPD-1,转化至E.coliDH5α,筛选阳性菌落,进行酶切及测序鉴定。将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-sPD-1转化至E.coliBL21（DE3）中,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测,同时通过蛋白质纯化仪纯化GST-sPD-1融合蛋白。利用流式细胞术和Alamar Blue法,检测纯化的sPD-1融合蛋白对淋巴细胞增殖的影响,评价其生物学活性。结果：成功构建重组质粒pGEX-4T-1-sPD-1,并在E.coli BL21（DE3）中获得了成功表达,利用蛋白质纯化仪得到纯化的GST-sPD-1融合蛋白。流式细胞术和Alamar Blue法结果均显示,不同浓度的融合蛋白作用于混合淋巴细胞,与阴性对照相比,可明显促进淋巴细胞的增殖。结论：成功地克隆、表达和纯化了小鼠sPD-1蛋白,纯化的重组蛋白可有效促进淋巴细胞增殖,为进一步研究其功能和临床应用提供了条件。     

小鼠金属硫蛋白-I在大肠杆菌中的 表达与分离纯化

在大肠杆菌中表达小鼠金属硫蛋白-I,并研究其分子结构和生物学功能。方法将小鼠金属硫蛋白-I基因克隆入融合表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21,得到含重组表达质粒pGMA的工程菌。结果经IPTG诱导,表达出分子量约为33KD的融合蛋白。然后经Glutathione-Sepharose4B亲和纯化后,用凝血酶切除GST部分。经SephacrylS-100过滤纯化,得到结合有Cd2+的小鼠金属硫蛋白-I。产率约为3mg/L培养液。结论成功制备了表达MT的工程菌。     

HCK SH3结构域与HIV-1 Nef蛋白体外结合活性的检测

目的构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1/SH3,检测原核表达的SH3蛋白的生物学活性。方法利用PCR方法扩增HCK SH3基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达质粒pGEX-4T-1/SH3,转化E.coli DH5α,进行双酶切和测序鉴定。筛选阳性质粒,转化至E.coli BL21(DE3)中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE和蛋白质印迹检测,同时纯化SH3蛋白。表达并纯化HIV-1 Nef蛋白,利用GST pull-down方法检测SH3蛋白与Nef蛋白的结合活性。结果成功获得重组质粒pGEX-4T-1/SH3,测序正确,高效表达并纯化了SH3蛋白。GST pull-down实验结果显示SH3与HIV-1 Nef蛋白具有良好的结合活性。结论成功地克隆、表达和纯化了GST-SH3蛋白,SH3与Nef蛋白具有体外特异性结合活性,为进一步研究针对Nef与SH3结合的靶向药物的筛选提供了实验基础。     

抗弓形虫伴侣蛋白60多克隆抗体制备与鉴定

目的：制备、鉴定抗弓形虫伴侣蛋白60（TgCpn60）特异性多克隆抗体。方法：以弓形虫RH株cDNA为模板，PCR扩增编码TgCpn60的C末端168个氨基酸（TgCpn60C168AA）的507 bp序列片段，构建pGEX-4T-1-TgCpn60C168AA重组质粒。将鉴定正确的质粒转化入大肠埃希菌（E.coli ）BL21，并利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，进而用Glutathione-SepharoseTM4B介质亲和层析法纯化重组蛋白后行SDS-PAGE电泳。以纯化的GST-TgCpn60C168AA蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠，取小鼠血清进行纯化，获得特异性抗TgCpn60C168AA多克隆抗体。以该多克隆抗体为一抗，进行Western blot检测，验证其与虫体蛋白的反应情况。瞬时转染pFNR-RFP质粒至虫体后，采用间接免疫荧光法（IFA）检测TgCpn60与弓形虫顶质体外腔膜标志蛋白NADP+铁氧化还原蛋白还原酶（TgFNR）的共定位情况。结果：经PCR及测序结果证实重组质粒pGEX-4T-1-TgCpn60C168AA构建成功。SDS-PAGE电泳结果表明，GST-TgCpn60C168AA蛋白成功诱导表达。Western blot结果显示，制备的多克隆抗体既能特异性识别GST-TgCpn60C168AA重组蛋白，同时也能识别弓形虫内源性TgCpn60蛋白。IFA结果证实，TgCpn60蛋白与TgFNR蛋白存在共定位现象。结论：制备的抗GST-TgCpn60C168AA重组蛋白多克隆抗体能特异性识别弓形虫内源性TgCpn60蛋白，为进一步研究该蛋白功能提供了有利的工具。     

GST-hZimp10融合蛋白的重组及抗体制备

目的:构建pGEX-4T-1/hZimp10重组质粒,并在大肠杆菌中表达,纯化出GST-hZimp10融合蛋白,用以制备抗hZimp10抗体。方法:采用PCR技术以pcCDNA3.1-Flag-hZimp10为模板,扩增出hZimp10蛋白N端128个氨基酸对应DNA片段,并将其与谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX-4T-1进行重组,酶切鉴定后获得重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达,获得GST-hZimp10融合蛋白,纯化后将其作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting法检测抗体特异性。结果:经BamHⅠ和XhoⅠ 双酶切鉴定,确定PGEX-4T-1/ hZimp10重组质粒中包含384bp的片段,与测序结果一致,表明pGEX-4T-1/hZimp10重组质粒构建成功。SDS-PAGE电泳,融合蛋白成功表达,蛋白相对分子质量大小与预期相符。间接ELISA法检测抗hZimp10抗体效价可达1:100 000以上。Western blotting法,hZimp10在LNCaP细胞中具有很高的特异性。结论:成功获得GST-hZimp10融合蛋白,且制备了抗hZimp10抗体。     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)与谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白,测定重组蛋白的免疫活性。方法采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫(海南株)GDH基因,双酶切后克隆入pGEX-4T-1载体中进行诱导表达,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清,并用琼脂双向扩散法检测效价,ELISA、Western blotting检测重组抗原的免疫活性。结果获到了重组表达的抗原蛋白,表达产物能与鼠抗恶性疟原虫血清发生特异反应,并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,免疫琼脂扩散法检测抗体滴度为1∶16。结论恶性疟原虫GDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的：在大肠杆菌中表达恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶（GDH）与谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白，测定重组蛋白的免疫活性。方法：采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫（海南株）GDH基因，双酶切后克隆入pGEX-4T-1载体中进行诱导表达，重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清，并用琼脂双向扩散法检测效价，ELISA、Westernblotting检测重组抗原的免疫活性。结果：获到了重组表达的抗原蛋白，表达产物能与鼠抗恶性疟原虫血清发生特异反应，并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答，免疫琼脂扩散法检测抗体滴度为1：16。结论：恶性疟原虫GDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

弓形虫GRA7基因在大肠埃希菌中的表达

目的　在大肠埃希菌中表达致密颗粒蛋白(GRA7)。方法　将弓形虫GRA7基因克隆入原核表达载体p GEX- 4 T- 1,构建重组质粒p GEX- 4 T- 1/GRA7并转化大肠埃希菌BL2 1。IPTG体外诱导重组质粒菌的表达,对表达的GRA7融合蛋白进行SDS- PAGE和Western- blotting分析。结果　成功构建了p GEX- 4 T- 1/GRA7重组质粒,该重组质粒在大肠埃希菌中表达了目的蛋白,该蛋白能与抗GST抗体结合。结论　GRA7基因在大肠埃希菌中以GST融合蛋白的形式得到表达。     

刚地弓形虫谷胱苷肽巯基转移酶-醛缩酶融合蛋白的制备及纯化

目的体外制备刚地弓形虫醛缩酶(aldolase)蛋白并纯化。方法以刚地弓形虫cDNA链为模板,聚合酶链反应扩增aldolase基因,克隆至质粒pGEX-4T-1上,转化至大肠杆菌BL21;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,亲和层析纯化表达产物。结果获得了aldolase基因序列,构建了aldolase/pGEX-4T-1原核表达系统,表达并纯化了谷胱苷肽巯基转移酶-醛缩酶(GST-aldolase)融合蛋白。结论体外获得了纯化的GST-aldolase蛋白,为后续的aldolase功能研究奠定了基础。     

表皮生长因子受体胞外区的原核表达和鉴定

目的 克隆表皮生长因子受体(EGFR)胞外区段基因序列(EGFR ECD),构建重组融合表达载体.方法 采用常规PCR方法 扩增EGFR的胞外区DNA序列,并将扩增产物克隆入GST融合表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒pGEX-4T-1/EGFRECD,转化BL21(DE3)宿主菌;采用Sal Ⅰ和Not Ⅰ双酶切和序列分析鉴定插入序列的正确性:并用IPTG诱导工程菌,SDS-PAGE及Western blotting分析融合蛋白的表达.结果 双酶切鉴定表明,EGFR胞外区序列已经正确克隆到GST融合表达载体中,测序结果证实插入DNA序列与EGFR胞外区序列完全一致.SDS-PAGE电泳显示,融合蛋白在BL21(DE3)中以包涵体形式表达,重组融合蛋白GST-EGFRECD的表达量占菌体总蛋白的12%左右.经Western blotting分析证实,重组融合蛋白可以被EGFR特异性抗体所识别.结论 本试验成功克隆了EGFR胞外区DNA序列,构建了融合表达载体,并进行了融合蛋白的诱导表达和鉴定,可进一步用于EGFR功能及免疫学研究.     

A型流感病毒核蛋白原核表达载体的构建与表达

目的:构建A型流感病毒核蛋白(NP)的原核表达质粒,分析其在大肠杆菌中的表达状况.方法:采用逆转录聚合酶链式反应技术从A型流感病毒基因组中扩增出编码核蛋白的基因片段,克隆至pGEM-T Easy载体,PCR筛选阳性克隆并测序.经酶切后将目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL2(CDE3),PCR和酶切鉴定转化菌落.将阳性菌落经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析目的蛋白的表达.结果:RT-PCR扩增出NP基因序列,将其亚克隆至表达载体pGEX-4T-1构建成重组表达质粒,并在BL2(CDE3)中表达了NP融合蛋白.结论:成功构建A型流感病毒NP的重组表达质粒,并在大肠杆菌中表达了NP融合蛋白.     

A型流感病毒株A/Henan/703/2001(H3N2)核蛋白部分序列的原核表达

目的构建A型流感病毒核蛋白（NP）基因部分序列的原核表达质粒。并诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白。方法采用PCB方法扩增NP基因部分序列，并定向插入原核表达载体pGEX-4T-1中。转化大肠杆菌BL21．将阳性菌落经IPTG诱导目的基因融合蛋白的表达。结果扩增到NP基因部分序列，构建成重组表达质粒pGEX—S NP,并在大肠杆菌中进行了表达。结论成功构建A型流感病毒NP部分基因序列的原核表达质粒，并在大肠杆菌中表达了目的基因融合蛋白。