白血病细胞雌激素受体α启动子CpG 岛甲基化状态的实验研究

目的 检测3种白血病细胞Jurkat、Molt-4、HL-60的雌激素受体α(estrogen receptorα,ERα)基因启动子ERα-A、ERα-B CpG岛甲基化状态,初步探讨ERα启动子区的甲基化状态以及与白血病发病机制的可能联系.方法 应用甲基化特异性PCR技术(MSP)检测3种白血病细胞株与正常人外周血单个核细胞ERα启动子区ERα-A 和ERα-B启动子区CpG岛甲基化状态.结果 白血病细胞株ERα-A 和ERα-B均出现甲基化条带,为全甲基化状态;正常人外周血单个核细胞ERα-A 和ERα-B CpG岛呈现非甲基化状态.结论 ERα基因启动子ERα-A 和ERα-B CpG岛的甲基化状态有可能成为白血病新的分子诊断标记物.     

乳腺癌雌激素受体α基因启动子甲基化与其蛋白表达的关系

目的：检测乳腺癌雌激素受体α（estrogen receptor α,ERα）基因启动子区CpG岛甲基化状态,探讨乳腺癌ERα启动子甲基化与其蛋白表达及临床病理的关系。方法：采用免疫组化EnVisionTM二步法检测20例正常乳腺组织、44例乳腺癌组织ERα基因的表达,同时运用甲基化特异性PCR（Methylation-Specific PCR,MSP）及测序法分别检测ERα基因启动子A区和B区CpG岛的甲基化状态。结果：32例ERα阳性乳腺癌组织中,ERα启动子A区、B区甲基化率分别为28.2%和18.8%。12例ERα阴性乳腺癌组织中,ERα启动子A区、B区甲基化率分别为66.7%和58.3%。ERα阳性乳腺癌组、ERα阴性乳腺癌组、乳腺癌组的ERα启动子A、B区甲基化率均较正常组显著增高（P〈0.05）;ERα阴性乳腺癌组的ERα启动子A、B区甲基化率较ERα阳性乳腺癌组均显著增高（P〈0.05）。乳腺癌组织ERα表达与启动子区甲基化之间呈显著负相关。结论：乳腺癌组织ERα基因表达沉默与其启动子A区、B区CpG岛甲基化相关,后者有可能成为乳腺癌预后不良的分子检测指标。     

三氧化二砷对乳癌细胞系MDA-MB-468雌激素受体表达的影响

目的:探讨三氧化二砷(As2O3)对人雌激素受体α(ERα)阴性的乳癌细胞株MDA-MB-468进行药物诱导后ERα启动子CPG岛的甲基化状态及蛋白的变化。方法:常规培养MDA-MB-468细胞,采用MTT法检测0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0mmol/LAs2O3分别处理24、48和72h后细胞的生长抑制率,甲基化特异性PCR检测1.0、2.0、4.0μmol/LAs2O3处理72h后MDA-MB-468细胞ERα启动子CpG岛的甲基化状态,Westernblot检测1.0、2.0、4.0μmol/LAs2O3处理72h后MDA-MB-468细胞ERα蛋白的表达情况。结果:As2O3可抑制MDA-MB-468细胞增殖,其作用呈时间和剂量依赖性(F浓度=375.603,F时间=474.827,P<0.001)。经1.0、2.0、4.0μmol/LAs2O3处理后的MDA-MB-468细胞启动子CpG岛甲基化水平降低,ERα蛋白重新表达。结论:As2O3明显抑制MDA-MB-468增殖,适当浓度As2O3能诱导ERα去甲基化,使ERα阴性的MDA-MB-468细胞恢复表达ERα。     

三苯氧胺诱导乳腺癌细胞凋亡过程中ERα和SMRT的表达变化

目的：观察三苯氧胺（tamoxifen，TAM）作用前后乳腺癌细胞株T-47D和MDA—MB-231中雌激素受体α（estrogenreceptor alpha，ERα）、共抑制因子SMRT的表达变化，寻找更佳的指导乳腺癌内分泌治疗指标。方法：采用四氮甲基唑蓝（MTT）观察乳腺癌细胞T-47D和MDA-MB-231的生存状况，以筛选最佳的药物作用浓度和时间。流式细胞仪法（FCM法）检测细胞凋亡。细胞免疫组化法及Westernblot法观察TAM作用前后细胞中ER-α、SMRT的表达情况。结果：MTT法测得经0．10mmoI／LTAM作用48h后T-47D和MDA-MB-231细胞增殖率下降，与对照组相比有显著性差异（P〈0．05）。特别对T-47D效果更强。FCM法检测两种细胞均出现低于G，期DNA含量的亚二倍体凋亡峰，与MDA-MB-231相比，T-47D细胞株凋亡率更高。细胞免疫组化法及Westernblot法检测T-47D细胞，ERα、SMRT表达阳性，ERα阳性细胞比例减少，SMRT阳性细胞比例增多；MDA-MB-231细胞SMRT阴性，出现少量ER阳性及SMRT阳性细胞。结论：TAM可以通过诱导细胞凋亡途径抑制乳腺癌细胞增殖，对ERα阳性细胞T47D效果更为显著。     

1,25二羟维生素D3靶控VDRE-ERα表达载体对MDA-MB-231细胞周期的影响

目的探讨1,25二羟维生素D1靶控的雌激素受体α表达载体（VDRE—Tk—ERα）对雌激素受体阴性的MDA—MB-231乳腺癌细胞周期进程的影响及其机制。方法利用MTT法检测1,25二羟维生素D,联合他莫两芬对转染VDRE—Tk—ERα表达载体的MDA—MB-231细胞增殖能力的影响,通过流式细胞仪法检测1,25二羟维生素D,联合他莫西芬对转染该表达质粒的MDA—MB-231细胞周期相的分布。用RT—PCR、Westernblot和免疫沉淀法检测细胞Rh及其磷酸化水平、CyclinD1、CDK4的表达以及CyclinD1／CDK4激酶复合物的结合力变化。结果1,25二羟维生素D,联合他莫西芬能够有效抑制转染该质粒的MDA—MB-231细胞的增殖活性并将其细胞周期进程阻遏于G0／G1期。与此同时,CyclinD．的表达则显著降低,其与CDK4的结合力亦显著降低。Rb的表达虽无显著变化,但其磷酸化水平显著下降。结论1,25二羟维生素D3可通过靶控MDA—MB-231细胞内外源性雌激素受体α的表达进而对G．／S期相关分子的表达和活性进行调控从而阻止雌激素受体α阴性的乳腺癌细胞的周期进程并恢复对他莫两芬的化疗敏感性。     

青蒿琥酯对MDA—MB-231细胞增殖抑制作用及其机制

目的探讨青蒿琥酯（artesunate,ART）对乳腺癌雌激素受体阴性细胞MDA—MB-231抑制作用及其机制。方法ART处理细胞3d后,采用MTT比色法检测细胞增殖功能,观察细胞形态、结构的改变,免疫细胞化学检测Bax,nm23,Bcl-2,P21WAF1／CIP1蛋白的表达情况。结果ART作用于乳腺癌细胞MDA—MB-231后,发现其对细胞的抑制作用呈明显浓度依赖性,可导致细胞形态、结构改变;免疫细胞化学结果显示2μmol／L青蒿琥酯作用细胞72h后,药物组同细胞对照组比较,可上调Bax、nm23、P21WAF1／CIP1蛋白表达,差异有统计学意义（P〈0．05）,Bcl-2蛋白质表达差异无统计学意义（P〉0．05）。结论ART有抑制MDA—MB-231细胞增殖的作用,其机制可能与上调Bax、nm23、P21WAF1／CIP1蛋白表达有关。     

白血病细胞雌激素受体多个启动子甲基化的实验研究

目的检测白血病细胞雌激素受体（estrogen receptors,ER）基因启动子区CpG岛甲基化状态情况,探讨雌激素受体基因多个启动子区包括ERα（ERα-A,-B and-C）和ERβ甲基化与其表达异常的联系。方法应用RT—PCR检测6种白血病细胞株以5′-杂氮-2-脱氧胞苷（5′-Aza-Dc）去甲基化前后ER基因表达活性并应用甲基化特异性PCR技术（methylation specific PCR,MSP）检测10例正常人白细胞和6种白血病细胞株以5′-Aza-Dc去甲基化前后ER基因甲基化状态。结果ER各启动子在白血病细胞株中均出现甲基化或半甲基化带,但只有ERα-A基因表达沉默而且在正常人白细胞中呈未甲基化状态,在以5′-Aza-Dc处理细胞株后ERα-A基因表达恢复。结论白血病细胞的雌激素受体基因启动子区存在高甲基化现象并导致其基因表达沉默,可能为白血病的致病机制分析提供了一个新的方向,提示ERα-A基因启动子CPG岛的甲基化有可能成为白血病的新的参考标记物。     

三氧化二砷对人乳腺癌雌激素受体蛋白表达的影响

目的本实验通过三氧化二砷(As2O3)对人雌激素受体-α(estrogen receptor alpha,Erα)阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231进行药物诱导,使其重新表达ERα的可能性及机制。方法用含As2O3终浓度分别为0.5、2.0、4.0μmol/L的1640培养液连续培养MDA-MB-231细胞72 h。以不加药同期培养的231细胞作为阴性对照,以MCF-7为阳性对照。分别用Western blot和免疫组化法检测ERα蛋白的重新表达情况。结果①Western blot检测结果证实经2.0、4.0μmol/LAs2O3处理的MDA-MB-231细胞组在相对分子质量66 000处显示出ERα蛋白带。②免疫组织化学结果显示:0.5μmol/L组阳性染色细胞<10%,与阴性对照组比较差异无统计学意义(P=0.064);2.0μmol/L组阳性染色细胞>70%,与阴性对照组比较差异有统计学意义(P=0.001);4.0μmol/L组阳性染色细胞>40%,与阴性对照组比较差异有统计学意义(P=0.03)。结论适当浓度As2O3能诱导ERα蛋白表达,可以使雌激素受体阴性的乳腺癌细胞重新表达雌激素受体。     

Cx43基因启动子甲基化下调乳腺癌Cx43的表达

目的：探讨乳腺癌细胞中Cx43蛋白的表达与基因启动子甲基化的关系。方法：免疫组化检测乳腺标本中Cx43蛋白的表达,甲基化PCR检测Cx43启动子甲基化的频度。5-氮杂脱氧胞苷培养乳腺癌MD-MBA-231细胞后,RT-PCR乳腺癌细胞中Cx43 mRNA,免疫组化、Western Blot检测Cx43蛋白表达,甲基化PCR检测启动子甲基化的变化。结果：与正常乳腺组织相比,乳腺癌中Cx43蛋白的表达下调,启动子甲基化频度高。在应用5-Aza-dC处理前,MD-MBA-231 Cx43基因呈甲基化状态,经4.0μmol/L的5-Aza-dC作用48h后,乳腺癌细胞Cx43基因甲基化逆转,Cx43基因mRNA及蛋白表达增加。结论：Cx43在乳腺癌组织中表达下调可能与启动子甲基化有关。5-Aza-dC能逆转乳腺癌细胞MD-MBA-231的Cx43基因异常甲基化,促进Cx43基因的再表达。     

芹菜素抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞血管内皮生长因子表达

目的 研究芹菜素对人乳腺癌MDA—MB-231细胞血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）表达的影响。方法 采用MTT法检测芹菜素（apigenin）对乳腺癌细胞增殖的影响；应用酶联免疫吸附法检测VEGF在MDA—MB-231细胞中的分泌水平；应用RT-PCR法检测MDA—MB-231细胞中VEGF mRNA的表达水平；应用蛋白质印迹方法检测芹菜素对MDA—MB-231细胞中HIF-α，p-AKT，p—ERK1／2，P53表达的时间依赖性和剂量依赖性效应。结果 芹菜素对MDA-MB-231细胞没有明显增殖抑制效应。芹菜素能够抑制MDA—MB-231细胞分泌VEGF，并且降低VEGF mRNA的表达水平。同时，芹菜素抑制了MDA—MB-231细胞中HIF-1α，p-AKT的表达，诱导P53的表达，而对p-ERK1／2的表达没有影响。结论 芹菜素能够抑制人乳腺癌细胞VEGF的表达，这种效应可能通过降低HIF-1α的表达来实现。     

5-氮杂-2′-脱氧胞苷逆转RASSF1A基因甲基化对人乳腺癌MCF-7细胞的影响

目的：探讨启动子甲基化对乳腺癌MCF-7细胞RASSF1A基因的作用及5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）干预对启动子甲基化的影响,为临床治疗乳腺癌奠定理论基础.方法：用1,3,5,7,9μmol/L不同浓度的5-Aza-CdR处理MCF-7乳腺癌细胞株,通过MTT检测5-Aza-CdR对MCF-7乳腺癌细胞株存活率的影响;建立5μmol/L,10μmol/L的浓度梯度流式细胞仪检测5-Aza-CdR对MCF-7乳腺癌细胞株生长周期及凋亡率的影响,MSP（甲基化PCR）检测5-Aza-CdR处理前后RASFF1A抑癌基因的甲基化状态,RT-PCR检测处理前后抑癌基因RASSF1A mRNA表达情况.结果：5-Aza-CdR抑制体外培养的人乳腺癌MCF-7细胞,诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡和细胞周期停滞在G0/G1期,呈浓度依赖性.经5-Aza-CdR处理人乳腺癌MCF-7细胞后,MSP检测RASSF1A基因发生了甲基化,RT-PCR检测RASSF1A mRNA恢复了表达.结论：RASSF1A基因启动子甲基化是导致其失活的主要原因,5-Aza-CdR可以逆转乳腺癌细胞株MCF-7细胞RASSF1A基因启动子甲基化状态,使其重新表达．     

葛根素影响雌激素受体α启动子甲基化调控成骨细胞增殖分化的研究

目的：探究葛根素对大鼠成骨细胞代谢调控的途径,为绝经后骨质疏松治疗提供理论依据。方法取新生 SD 大鼠的颅骨,胶原酶法培养成骨细胞,分别加入不同浓度（5、10、25、50、100μmol／L）葛根素分组培养,应用巢式甲基敏感性聚合酶链反应方法观察雌激素受体α（estrogen receptorα,ERα）启动子 A 区甲基化,反转录－聚合酶链反应方法观察 ERαmRNA 表达,MTT 法和对硝基苯磷酸酯方法观察体外培养成骨细胞的增殖及碱性磷酸酶活性。结果随着葛根素浓度增加,ERα基因启动子甲基化程度逐渐减弱;同时发现细胞中 ERα mRNA 表达逐渐增强,25μmol／L葛根素浓度时表达最强（P ＜0．01）。葛根素能刺激成骨细胞增殖,提高碱性磷酸酶活性（P ＜0．01）。结论葛根素抑制 ERα启动子甲基化及增加 ERαmRNA 表达,可能通过此途径促进成骨细胞增殖分化。     

木犀草素通过逆转OPCML基因甲基化抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖

目的 观察木犀草素对MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖以及对OPCML基因表达的影响。方法 体外培养MDA-MB-231细 胞,加入终浓度为0（对照组）以及5、10和20 μmol/L的木犀草素处理孵育24 h或48 h后,MTT法检测细胞的增殖,流式细胞术检测细胞凋亡;并提取胞内总mRNA和蛋白,以实时定量PCR和Western blot检测OPCML的mRNA及蛋白变化;同时采用甲基化特异性PCR（MSP）检测OPCML启动子区域的甲基化水平,并分析细胞内甲基化酶的活性。结果 MTT结果显示,MDAMB-231细胞经5、10 以及20 μmol/L木犀草素孵育24 h后,随着浓度的递增,细胞活性逐渐降低（P<0.05）。流式细胞术结果也显示,不同浓度木犀草素可不同程度诱导MDA-MB-231细胞凋亡（P<0.05）。此外,木犀草素能以剂量依赖性方式诱导MDAMB-231细胞表达OPCML mRNA和蛋白（P<0.05）。MSP结果也显示,木犀草素可显著下调OPCML启动子的甲基化状态,上调非甲基化OPCML的水平,并能降低细胞内甲基化酶的活性（P<0.05）。结论 木犀草素可抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的增殖,其机制可能与影响OPCML基因的表达以及甲基化水平有关。     

HCC患者GSTP1基因启动子区CpG岛甲基化状态研究

目的 检测人原发性肝癌（HCC）中抑癌基因GSTP1的启动子区CpG岛甲基化的状况，并探讨其在肝癌发生中的作用。方法 以已知的GSTP1基因启动子区CpG岛甲基化阳性的乳腺癌细胞株MCF-7为阳性对照，以11例正常人外周血单核细胞（PBMC）DNA为阴性对照，用甲基化特异性PCR（MSP）的方法对26例肝细胞癌患者的癌、远癌组织中GSTP1基因启动子区CpG岛甲基化的状态进行检测。结果 在26例原发性肝癌中GSTP1基因启动子区CpG岛甲基化在癌组织为88％（23／26），在远癌组织中为69％（18／26）；而在11例正常人外周血单核细胞均为甲基化阴性。结论 抑癌基因GSTP1基因启动子区CpG岛高甲基化可能是肝癌发生早期的分子事件，在人原发性肝癌的发生发展中具有重要的作用。     

ER-α36基因沉默对ER阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的作用及其影响

目的：探讨ER-α36基因与人雌激素受体（ ER）阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的内在联系。观察其对ER阴性乳腺癌细胞的影响。为探索ER阴性乳腺癌的基因治疗提供新的途径。方法利用RNAi技术,构建靶向ER-α36基因的短发夹状RNA（shRNA）重组质粒,脂质体法将pRNAT-U6.1/Neo-ER-α36导入雌激素受体阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231,利用RT-PCR法检测MDA-MB-231细胞ER-α36基因表达的抑制情况;MTT法检测雌激素受体阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖情况。结果①PCR、酶切鉴定、DNA测序证实小干扰质粒构建成功,无碱基突变;②ER-α36-siRNA表达载体转染ER阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231可有效抑制ER-α36 mRNA表达（抑制效率＝86.3％）,P＜0.01;③MTT实验结果表明ER-α36沉默可有效抑制ER阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖,提示ER-α36参与MAPK/ERK信号转导通路调节细胞增殖。结论 ER-α36参与MAPK/ERK信号转导途径,与ER阴性乳腺癌的发生、发展关系密切。RNAi有效沉默ER-α36基因是ER阴性乳腺癌基因治疗的有效手段。ER-α36可能成为ER阴性乳腺癌基因治疗的新靶点。     

姜黄素对人乳腺癌细胞增殖的抑制效应及机制

目的 研究姜黄素对人乳腺癌细胞株增殖的抑制效应及其机制。方法 采用Northern印迹和Western印迹法观察人乳腺癌细胞mRNA及其蛋白表达;用CAT报告基因来研究人雌激素反应元件(ERE)的转录活性;用Matrigd侵袭池(Matrigel invasion chamber)研究细胞侵袭性。结果 姜黄素能够抑制雌激素受体(ER)阳性MCF—7及ER阴性MDA—MB—231两种人乳腺癌细胞的增殖。对MCF—7细胞,姜黄素调节ER下调基因pS2和TGF—α的表达及ERE的活性;对MDA—MB—231乳腺癌细胞,姜黄素通过下调MMP—2和上调TIMP—1的活性表现出很强的抗侵袭活性,其还能够抑制MDA—MB—231细胞两个主要的血管生成因子VEGF和b—FGF、在转录水平的表达。结论 姜黄素通过多种机制抑制乳腺癌细胞的生长,姜黄素的化学预防是多途径作用的结果。     

钙信号对乳腺癌细胞HIF-1α表达及侵袭转移能力的影响

目的：探讨低氧条件下钙信号对乳腺癌细胞HIF-1α表达及其侵袭转移能力的影响．方法：在培养基中加入150μmol/L CoCl2模拟化学缺氧;将实验分成对照组、CoCl2组、CoCl2和钙通道阻滞剂维拉帕米（verapamil,VPL）组．用逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）检测各组中HIF-1α的mRNA水平;蛋白印迹实验和免疫细胞化学检测乳腺癌细胞MCF-7和MDA—MB-231中HIF-1α蛋白的表达;Millicell小室人工重组基底膜侵袭迁移实验检测各实验组中细胞侵袭迁移能力的改变．结果：两株细胞各实验组都存在HIF-1α的mRNA转录和蛋白的表达,CoCl2组HIF-1α mRNA水平和蛋白水平较对照组显著增高（P〈0．01）,加VPL干预后,HIF-1α mRNA水平和蛋白水平都大大降低（P〈0．01）,MCF-7和MDA—MB-231间有显著差异（P〈0．01）;两株细胞的侵袭迁移能力VPL＋CoCl2组较CoCl2组明显降低（P〈0．05）,MDA—MB-231更明显（P〈0．01）．结论：阻断钙信号转导途径可以使HIF-1α的表达下调,进而抑制乳腺癌细胞的侵袭转移能力．     

肼苯哒嗪对宫颈癌细胞系APC基因去甲基化的转录调节作用

目的:观察宫颈癌细胞系HeLa、CaSki和SiHa中APC基因的表达与甲基化修饰之间的相关性,探讨肼苯哒嗪对APC基因去甲基化的转录调节作用及其对细胞生长和凋亡的影响。方法:应用甲基化特异性PCR(MSP)法分析细胞中APC的甲基化状态;采用RT-PCR及FQ-PCR检测肼苯哒嗪对APC mRNA表达的影响;MTT法及流式细胞术观察肼苯哒嗪对细胞增殖及凋亡的影响;采用免疫组化SP法检测肼苯哒嗪对APC相关蛋白β-连环蛋白表达的影响。结果:APC基因在HeLa、CaSki细胞中有甲基化修饰;肼苯哒嗪能使其甲基化的APC基因重新表达;β-连环蛋白也可重新表达于细胞膜;肼苯哒嗪能抑制细胞生长,使细胞凋亡增多。结论:APC甲基化修饰是宫颈癌发生重要机制之一,肼苯哒嗪能使甲基化的APC去除甲基化修饰重新表达,且能抑制宫颈癌细胞生长。     

RNA干扰下调midkine基因表达对人乳腺癌细胞粘附和侵袭力的影响

目的探讨中期因子（midkine,MK）基因siRNA对乳腺癌细胞生物学行为的影响。方法培养人乳腺癌Bcap-37、LCC1、MCF-7、MDA—MB-231、MDA—MB-435、MDA—MB-468及ZR75—1细胞株,以荧光实时定量PCR方法检测MK基因mRNA表达;筛选出MK表达最高者。采用MK siRNA转染乳腺癌细胞株,分别以荧光实时定量RT—PCR和免疫荧光方法观察MK基因mRNA和蛋白水平,然后以四唑蓝（MTT）比色法检测细胞粘附性,以Boyden小室方法检测癌细胞侵袭能力。结果7株乳腺癌细胞中,MK均有不同程度的表达,以MCF-7细胞最高;以MKsiRNA转染乳腺癌MCF-7细胞后,癌细胞MK基因mRNA和蛋白水平明显下降,且呈浓度依赖性;siRNA转染组细胞粘附数量明显下降,细胞侵袭力明显下降,均呈浓度依赖性（P〈0．01;P〈0．01）。结论MK基因在乳腺癌细胞粘附和侵袭中发挥着重要作用;以siRNA转染乳腺癌细胞,可抑制乳腺癌细胞粘附和侵袭能力。